Análisis del metabolismo celular natural humano

Resumen

En este artículo, describimos un método para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en células humanas primarias de Asesino Natural (NK) aisladas de sangre periférica, en reposo o después de la activación inducida por IL15. El protocolo descrito podría extenderse fácilmente a las células NK humanas primarias activadas por otras citoquinas o estímulos solubles.

Resumen

Las células de Natural Killer (NK) median principalmente las respuestas inmunitarias antitumorales y antivirales innatas y responden a una variedad de citoquinas y otros estímulos para promover la supervivencia, la proliferación celular, la producción de citoquinas como la gamma de interferón (IFN) y/o los programas de citotoxicidad. La activación de células NK por estimulación de la citoquina requiere una remodelación sustancial de las vías metabólicas para apoyar sus requisitos bioenergéticos y biosintéticos. Hay un gran cuerpo de evidencia que sugiere que el metabolismo de células NK deteriorado está asociado con una serie de enfermedades crónicas incluyendo la obesidad y el cáncer, que destaca la importancia clínica de la disponibilidad de un método para determinar el metabolismo de las células NK. Aquí describimos el uso de un analizador de flujo extracelular, una plataforma que permite mediciones en tiempo real de la glucólisis y el consumo de oxígeno mitocondrial, como una herramienta para monitorear los cambios en el metabolismo energético de las células NK humanas. El método descrito aquí también permite el seguimiento de los cambios metabólicos después de la estimulación de las células NK con citoquinas como IL-15, un sistema que actualmente se está investigando en una amplia gama de ensayos clínicos.

Introducción

Las células de Natural Killer (NK) son linfocitos innatos que median las respuestas antitumorales y antivirales. Las células NK comprenden entre el 5 y el 15% de todos los linfocitos en la sangre periférica humana, y también se pueden encontrar en el bazo, el hígado, la médula ósea y los ganglios linfáticos. Las células NK no expresan receptores clonotípicos polimórficos, como los receptores de células T (TCR) o los receptores de células B (BCR). Por el contrario, la activación de sus funciones citolíticas se debe a la realización de receptores que reconocen ligandos invariables en la superficie de una célula diana^1,

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los principios éticos de investigación médica de la Declaración de Helsinki. Las muestras de sangre periférica de donantes se obtuvieron del Departamento de Medicina de Transfusión de los NIH bajo el protocolo aprobado por el IRB 99-CC-0168, con el consentimiento informado por escrito del paciente.

1. Preparación de reactivos

1. Reactivos para el aislamiento de células NK
   NOTA: Prepare estos reactivos en una capucha de cultivo celular.
   1. Preparar el tampón de separación NK: Suplemento PBS (pH 7.4) con EDTA de 1 mM y 2% De Suero de Becero Fetal (FCS) que pr....

Resultados

El aislamiento de las células NK de la sangre periférica proporciona una población pura y viable

El ensayo de flujo extracelular se basa en la medición de la concentración de H⁺ y O₂ en el pozo y no distinguirá entre diferentes poblaciones de células o su viabilidad. Por esta razón, la obtención de una población altamente pura y viable de la célula de interés fue el paso clave para tener éxito en estos experimentos.

El aislamie.......

Discusión

En este artículo, hemos establecido un protocolo para aislar y cultivar eficientemente células NK humanas primarias y viables a partir de sangre periférica. También hemos optimizado las condiciones para la medición de la actividad metabólica de estas células NK evaluadas por la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular mediante el uso de un analizador de flujo extracelular. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular es rápido, requiere un pequeño número .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Desoxi-D-glucosa (2-DG)	MilliporeSigma	D8375-5G Compuesto inyector de prueba de	esfuerzo de glucólisis
2,4-Dinotrofenol (2,4-DNP)	MilliporeSigma	D198501	ETC desacoplador / compuesto inyector de prueba de esfuerzo mitocondrial
Placa de cultivo celular de 96 pocillos/ Fondo redondo con tapa	Costar	3799	Cultivo celular NK
Antimicina A	MilliporeSigma	A8674	Inhibidor del complejo III / Compuesto inyector de prueba de glucólisis y esfuerzo mitocondrial
BD FACSDIVA Software	BD Biosciences Adquisición de		datos de flujo
BD LSR Fortessa	BD Biosciences Adquisición de		datos de flujo
Cell-Tak	Corning	354240	Adhesivo celular
CyQUANT ensayo de proliferación celular ThermoFisher	Scientific	C7026	Ensayo de proliferación celular para la cuantificación de ADN. Contiene tampón de lisis celular y colorante CyQUANT GR
Kit de selección positiva CD3 humano EasySep II	Tecnologías de células madre	17851	Aislamiento de células NK de PBMC
Kit de enriquecimiento de células NK humanas EasySep Tecnologías	células madre	19055	Aislamiento de células NK de PBMC Tecnologías de
células madre	EasySep 18001		Aislamiento de células NK de PBMC
EDTA 0,5 M, pH 8	Calidad Biológico	10128-446	NK vender tampón
de separación Tubos FACS	Falcon-Fisher Scientific	352235	Experimento de citometría de flujo
Falcon 50 ml Tubos cónicos	Falcon-Fisher Scientific	14-432-22	Separación de células NK
Suero fetal para terneros (FCS)	Gibco	10437-028	Tampón de separación de células NK
FlowJo Software	BD Biosciences		Análisis de datos de flujo
Glucosa	MilliporeSigma	G8270	Componente del medio de prueba de esfuerzo mitocondrial. Prueba de glucólisis compuesto inyector de prueba
estrés Cóctel de inhibidores de proteasa Halt	ThermoFisher Scientific	78429	Inhibidor de la proteasa 100X. Uso en tampón de lisis RIPA
IL-15 humano Peprotech		200-15-50ug	Estimulación celular NK
Suero humano (HS)	Valley Biomedical	9C0539	NK suplemento de medio de cultivo celular
IMDM	Gibco	12440053	célula NK medio de cultivo
L-glutamina (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030-081	Componente de los medios de prueba de esfuerzo
LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua reparable	ThermoFisher Scientific	L34965	Colorante de viabilidad para tinción por citometría de flujo
LSM	mpbio	50494X	Separación de PBMCs de la sangre humana
Ratón anti-humano CD3 BV711	BD Biosciences	563725	Tinción con citometría de flujo de células T Tinción
de ratón CD56 PE	BD de Pharmingen	555516	NK Tinción con citometría de flujo NK
de ratón antihumana NKp46 PE	BD Pharmingen	557991	tinción con citometría de flujo NK
Oligomicina	MilliporeSigma	75351	Inhibidor del complejo V / compuesto inyector de prueba de esfuerzo mitocondrial
PBS pH 7.4	Gibco	10010-023	Célula NK tampón de separación
Pierce BCA kit de ensayo de proteínas	ThermoFisher Scientific	23225	Para la determinación de la concentración de proteínas
Tampón RIPA Boston	BioProducts	BP-115	Lisis celular
Rotenona	MilliporeSigma	R8875	Inhibidor del complejo II / glucólisis y prueba de estrés mitocondrial compuesto inyector
Seahorse Wave Controller Software	Agilent		Controlador para el analizador Seahorse XFe96
Seahorse Wave Software de escritorio	Agilent		Para el análisis de datos
Seahorse XF Base Medium	Agilent	102353-100	Extracellular Flux base medium
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent		Analizador de flujo extracelular
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Incluye 20 placas de cultivo celular XF96, 18 cartuchos de sensor XFe96, guías de carga para transferir compuestos al cartucho de ensayo y 1 frasco de solución calibrante (500 ml).
Bicarbonato de sodio	MilliporeSigma	S5761	Para preparar la solución de Cell-Tak
Piruvato de sodio (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360-070	Componente del medio de prueba de esfuerzo mitocondrial

de magnéticas de con citometría de flujo