Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa especializada de células ubicadas estratégicamente entre la retina y los coriocapillaris que mantienen la salud general y la integridad estructural de los fotorreceptores. El RPE está polarizado, exhibiendo receptores o canales ubicados de manera apóptica y basal, y realiza el transporte vectorial de agua, iones, metabolitos y secreta varias citoquinas.
Las mediciones in vivo no invasivas de la función RPE se pueden realizar utilizando ERG de acoplamiento directo (DC-ERG). La metodología detrás del DC-ERG fue pionera por Marmorstein, Peachey y sus colegas utilizando un sistema de grabación de estimulación personalizado y más tarde demostrado utilizando un sistema disponible comercialmente. La técnica DC-ERG utiliza capilares de vidrio llenos de solución de sal tamponada de Hank (HBSS) para medir las respuestas eléctricas más lentas del RPE provocadas por cambios de concentración evocados por la luz en el espacio subretinal debido a la actividad del fotorreceptor. El prolongado estímulo de luz y la duración de la grabación DC-ERG lo hacen vulnerable a la deriva y al ruido, lo que resulta en un bajo rendimiento de grabaciones utilizables. Aquí, presentamos un método rápido y confiable para mejorar la estabilidad de las grabaciones al tiempo que reduce el ruido mediante el uso de la presión de vacío para reducir / eliminar las burbujas que resultan de la desgasificación del HBSS y el soporte del electrodo. Además, los artefactos de la línea de alimentación se atenúan mediante un regulador de voltaje/acondicionador de potencia. Incluimos los protocolos de estimulación de la luz necesarios para un sistema ERG disponible comercialmente, así como scripts para el análisis de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. Debido a la mayor facilidad de grabaciones y el flujo de trabajo de análisis rápido, este protocolo simplificado es particularmente útil para medir los cambios relacionados con la edad en la función de RPE, la progresión de la enfermedad y en la evaluación de la intervención farmacológica.
Introducción
El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa de células especializadas que recuben el segmento posterior del ojo y ejercen funciones críticas para mantener la homeostasis retinal1. El RPE soporta fotorreceptores mediante la regeneración de su pigmento visual fotones-captura en un proceso llamado ciclo visual2,participando en la fagocitosis diurna del segmento exterior del cobertizo puntas3,y en el transporte de nutrientes y productos metabólicos entre fotorreceptores y los coriocapillaris4,5. Las anomalías en la función de la....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal descritas en el protocolo de estudio animal aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Animal del Instituto Nacional del Ojo.
1. Importación de protocolos de estimulación de la luz para DC-ERG
NOTA: Siga las instrucciones a continuación para importar los protocolos de estimulación de la luz para el DC-ERG en el software del sistema ERG (Tabla de materiales). El protocolo consiste en un intervalo de pre-estímulo de 0,5 min, seguido de un paso de luz (10 cd/m2)durante 7 min, y terminando con un intervalo post-estímulo de 1,5 min. Se seleccionó....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La Figura 2 es un conjunto de datos de muestra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) y ratones de tipo salvaje (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ son ratones con un nocaut condicional de microRNA 204 en el epitelio pigmentario de la retina. Estos ratones se generan cruzando ratones miR-204 con floxed (producidos por NEIGEF)22 con ratones VMD2-CRE23. MiR-204 se expresa en gran medida en el RPE donde regula la expresión de proteínas críticas para la fun.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Pasos críticos
Una buena grabación DC-ERG requiere electrodos estables que están libres de burbujas que crean artefactos y deriva no deseada, ya que son extremadamente sensibles a la desgasificación y los cambios de temperatura. Es esencial que se alcance una línea de base estable cuando los electrodos se colocan en la solución de baño HBSS antes de continuar con la grabación del ratón. Las pequeñas burbujas tienden a acumularse en la base del electrodo capilar o alrededor de .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los fondos intramuros de NEI. Los autores reconocen sinceramente al Dr. Sheldon Miller por su orientación científica, asesoramiento técnico y experiencia en fisiología y enfermedades de RPE. Los autores agradecen a Megan Kopera y al personal de cuidado de animales por administrar las colonias de ratones, y al Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou y Yuan Wang por el apoyo técnico.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ag/AgCl (boca) Electrodo | WPI Inc | EP1 | Electrodo de referencia de boca para ratón |
| Baldosas de cerámica | Instrumento Sutter | CTS | Se utiliza para cortar el tubo capilar de vidrio a un tamaño adecuado |
| Varilla de limpieza con punta de algodón | médicos puritanos | 867-WC Sin pegamento | Se utiliza como espaciador para mejorar el ajuste del conjunto del portaelectrodos |
| Sistema de electrorretinograma (ERG) | Sistema Diagnosys LLC | E3 | Sistema de electrofisiología visual para diagnosticar afecciones oftálmicas en la investigación de la visión y ensayos de medicamentos |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | O equivalente para dar forma al vidrio bajo llama |
| Tubo capilar de vidrio (1,5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | Para el llenado con HBSS y el contacto con la córnea |
| Hank' s Solución salina tamponada (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Disponible comercialmente. Mantener en RT |
| Filtro en línea | Whatman | 6722-5001 | Para proteger la bomba de vacío de los aerosoles |
| Cable de bajo ruido para soportes de microelectrodos | WPI Inc | 5372 | Sugerido para mejorar la longitud y la ubicación de los cables y los conjuntos de portaelectrodos |
| Rótula magnética | WPI Inc | 500871 | Para el posicionamiento magnético del conjunto del portaelectrodos en la platina |
| MatLab | Mathworks | MatLab: Para editar el software de análisis | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (solo necesario para editar el software de análisis) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (solo necesario para editar y volver a publicar el software de análisis) | |
| MatLab Runtime versión 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Necesario para ejecutar el software de análisis: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Soportes de microelectrodos (45 grados) | WPI Inc | MEH345-15 | Para sujetar los capilares |
| Aguja (calibre 25) | Covidien | 8881250313 | Para llenar los tubos capilares con HBSS |
| Aguja (rectificada) Electrodo | Rhythmlink | 13mm - un electrodo | Electrodo de aguja subdérmico (tierra) para ratón (aguja de 13 mm de largo, 0,4 mm de diámetro, cable conductor de 1,5 m) |
| Regulador/Acondicionador de potencia | Furman | P-1800 | O equivalente para eliminar la compensación de CC del ruido introducido a través de la línea eléctrica |
| Jeringa (12 mL) | Monoyecto | 1181200777 | Para llenar los tubos capilares con HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | Para el montaje de portaelectrodos |
| Desecador | de vacío Bel-Art | 420120000 | Fondo y cubierta |
| Tratamiento farmacológico | |||
| Gel lubricante para ojos | Alcon | 0078-0429-47 | Ayuda a lubricar la superficie de la córnea y a mantener el contacto eléctrico con los electrodos capilares |
| Clorhidrato de fenilefrina 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Colirio midriático de acción corta (para la dilatación de la pupila) |
| Clorhidrato de proparacaína 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Anestésico local para la instilación oftálmica |
| Tropicamida 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Colirio midriático de acción corta (para la dilatación de la pupila) |
| Xilacina | AnaSed | sc-362949Rx | Analgésico y relajante muscular |
| Zetamina (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anestésico para inyecciones intramusculares |
Referencias
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
