Artículo de método

Mapeo cerebral de resonancia magnética funcional en tiempo real en animales

DOI:

10.3791/61463

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24 de septiembre de 2020

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1Max Planck Institute for Biological Cybernetics, 2Graduate Training Centre of Neuroscience, 3MGH/MIT/HMS Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 4Bruker BioSpin

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El mapeo funcional del cerebro animal puede beneficiarse de la configuración experimental de imágenes de resonancia magnética funcional (fMRI) en tiempo real. Utilizando el último software implementado en el sistema de resonancia magnética animal, establecimos una plataforma de monitoreo en tiempo real para fMRI de animales pequeños.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las respuestas dinámicas de fMRI varían en gran medida de acuerdo con las condiciones fisiológicas de los animales, ya sea bajo anestesia o en estados despiertos. Desarrollamos una plataforma de resonancia magnética funcional en tiempo real para guiar a los experimentadores a monitorear las respuestas de resonancia magnética funcional instantáneamente durante la adquisición, que se puede utilizar para modificar la fisiología de los animales para lograr las respuestas hemodinámicas deseadas en los cerebros de los animales. La configuración de fMRI en tiempo real se basa en un sistema de resonancia magnética preclínica de 14.1T, lo que permite el mapeo en tiempo real de las respuestas dinámicas de fMRI en la corteza somatosensorial primaria de la pata anterior (FP-S1) de ratas anestesiadas. En lugar de un análisis retrospectivo para investigar las fuentes de confusión que conducen a la variabilidad de las señales de fMRI, la plataforma fMRI en tiempo real proporciona un esquema más efectivo para identificar respuestas dinámicas de fMRI utilizando macrofunciones personalizadas y un software de análisis de neuroimagen común en el sistema de MRI. Además, proporciona una viabilidad inmediata de solución de problemas y un paradigma de estimulación de biorretroalimentación en tiempo real para estudios funcionales cerebrales en animales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La resonancia magnética funcional (fMRI) es un método no invasivo para medir las respuestas hemodinámicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9, por ejemplo, la señal de flujo y volumen sanguíneo dependiente del nivel de oxígeno en sangre (BOLD), asociada con la actividad neuronal en el cerebro. En estudios con animales, las señales hemodinámicas pueden ser afectadas por la anestesia 10, el nivel de estrés de animales despiertos11, así como los posibles artefactos no fisiológicos, por ejemplo, pulsaciones cardíacas y movimientos respiratorios12,13,14,15. Aunque se han desarrollado muchos métodos de posprocesamiento para proporcionar un análisis retrospectivo de la señal de fMRI para la dinámica funcional relacionada con la tarea y el estado de reposo y el mapeo de conectividad16,17,18,19, existen pocas técnicas para proporcionar una solución de mapeo de la función cerebral en tiempo real y lecturas instantáneas en el cerebro animal 20 (la mayoría de las cuales se utilizan principalmente para el mapeo del cerebro humano 21, 22,23,24,25,26,27). En particular, este tipo de método de mapeo de fMRI en tiempo real falta en los estudios con animales. Es necesario establecer una plataforma de resonancia magnética funcional para permitir la investigación de las etapas fisiológicas dependientes del estado cerebral en tiempo real y proporcionar un paradigma de estimulación de biorretroalimentación en tiempo real para estudios funcionales del cerebro animal.

En el presente trabajo, ilustramos una configuración experimental de fMRI en tiempo real con las macrofunciones personalizadas del software de consola de MRI, demostrando el monitoreo en tiempo real de las respuestas evocadas BOLD-fMRI en la corteza somatosensorial de la pata anterior primaria (FP-S1) de las ratas anestesiadas. Esta configuración en tiempo real permite la visualización de la activación cerebral en curso en mapas funcionales, así como cursos de tiempo individuales de una manera voxel-wise, utilizando el software de análisis de neuroimagen existente, Análisis de NeuroImágenes Funcionales (AFNI)28. La preparación de la configuración experimental de fMRI en tiempo real para el estudio en animales se describe en el protocolo. Además de la configuración del animal, proporcionamos procedimientos detallados para configurar la visualización y el análisis de las señales de fMRI en tiempo real utilizando el último software de consola en paralelo con los scripts de procesamiento de imágenes. En resumen, la configuración de fMRI en tiempo real propuesta para estudios en animales es una herramienta poderosa para monitorear las señales dinámicas de fMRI en el cerebro animal utilizando el sistema de consola de MRI.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio se realizó de acuerdo con la Ley Alemana de Bienestar Animal (TierSchG) y la Ordenanza de Animales de Laboratorio de Bienestar Animal (TierSchVersV). El protocolo experimental descrito aquí fue revisado por la comisión de ética (§15 TierSchG) y aprobado por la autoridad estatal (Regierungspräsidium, Tübingen, Baden-Württemberg, Alemania).

1. Preparación de la configuración experimental BOLD-fMRI para el estudio de animales pequeños

  1. Encienda el software de la consola para controlar los parámetros de imagen y adquirir datos de resonancia magnética.
    NOTA: La configuración de fMRI en tiempo real propuesta se implementa utilizando macrofunciones del software de la consola (versión 6) en paralelo con las funciones de procesamiento de imágenes de AFNI.
  2. Busque secuencias de RM (es decir, posición, localizador, adquisición rápida con mejora de la relajación (RARE) e imágenes ecoplanares 3D (EPI) con el explorador del espacio de trabajo y, a continuación, arrástrelas y agréguelas a la lista de escaneo.
    NOTA: Las secuencias de posición y localizador se utilizan para identificar una región de interés (ROI) en un cerebro. Una secuencia RARE se utiliza para una exploración de anatomía. Se utiliza una secuencia 3D EPI para medir las respuestas BOLD dinámicas.
  3. Coloque los scripts de macro predefinidos, "Setup_rt3DEPI" y "Feed2AFNI_rt3DEPI" en la ruta del script de macro (por ejemplo, "/opt/(versión PV)/prog/curdir/(nombre de usuario)/ParaVision/macros"). Active las opciones de reconstrucción 3D EPI, "Pre Image Series Activities" y "Execute Macro" en el menú de la interfaz de usuario "Data Reconstruction", y luego vincule el script de macro predefinido, "Setup_rt3DEPI", antes de hacer clic en el botón "Scan".
    Nota: Las secuencias de comandos de macro se incluyen en los archivos suplementarios.
  4. Instale el software AFNI para el análisis y la visualización BOLD-fMRI en tiempo real.

2. Cateterismo y cirugía de ventilación

  1. Configure un ventilador y sistemas de monitoreo del estado fisiológico, como termómetro, presión arterial y registro de la respiración, como se muestra en la Figura 1. Ajuste una frecuencia constante de 60 ± 1 respiración/min con el ventilador y una temperatura de 37 °C utilizando una almohadilla térmica compatible con MR con un equipo de control de retroalimentación.
  2. Anestesiar a una rata Sprague-Dawley macho adulta (300-600 g) en una cámara con isoflurano al 5% para la inducción y administrar isoflurano al 2-2,5% para la cirugía de un vaporizador. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando la pata trasera y confirmando la falta de una respuesta de abstinencia.
  3. Intubar al animal con una cánula de plástico de 14 G para ventilación (60 ± 1 respiración/min con una mezcla de 70% de aire y 30% de oxígeno). Ajuste el dióxido de carbono (CO2) al final de la marea para que esté en el rango de 25 ± 5 mmHg29.
    NOTA: La intubación es crítica para mantener los niveles adecuados deCO2 a través de experimentos de resonancia magnética funcional.
  4. Coloque al animal en posición supina en una mesa de cirugía y afeite un muslo con una máquina de afeitar eléctrica. Y luego, haga una incisión en la piel afeitada con tijeras quirúrgicas.
    NOTA: La longitud de la incisión es de alrededor de 1-2 cm en dirección longitudinal.
  5. Encuentre una arteria y vena femoral debajo de la región incisa para el cateterismo y separe la arteria femoral individual y la vena de los tejidos circundantes.
  6. Sujete un lado de la arteria femoral separada con una sutura quirúrgica y sostenga el otro lado con pinzas micro bulldog. Luego, haga una pequeña incisión entre las regiones atadas en la arteria femoral.
  7. Inserte un catéter en la arteria femoral a través de la pequeña incisión y ate el catéter y la arteria junto con suturas quirúrgicas. Controle la presión arterial constantemente con el sistema de monitoreo fisiológico para estar en el rango de 80-120 mmHg y mida la gasometría arterial regularmente para mantener elpO2 de mínimo 90 mmHg y pCO2 de 30-45 mmHg durante la exploración.
    NOTA: Este cateterismo es crítico para monitorear la presión arterial durante los experimentos de fMRI.
  8. Sujete ambos extremos de la vena femoral con suturas quirúrgicas trenzadas de seda. Luego, haga una pequeña incisión entre las regiones atadas en la vena femoral. Use fórceps para realizar la sutura.
    NOTA: El tamaño de la sutura es de alrededor de 1-2 cm.
  9. Inserte un catéter en la vena femoral. Ate el catéter y la vena junto con suturas quirúrgicas.
    NOTA: Este cateterismo es crítico para administrar alfa-cloralosa a través de la vena y ajustar los niveles de anestesia durante los experimentos de fMRI. Si el animal no está bien anestesiado, comenzará a respirar espontáneamente. En este caso, se debe administrar más alfa-cloralosa para evitar artefactos de movimiento respiratorio.
  10. Sutura la incisión quirúrgica en la piel afeitada. Una vez completados los procedimientos quirúrgicos, mantener al animal anestesiado infundiendo un bolo de alfa-cloralosa con la dosis de ~ 80 mg / kg a través del catéter conectado a la vena femoral y detener la administración de isoflurano al mismo tiempo.

3. Colocar al animal dentro del escáner de resonancia magnética

  1. Transfiera el animal anestesiado al escáner de resonancia magnética tan pronto como termine el paso 2.10 y asegúrelo en una cuna hecha a medida.
  2. Inserte un termómetro rectal de retroalimentación en tiempo real en el animal para controlar la temperatura del animal. Coloque una almohadilla térmica debajo del torso del animal para controlar la temperatura. Mantenga la temperatura corporal a 37,0 ± 0,5 °C durante las resonancias magnéticas.
  3. Administre alfa-cloralosa con ~ 25 mg / kg / h solución en una mezcla de pancuronio (~ 2 mg / kg / h), un relajante muscular, continuamente mientras mantiene al animal anestesiado y reduce los artefactos de movimiento en imágenes de resonancia magnética funcional. Controle la presión arterial y la respiración ajustando la cantidad de medicamento y la tasa de ventilación de acuerdo con el estado fisiológico.
  4. Administrar ungüento oftálmico en los ojos del animal para evitar la sequedad durante los experimentos de fMRI. Fije la cabeza del animal de forma segura con dos barras para los oídos para evitar artefactos de movimiento de la cabeza.
  5. Fije una bobina de superficie del transceptor en la cabeza. Sintonice y haga coincidir la bobina con la frecuencia de Larmor (por ejemplo, 599 MHz en 14.1 T) en la cabeza antes de las mediciones de resonancia magnética.
    NOTA: Aquí, la bobina de 22 mm de diámetro se utiliza para cubrir todo el cerebro de una rata.
  6. Inserte un par de electrodos de aguja en la piel de la pata delantera entre los dígitos 1 y 4 y fíjelos con cinta quirúrgica. Y luego, confirme que la estimulación funciona correctamente después de conectar un cable de entrada de estimulación a estos electrodos30.
  7. Inserte el animal en el orificio de resonancia magnética y colóquelo en el isocentro aproximadamente.

4. Medición de imágenes anatómicas de RM

  1. Haga clic en el botón del menú de calibración en la interfaz de usuario principal. Realice las calibraciones del sistema de resonancia magnética haciendo clic en los siguientes elementos de la interfaz de usuario de la plataforma de ajuste (consulte el menú Ayuda del software de la consola): Encuentre la frecuencia de resonancia básica, Calibre la potencia de pulso de RF, Establezca la ganancia óptima del receptor, Mida el mapa B0 en el animal para shimming, Ejecute cuñas lineales globales basadas en la integral de desintegración por inducción libre (FID) no localizada.
    NOTA: Este paso tarda menos de 2 minutos.
  2. Ejecute una secuencia de posición haciendo clic en el botón "Escanear" para encontrar la ubicación de la cabeza del animal dentro del orificio de resonancia magnética. Si el cabezal no está situado en el isocentro, ajuste la ubicación del cabezal mientras mueve la base hacia adelante y hacia atrás hasta que el cabezal quede situado en el isocentro.
  3. Ejecute una secuencia de Localizer haciendo clic en el botón "Escanear" para identificar un ROI en la cabeza. Seleccione Map Shim y defina el ROI del volumen de corrección para cubrir todo el cerebro en la imagen del localizador y luego, ejecute un shimming de orden alto (por ejemplo,2º o3º orden) utilizando la opción "Shim hasta" para reducir las inhomogeneidades del campo magnético principal (B0) en el ROI.
    NOTA: El shimming de orden alto es un paso crítico para mejorar la calidad de los datos BOLD-fMRI cuando se utilizan secuencias EPI.
  4. Ejecute una secuencia RARE ponderada en T2 haciendo clic en el botón "Escanear" para adquirir imágenes anatómicas que cubran todo el cerebro en una vista coronal (por ejemplo, se utilizan los siguientes parámetros de secuencia: tiempo de repetición (TR) 4000 ms, tiempo de eco efectivo (TE) 36.1 ms, matriz 128 x 128, campo de visión (FOV) 19.2x19.2 mm2, número de cortes 32, grosor de corte 0.3 mm, FACTOR RARE 8).
    NOTA: En el siguiente paso de visualización de fMRI en tiempo real, las imágenes anatómicas se utilizan para registrar imágenes EPI 3D como plantilla.

5. Configuración del software fMRI en tiempo real y visualización de la respuesta fMRI

  1. Abra una ventana de terminal y vaya a la ruta del complemento AFNI en tiempo real usando el siguiente comando:
    cd /home/(nombre de usuario)/rt_afni
    NOTA: El script del complemento AFNI, "afni_rt" se incluye en los archivos suplementarios.
  2. Ejecute el software AFNI con el complemento en tiempo real utilizando el comando y las opciones a continuación.
    AFNI -RT
    -yestplugouts
    -DAFNI_REALTIME_MP_HOST_PORT=localhost:(número de puerto)
    -DAFNI_REALTIME_Graph=Tiempo real
    -DAFNI_FIM_IDEAL=(Paradigma)
    NOTA: En el primer caso, el código permite que los programas externos intercambien datos con AFNI, mientras que en el segundo caso, el complemento en tiempo real intentará abrir un socket TCP al host local y al puerto definidos por el usuario. En el tercer y cuarto caso, los códigos trazarán el curso temporal de los datos de fMRI en tiempo real y trazarán el curso de tiempo del paradigma definido por el usuario en el curso de tiempo de fMRI, respectivamente, cuando se adquieren datos de fMRI en tiempo real. Para más detalles, consulte https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/README.environment.html.
  3. Supervise los próximos archivos AFNI BRIK definidos mediante el comando "Dimon" como se muestra en la Figura 2 con las siguientes opciones:
    Dimon -tr (TR de EPI) -nt (NRepeticiones de EPI)
    -rt -quit
    -infile_pattern en tiempo real*. BRIK
    -file_type AFNI
    NOTA: "Dimon" es un comando para monitorear la adquisición en tiempo real de archivos de imagen AFNI utilizando las siguientes opciones: "-rt" que ejecuta el complemento en tiempo real y "-infile_pattern (nombre de datos). BRIK -file_type AFNI" que permite al plugin leer los archivos BRIK específicos y enviarlos a AFNI para su visualización y formato. Para más detalles, consulte https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/Dimon.html.
  4. Utilice el comando "pvcmd" con las siguientes opciones:
    pvcmd -a JMacroManager JMMExecuteMacro -category $USER -macro Feed2AFNI_rt3DEPI
    NOTA: Este código existe en el script de macro, "Setup_rt3DEPI", para ejecutar el script de macro de fondo, "Feed2AFNI_rt3DEPI", justo después de hacer clic en el botón "Escanear" para la adquisición de EPI.
  5. Utilice el comando "exec pvcmd" con las siguientes opciones para obtener los parámetros de adquisición de EPI.
    exec pvcmd -a ParxServer -r ParamGetValue -psid $ParSpaceId -param (parámetros PVM de EPI) -id 10 -args $AcqKey $ParSpaceId $ProcnoPath
  6. Utilice el comando "exec to3d" con las siguientes opciones para convertir datos sin procesar EPI a archivos AFNI en tiempo real en el script de macro en segundo plano, "Feed2AFNI_rt3DEPI".
    exec to3d -omri -xFOV $FOV_X -yFOV $FOV_Y -zFOV $FOV_Z -prefix $LastVolName $ImgFormat$Path2dseq
  7. Asegúrese de que la información geométrica EPI es coherente con la orientación de la anatomía.
    NOTA: El comando AFNI "to3d" se ejecutará automáticamente con la información geométrica, como el campo de visión (FOV) y el tamaño de la matriz para convertir los datos sin procesar de fMRI en un dato AFNI BRIK cada vez que cada dato de volumen 3D se almacene después de cada TR como se muestra en la Figura 2. La orientación de la imagen se puede cambiar con los parámetros de información geométrica de "to3d". Para más detalles, consulte https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/to3d.html.
  8. Encienda un aislador de estímulo eléctrico y realice una estimulación eléctrica de la pata delantera para un estudio de fMRI evocado (por ejemplo, 3Hz, 4s ancho de pulso 300us, 2.5mA) usando bloques de estimulación.
    NOTA: Aquí, el paradigma de diseño de bloques consta de 10 exploraciones de preestimulación, 3 exploraciones de estimulación y 12 exploraciones de interestimulación (15 exploraciones por época).
  9. Ejecute una secuencia EPI 3D ponderada en T2* haciendo clic en el botón "Scan" para el estudio BOLD-fMRI (por ejemplo, se utilizan los siguientes parámetros: TR/TE 1500/14 ms, matriz 64 x 64 x 32, FOV 19.2 x 19.2 x 9.6 mm 3 y resolución 300 x 300 x 300 μm3).
    NOTA: Tan pronto como haga clic en el botón "Escanear", el monitoreo y procesamiento de datos sin procesar se realizará utilizando los scripts de macro predefinidos en tiempo real. Una vez que se convierte un conjunto de datos AFNI BRIK, los gráficos de curso de tiempo de vóxel para imágenes EPI 3D se muestran en el software AFNI y se actualizan automáticamente para cada TR.
  10. Para superponer las imágenes EPI sobre las imágenes RARE anatómicas, convierta las imágenes RARE a un conjunto de datos AFNI BRIK utilizando el comando "to3d" como en el paso 5.6, luego registre las imágenes EPI en las imágenes anatómicas usando el script AFNI "align_epi_anat.py" con las siguientes opciones:
    align_epi_anat.py -anat anatomy_template_al+orig -epi epi.$(número de datos epi)+orig -epi_base 1 -sufijo _volreg -rat_align -cost lpa -epi2anat
    NOTA: Para obtener más detalles, consulte https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/ align_epi_anat.py.html.
  11. Para procesar mapas funcionales de las respuestas BOLD, calcule la deconvolución del conjunto de datos 3D+time con una serie temporal de estímulo específica utilizando el comando "3dDeconvolve" con las siguientes opciones:
    3dDeconvolve -input (nombre del archivo de entrada)+orig. -nfirst 0 -polort 3 -num_stimts 1 -stim_times 1 (nombre de archivo del paradigma de estimulación) 'BLOCK(4,1)' -stim_label 1 forepaw -tout -fout -rout
    NOTA: Los pasos de procesamiento de imágenes, como el suavizado espacial o el filtrado temporal, se han incorporado en un script de procesamiento de datos AFNI personalizado. Para más detalles, consulte https://afni.nimh.nih.gov/afni/doc/help/3dDeconvolve.html.
  12. Para visualizar mapas funcionales de las señales BOLD, utilice una agrupación interactiva en el software AFNI. Abra la opción "Definir superposición" y utilice la función "Clusters" del menú de la interfaz de usuario de AFNI.
  13. Después de la última resonancia magnética funcional, saque al animal del escáner de resonancia magnética y eutanasia de acuerdo con los protocolos aprobados.
    NOTA: Las funciones de procesamiento de imágenes de AFNI y las funciones macro en el software de consola más reciente se utilizaron para procesar los datos de fMRI en tiempo real. Puede encontrar información detallada y descripciones de las macrofunciones en el menú de ayuda del software de la consola. El software AFNI es un programa gratuito, que se puede descargar directamente a través del sitio web de NIMH-AFNI. Se adjuntan los scripts relacionados para crear la vinculación entre AFNI y el sistema de consola.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Figura 3 y la Figura 4 muestran un curso de tiempo representativo de BOLD-fMRI en tiempo real y mapas funcionales con estimulación eléctrica de la pata delantera (3 Hz, 4 s, ancho de pulso 300 us, 2.5 mA). El paradigma de diseño de fMRI comprende 10 exploraciones de preestimulación, 3 exploraciones de estimulación y 12 exploraciones de interestimulación con un total de 8 épocas (130 exploraciones). El tiempo total de escaneo es de 3 min 15 seg (195 seg).

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El monitoreo en tiempo real de la señal de fMRI ayuda a los experimentadores a ajustar la fisiología de los animales para optimizar el mapeo funcional. Los artefactos de movimiento en animales despiertos, así como el efecto anestésico, son factores importantes que median la variabilidad de las señales de fMRI, confundiendo la interpretación biológica de la señal por sí misma 31,32,33,34,35,36,37,38 <...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sascha Köhler es empleado de Bruker BioSpin MRI GmbH.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. D. Chen y al Dr. C. Yen por compartir el script AFNI para configurar la fMRI en tiempo real para PV 5 y al equipo de AFNI por el soporte del software. Esta investigación fue apoyada por la financiación de la Iniciativa Cerebral de los NIH (RF1NS113278-01, R01 MH111438-01), y la subvención del instrumento S10 (S10 RR023009-01) al Centro Martinos, la Fundación Alemana de Investigación (DFG) Yu215/3-1, BMBF 01GQ1702 y la financiación interna de la Sociedad Max Planck.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
14.1T Sistema de resonancia magnética BrukerBioSpin MRI GmbHN/A
A365 Aislador de estímulosWorld Precision InstrumentsN/A
AcqKnowledge SoftwareBiopacRRID:SCR_014279, http://www.biopac.com/product/acqknowledge-software/
AFNICox, 1996RRID:SCR_005927, http://afni.nimh.nih.gov
CO2SMO ( Monitor ETCO2/SpO2), Modelo 7100Novametrix Medical Systems IncN/A
IsofluranoCP-PharmaCat# 1214
Master-9A.M.P.IN/A
Inyector de nanolitrosWorld Precision InstrumentsCat# NANOFIL
Bromuro de pancuronioInresa ArzneimittelCat# 34409.00.00
ParaVision 6Bruker BioSpin MRI GmbHRRID:SCR_001964
solución salina tamponada con fosfato (PBS)GibcoCat# 10010-023
Rata: Rata Sprague DawleyCharles River LaboratoriesCrl:CD(SD)
SAR-830/AP VentiladorCWEN/A
α-cloalasaSigma-AldrichCat# C0128-25G; RIDO

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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