Aquí se presenta un enfoque fosfoproteómico, a saber, detener e ir extracción a base de punta fosfoproteómica, que proporciona alto rendimiento y cobertura profunda de arabidopsis fosfoproteoma. Este enfoque delinea la visión general de la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis.
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Artículo de método
Estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis
En este artículo
Resumen
Resumen
La fosforilación proteica es crucial para la regulación de la actividad enzimática y la expresión génica en condiciones osmóticas. La espectrometría de masas (EM) basada en la fosfoproteómica ha transformado la forma de estudiar la transducción de la señal vegetal. Sin embargo, el requisito de una gran cantidad de materiales de partida y el tiempo prolongado de medición de EM para lograr la profundidad de cobertura ha sido el factor limitante para el estudio de alto rendimiento de los cambios fosfoproteómicos globales en las plantas. Para mejorar la sensibilidad y el rendimiento de la fosfoproteómica vegetal, hemos desarrollado un enfoque de extracción de parada e ir (etapa) basado en puntas fosfoproteómicas junto con etiquetado de etiqueta de masa tándem (TMT) para el análisis rápido e integral de la perturbación de la fosforilación vegetal en respuesta al estrés osmótico. Aprovechando la simplicidad y el alto rendimiento de la técnica de punta de etapa, todo el procedimiento tarda aproximadamente una hora utilizando dos consejos para terminar el enriquecimiento de fosfopéptidos, fraccionamiento y pasos de limpieza de muestras, lo que sugiere un fácil de usar y una alta eficiencia del enfoque. Este enfoque no sólo proporciona un análisis de fosfoproteómica vegetal en profundidad (> 11.000 identificación de fosfopéptido) sino que también demuestra la eficiencia de separación superior (< 5% de superposición) entre fracciones adyacentes. Además, se ha logrado la multiplexación utilizando el etiquetado TMT para cuantificar los cambios fosfoproteómicos de las plantas mutantes de decuple de tipo salvaje y snrk2. Este enfoque se ha utilizado con éxito para revelar los eventos de fosforilación de quinasas similares a Raf en respuesta al estrés osmótico, que arroja luz sobre la comprensión de la señalización osmótica temprana en las plantas terrestres.
Introducción
La alta salinidad, las bajas temperaturas y la sequía causan tensiones osmóticas, que es un factor ambiental importante que afecta la productividad de las plantas1,2. La fosforilación proteica es una de las modificaciones post-traslacionales más significativas que median la percepción y la transducción de la señal en respuesta de la planta a la tensión osmótica3,4,5. La proteína quinasa 2s (SnRK2s) relacionada con SNF1 está implicada en la señalización de tensión osmótica6. Nueve de cada diez m....
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Protocolo
1. Preparación de muestras
- Cosecha las plándas tratadas con control y estrés (1 g) en una lámina de aluminio y el flash congela las muestras en nitrógeno líquido.
NOTA: Por lo general, se observa una mayor concentración de proteínas a partir de plándas de dos semanas de antigüedad que la de plantas maduras. Un gramo de plándalo genera aproximadamente 10 mg de lisato proteico, que es suficiente para el análisis de EM. Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 16.000 x g en el paso 1. - Moler plándas congeladas en un polvo fino usando un mortero y pestle lleno de nitrógeno líquido.
- Añadir 1 ml de tampón de lisis ((6 M guani....
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Resultados
Para demostrar el rendimiento de este flujo de trabajo, explotamos la punta de etapa de IMAC junto con el fraccionamiento de punta de etapa Hp-RP para medir los cambios fosfoproteómicos en plándela mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec con o sin tratamiento de manitol durante 30 minutos. Cada muestra se realizó en triplicatos biológicos y el flujo de trabajo experimental se representa en la Figura 1. Los péptidos digeridos (400 μg) de cada muestra fueron etiquetados con un canal TMT-.......
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Discusión
El rango dinámico y la complejidad del proteoma vegetal y el fosfoproteoma siguen siendo un factor limitante a la profundidad de los análisis de fosfoproteómica. A pesar de la capacidad del análisis LC-MS/EM de una sola ejecución para identificar 10.000 sitios de fosforilación21,22,la cobertura de todo el fosfoproteoma vegetal sigue siendo limitada. Por lo tanto, se requiere un flujo de trabajo fosfoproteómico que proporcione alta sensibilidad y eficiencia de sep.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación estratégica prioritaria de la Academia China de Ciencias, Grant XDB27040106.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de 1,5 mL | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1,5 mL, PCR limpio, incoloro, 100 tubos |
| 200 y micro; Punta de pipeta | en L Gilson | F1739311 | |
| 2-cloroacetamida | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| ácido acético | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrilo | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| hidróxido de amonio | Sigma-Aldrich 338818 | ||
| fosfato de amonio monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| aguja roma | Hamilton | 90516 | Cubo Kel-F (KF), estilo de punta 3, calibre 16 |
| Perlas C18-AQ | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µ m | |
| C8 Disco Empore | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrífuga | eppendorf | 22620444 | |
| cloroformo | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| fórmico Ácido | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Fritas | Agilent | 12131024 | Fritas para cartuchos SPE |
| Clorhidrato de guanidina | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Cloruro de hierro (III) | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| espectrómetro de masas | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Columna de espín Ni-NTA | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroilsarcosine sal de sodio | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Émbolo | Hamilton | 1122-01 Conjunto de | émbolo N, RN, LT, LTN para el modelo 1702 (25 μ l) |
| software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartucho 50 mg | Aguas | WAT054960 | |
| desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Tampón de bicarbonato de trietilamonio | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Ácido trifluoroacético | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Clorhidrato de Trizma | Sigma-Aldrich | T3253 |
Referencias
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperatur....
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Reimpresiones y permisos
