Monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo

La prueba de comportamiento es crucial en la investigación en neurociencia para una gran cantidad de información generada en un contexto in vivo. En este sentido, los investigadores han estado utilizando ampliamente diferentes pruebas de comportamiento para analizar la función sensorio-motora, las interacciones sociales, el comportamiento similar a la ansiedad y depresivo, la dependencia de sustancias y diversas formas de funciones cognitivas¹. El registro manual de las pruebas de comportamiento puede ser difícil, agotador e inexacto incluso para la mayoría de los observadores expertos. A pesar de que se han hecho algunos esfuerzos para desarrollar software libre y de código abierto para el registro del comportamiento (por ejemplo, la aplicación sexrat macho² para el comportamiento sexual), varias alternativas permiten el registro automático y en tiempo real del comportamiento de diferentes especies animales, desde peces³ hasta roedores ^4,5,6. El seguimiento de vídeo es un método valioso para la grabación rápida y precisa del comportamiento utilizado en una amplia variedad de aplicaciones⁷. Una característica más potencial en el área de registro del comportamiento es explorar la actividad neuronal durante la manifestación del comportamiento. El registro simultáneo de la actividad neuronal (desde células individuales hasta las principales áreas cerebrales) y tareas conductuales podría mostrarnos cómo el cerebro genera patrones de comportamiento específicos⁸. Los comportamientos son una secuencia de componentes menores que podrían revelar correlaciones entre la actividad neuronal y los movimientos o acciones. Si la actividad neuronal y los patrones de comportamiento pudieran registrarse simultáneamente a través de múltiples escalas de tiempo, podrían explicar cómo cada estado cerebral se correlaciona con cada comportamiento particular (para un examen más profundo del registro del comportamiento, consulte Datta et al., revisión⁸ de 2019). Por lo tanto, el registro sincronizado de la actividad conductual y neuronal a la escala deseada (desde neuronas hasta grandes áreas del cerebro) se considera una herramienta extremadamente útil. Existen varios sistemas destinados a integrar registros conductuales con otras mediciones como la actividad neuronal ^4,5.

Aunque la electroencefalografía es considerada una de las técnicas más utilizadas en el campo de la neurociencia clínica y de investigación, la movilidad relativamente alta, así como el tamaño del dispositivo de registro de EEG, hace que esta técnica sea única y desafiante para la detección en el caso de modelos in vivo⁹. Se han desarrollado algunas soluciones a este problema, por ejemplo, el uso de cables y dispositivos giratorios que permiten a los animales moverse libremente en la arena. Sin embargo, los sistemas basados en cables a menudo imponen problemas para realizar estudios, por ejemplo, durante la transferencia de un animal de una jaula a otra, se observa un obstáculo o enredo del animal con los cables. Se han desarrollado dispositivos telemétricos para grabaciones electrofisiológicas inalámbricas para aumentar la flexibilidad de la situación de registro^10,11. Sin embargo, estos sistemas han mostrado limitaciones considerables debido a su bajo número de canales de grabación y bajas frecuencias de muestreo¹¹. En este estudio, utilizamos un sistema inalámbrico disponible comercialmente que envía señales de EEG del animal a través de una conexión Wi-Fi con un sistema de roedores que se mueve libremente¹². El aparato pesa 6 gramos y soporta hasta 16 canales registrados a 1 kSps. Este sistema permite el registro de EEG o picos en el entorno animal, con una perturbación reducida, sirviendo como una solución económica en comparación con los sistemas electrofisiológicos tradicionales en el mercado. Además, hemos sincronizado estos datos utilizando un software de seguimiento de video para proporcionar correlación entre EEG y patrones de comportamiento. Esta sincronización se realiza fuera de línea mediante la alineación e interpolación de datos y eventos en función de las marcas de tiempo generadas por ambos sistemas y se procesa en MATLAB.

La neurogénesis adulta se define como la proliferación, supervivencia y diferenciación en neuronas de células recién generadas en el giro dentado de animales^13,14. Se sabe que este proceso está asociado con la mejora de la memoria y el aprendizaje, lo que aumenta la neurogénesis adulta en roedores a través de condiciones de ambiente enriquecido (EE)¹⁵. La EE consiste en alojar roedores en pequeños grupos dentro de una gran jaula provista de juguetes y tubos, donde los animales tienen novedad y complejidad pero sin relevancia biológica¹⁵. Aunque la EE estimula la neurogénesis del hipocampo, también varía en muchos factores, como la edad, la tensión animal, las condiciones de estimulación específicas o el procedimiento de detección de neurogénesis. En ratones de mediana edad expuestos al alojamiento de EE durante siete días, se ha reportado el nacimiento de nuevas células granulares (GC) en el giro dentado del hipocampo (DG)¹⁶. Los estudios que intentan extirpar selectivamente la neurogénesis adulta en ratas adultas han sugerido que se requieren nuevas células granulares de aproximadamente 1 a 2 semanas de edad en la respuesta aprendida¹⁷. Alrededor de 2 o 3 semanas después del nacimiento de la GC en adultos DG, comienzan a aparecer varios rasgos característicos, como las espinas dendríticas, que son esenciales para la transmisión sináptica excitatoria¹⁸. Zhao et al. realizaron un análisis cuantitativo para mostrar que el pico de crecimiento de la columna vertebral ocurre durante las primeras 3 - 4 semanas¹⁹. Varios estudios electrofisiológicos in vivo sugieren que sólo tres semanas de condiciones de alojamiento EE producen alteraciones en la transmisión sináptica del DG y aumentan la excitabilidad celular²⁰. Además, se ha informado que la exposición a un ambiente enriquecido a las 1-4 semanas después de las inyecciones de BrdU aumentó significativamente la densidad de las células BrdU / NeuN en la capa granular DG en ratones²¹. Estos autores sugieren que existe un período crítico entre una y tres semanas después de la exposición a EE, ya que se observó un aumento sustancial en el número de nuevas neuronas²¹. Los estudios de neurogénesis del hipocampo adulto (AHN) en humanos han sido controvertidos ya que no hubo evidencia directa. Sin embargo, un informe reciente describió las etapas de desarrollo de la AHN en el cerebro humano adulto, identificando miles de neuronas inmaduras en la DG, y demostrando así la importancia de la AHN durante el envejecimiento en humanos²². Sobre la base de la evidencia mencionada anteriormente, el estudio de la AHN en modelos animales es más importante que nunca (para un examen más profundo de la AHN, véase Leal-Galicia et al., revisión¹⁵ de 2019).

Como se mencionó anteriormente, el hipocampo se ha relacionado con una función fundamental en las capacidades de aprendizaje y memoria. La formación de memorias pasa por tres procesos distintos: codificación (adquisición de memoria), consolidación (almacenamiento de memoria) y recuperación (reconocimiento de memoria)²³. La memoria de reconocimiento en humanos se prueba utilizando la tarea²⁴ de comparaciones pareadas visuales. Los fundamentos de los modelos humanos y animales de memoria y amnesia son las pruebas de comportamiento que evalúan la capacidad de reconocer un estímulo previamente presentado^25,26, como lo hace la tarea de comparaciones visuales pareadas en humanos. Por lo tanto, una de las pruebas de comportamiento más utilizadas para evaluar la capacidad de un roedor para reconocer un estímulo previamente presentado, es decir, la capacidad de aprendizaje y memoria es la tarea espontánea de reconocimiento de objetos novedosos (NORT)^23,27. El protocolo NORT consiste en dos objetos novedosos idénticos en un ámbito familiar durante 10 minutos en la prueba de adquisición. Después de un tiempo específico entre 0 28 y⁴⁸ horas²⁹ (tiempo variable según cada protocolo), el animal es devuelto a la misma arena que contiene uno de los mismos objetos familiares y un objeto novedoso. El animal explora espontáneamente el objeto novedoso si el objeto familiar fue memorizado²⁶. La relación de preferencia se utiliza comúnmente para evaluar el rendimiento de la exploración. Se determina dividiendo el tiempo total de exploración del objeto del tiempo de exploración del objeto nuevo o familiar. El NORT tiene algunas ventajas sobre otras pruebas de memoria de reconocimiento. Lo más importante es que no requiere motivación externa, recompensa o castigo. No genera condiciones estresantes. Finalmente, no se necesita entrenamiento para evocar el comportamiento de explorar los objetos (para un examen más profundo de NORT, ver ^ref.23).

Por lo tanto, el registro simultáneo de múltiples modalidades de datos y su integración en el estudio del aprendizaje y la memoria, como efecto de la neurogénesis del hipocampo adulto, es muy atractivo y proporciona una solución convincente para los investigadores en el campo. El presente trabajo expondrá todos los procesos involucrados en la evaluación simultánea del seguimiento de video conductual (tarea de reconocimiento de objetos novedosos) y la grabación inalámbrica de electroencefalografía. Aquí hemos revisado el proceso de fabricación de electrodos, la cirugía de implantación de electrodos epidurales (tornillo de cráneo), el protocolo de enriquecimiento ambiental (para la inducción de neurogénesis del hipocampo), siguiendo el protocolo NORT, la configuración BTS, el acoplamiento EEG – BTS para la monitorización simultánea en tiempo real, y el análisis de datos de EEG y comportamiento ejecutados en el entorno informático MATLAB.

Todos los procedimientos siguen la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicaciones NIH N°. 8023, revisada en 1978) implementada por las Instituciones Nacionales de Salud y las leyes locales mexicanas para reducir el número de animales utilizados para el bienestar animal y la prohibición del sufrimiento animal. El Comité de Ética de la Universidad Iberoamericana aprobó los protocolos experimentales para el uso de animales en este estudio.

1. Configuración general

1. Instale el software de seguimiento del comportamiento en un ordenador de acuerdo con las instrucciones de fabricación.
2. Monte la cámara directamente encima del dispositivo, de modo que mire hacia abajo. La cámara debe estar conectada al ordenador.
3. Instale el software del controlador requerido por la cámara (siguiendo las instrucciones de fabricación).
4. Si la cámara incluye un objetivo zoom, ajústelos para que quepan perfectamente en la pantalla de la cámara.
5. Desactive el modo de enfoque automático (AF) de la cámara siguiendo el software de fabricación.
6. Asegúrese de que la cámara funciona correctamente en tiempo real y pruebe el modo de captura de vídeo hasta que esté listo para usar.

2. Protocolo de enriquecimiento ambiental (véase la figura 1)

NOTA: Se utilizaron ratas Wistar macho de tres meses de edad para este experimento y se mantuvieron en condiciones naturales de luz oscura.

1. Coloque la ropa de cama de aserrín en una arena cuadrada de acrílico transparente (500 x 500 x 500 mm).
2. Coloque tres tipos diferentes de juguetes en la arena para que los roedores interactúen con ellos (p. ej., ruedas de actividades, pisos dobles, escaleras, etc.).
3. Agregue cuatro tubos de PVC opaco gris curvo de 2 pulgadas y cuatro curvados.
4. Proporcionar dispensadores de alimentos y agua con acceso ad libitum a los animales.
5. Coloque tres roedores por jaula dentro de la sala del vivero en condiciones regulares.
6. Dejar a los animales en esta arena durante el tiempo requerido de acuerdo con el protocolo correspondiente. En este experimento, los animales deben permanecer dentro de la arena durante 20 días.
   NOTA: Después de la cirugía de implantación de electrodos, los animales no vuelven al tratamiento de enriquecimiento ambiental. En cambio, se colocaron en jaulas individuales hasta que se complete la nueva prueba de reconocimiento de objetos.

3. Proceso de fabricación de electrodos

1. Corte un trozo de alambre de cobre a aproximadamente 2 cm y use un papel de lija para frotar aproximadamente 0,5 cm de cada extremo.
2. Haga rodar un extremo del cable de cobre hasta la cabeza de un tornillo de tamaño pequeño (electrodos) y asegúrese de que esté firmemente fijado, ya que este es un paso crucial. Se debe garantizar el contacto correcto entre ambos materiales para evitar artefactos en las señales de EEG.
3. Inserte el otro extremo en la punta del terminal del conector y asegúrese de que esté correctamente fijado reforzando con pinzas finas. Esta punta debe conectarse con un cable amplificador.
4. Mida la conductividad adecuada desde la punta hasta el tornillo con un multímetro. Este proceso garantiza que la conexión del electrodo esté correctamente instalada.

4. Cirugía de implantación de electrodos epidurales (tornillo de cráneo)

NOTA: Después de 20 días de tratamiento de enriquecimiento ambiental, los animales se someterán a cirugía siguiendo el procedimiento que se describe a continuación:

1. Inyecte un cóctel de ketamina/xilazina (90/10 mg/kg, i.p.) al animal.
   NOTA: Para evitar la obstrucción de las vías respiratorias, espere hasta que la rata deje de moverse, luego sáquela de la jaula de alojamiento y coloque al animal en una superficie plana. Inyecte un antiinflamatorio no esteroideo (meloxicam 1 mg/kg, s.c.) y un antibiótico (enrofloxacino 2,5 mg/kg, p.o.) como analgesia preventiva.
2. Una vez que la rata esté completamente anestesiada, afeite el área de la cabeza de la rata.
   NOTA: Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado antes de continuar con la cirugía. Pellizque con cuidado una de las patas o la cola. Si el animal reacciona al estímulo, espere unos minutos más y pellizque nuevamente. Si el animal no reacciona al pellizco, vaya al siguiente paso. Si el equipo requerido está disponible, se recomienda encarecidamente el uso de anestesia gaseosa (como isoflurano), ya que es más fácil de valorar por seguridad.
3. Coloque al animal en el aparato estereotáxico fijando ambas orejas primero con las barras para los oídos (tenga cuidado de no lastimar el oído interno del animal). Finalmente, coloque los dientes frontales sobre la barra de mordida y asegure la barra nasal.
   NOTA: Proporcione al animal una almohadilla térmica para toda la cirugía, ya que la anestesia utilizada en este procedimiento generalmente causa hipotermia y problemas respiratorios.
4. Limpie la parte superior del área de la cabeza con tres rondas alternas de clorhexidina o exfoliante a base de yodo seguido de solución salina o enjuague con alcohol.
5. Administrar lidocaína por vía subcutánea (20 mg/ml) debajo de la piel del área de la cabeza (0,5 ml).
6. Instilar una gota de solución oftálmica o solución salina en los ojos de cada animal cada 5-10 minutos para ayudar a que no se sequen.
7. Usando un bisturí, haga una incisión de aproximadamente 2 cm de dirección anterior a posterior para exponer adecuadamente la región superior del cráneo.
8. Retraiga la piel con pinzas de bulldog y raspe el tejido que recubre el cráneo.
9. Identificar y registrar las coordenadas bregma obtenidas.
10. Partiendo de Bregma, utilizando los estereotáxicos Paxinos y Watson Atlas³⁰, localiza y marca la posición de cada uno de los siete puntos (coordenadas) donde se fijarán los electrodos.
    NOTA: En este experimento, F3, F4 tornillos (+2,0 mm desde Bregma, 2,25 mm lateral desde la línea media); Tornillos C3, C4 (−3,0 mm desde Bregma, 2,75 mm laterales desde la línea media); y P3, se instalaron tornillos P4 (−7,0 mm desde Bregma, 2,75 mm laterales desde la línea media). Un séptimo tornillo se localizó posterior del hueso nasal (NZ), como referencia de tierra (ver Figura 2).
11. Usando una herramienta de perforación de velocidad variable, haga un agujero con un tamaño de punta 2 (longitud 44.5 mm) en cada una de las marcas, tenga cuidado de no penetrar completamente el cráneo.
12. Inserte el electrodo en el orificio y atorníllelo al cráneo con cuidado.
13. Repita los pasos 4.10 y 4.11 hasta que los siete tornillos estén fijados correctamente.
14. Fije los 7 tornillos con una primera capa de cemento dental. Inserte cada electrodo en un conector. Cubra los cables completamente con una segunda capa de cemento dental (evitará que el animal tire de los tornillos) y la parte inferior del conector. Si es necesario, cubra con una tercera capa de cemento dental, dejando limpio el conector EEG para una conexión adecuada, de modo que el dispositivo EEG se pueda conectar adecuadamente (ver Figura 3).
    NOTA: Después de colocar cada par de tornillos bilaterales, estos podrían fijarse con cemento dental (paso opcional).
15. Deje a la rata en cuidados postoperatorios durante la noche. Observe al animal y proporcione al animal una almohadilla térmica durante 1-2 h después de la cirugía, ya que la anestesia utilizada en este procedimiento generalmente causa hipotermia y problemas respiratorios.
16. Administrar 50mL/kg/24h (dosis de mantenimiento) de solución salina por vía subcutánea para prevenir la deshidratación. Inyecte un antiinflamatorio no esteroideo (meloxicam 2 mg/kg, s.c.) y un antibiótico (enrofloxacino 5 mg/kg, p.o.) después de la cirugía y durante las siguientes 24 h.
17. Después de la cirugía, mantenga a las ratas en jaulas individuales para una recuperación completa durante siete días antes de realizar las pruebas de comportamiento.
18. Manipule suavemente al animal de forma periódica (al menos una vez al día) para ayudar a reducir el estrés en futuras manipulaciones. Mientras sostiene a la rata con una mano, la presión del dedo se aplica suavemente a la espalda del animal, deslizando los dedos a través del pelaje. Revise la herida en la cabeza, el estado de salud, el comportamiento en general y el peso corporal durante un período de una semana después de la cirugía.
    NOTA: Si se encuentra alguna anormalidad o signos de enfermedad / estrés en el animal, notifique al médico veterinario responsable. Después de este período, realice la prueba de reconocimiento de objetos novedosos y la técnica de grabación de EEG.

5. Prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NORT)

NOTA: Siete días después de la cirugía, proceda a pruebas de comportamiento. Todos los procedimientos conductuales, en el experimento presentado se realizaron entre las 14 h 00 min y las 16 h 00 min, lo que corresponde al ciclo de luz de la rata.

1. Coloque un chaleco hecho de tela suave (al que se colocaría el dispositivo de EEG durante la prueba de comportamiento) en la rata. Permita la habituación durante 2-3 días antes de realizar la prueba de comportamiento.
2. Coloque una arena cuadrada de acrílico negro (500 x 500 x 500 mm) en una sala de grabación iluminada con poca luz.
3. Fije dos objetos novedosos idénticos al centro del piso de la arena usando cinta adhesiva de doble cara (para evitar su desplazamiento por los animales). Los objetos deben ser equidistantes entre sí y de las paredes de la arena.
4. Limpie cada objeto a fondo de antemano con etanol al 50%, así como el piso de la arena después de cada prueba (para evitar señales olfativas).
   NOTA: Siempre transfiera a los animales a las salas de alojamiento (desde la sala de vivero a la sala experimental) al menos media hora antes de comenzar cada sesión. Después de completar la sesión de grabación, deje a los animales en la sala experimental durante una hora adicional. Esto es para evitar el estrés que podría afectar el rendimiento de esta prueba.
5. Conecte el dispositivo EEG antes de comenzar cada prueba. Sujete suavemente al animal e inserte firmemente el cable en el conector en la cabeza del animal con el kit de EEG conectado a la espalda del animal (ver Figura 4). Solo se permite una posición.
   NOTA: La manipulación previa suave del animal podría ayudar a reducir el estrés en los animales durante el procedimiento de conexión. De lo contrario, aumenta el riesgo de daños al dispositivo o a los animales. Precargue completamente la batería del dispositivo mediante un puerto USB.
6. Nuevas fases de pruebas de reconocimiento de objetos
   1. Habituación: Manipule al animal a intervalos de 5 minutos durante dos días consecutivos, e inmediatamente después, coloque al animal en la arena (sin ningún objeto) y permítale explorar durante 10 minutos libremente.
      NOTA: Antes de ejecutar cualquier sesión de prueba de adquisición y memoria, las ratas fueron cuidadosamente manipuladas y conectadas al dispositivo de EEG correspondiente, que se fijó correctamente antes de comenzar la prueba.
   2. Sesión de adquisición: Coloque al animal en la arena frente a una de las paredes opuestas a los objetos. Permita que los animales exploren libremente durante 10 minutos. Vaya al paso 6.13 para la grabación de pruebas utilizando el software de seguimiento del comportamiento.
      NOTA: Asegúrese de que el dispositivo de EEG sostenga correctamente el chaleco unido a la espalda de la rata (para garantizar el seguimiento adecuado del animal). Para un refuerzo adicional, use cinta adhesiva.
   3. Prueba de memoria a corto plazo (SMT): reemplace uno de los objetos con cualquier otro completamente diferente en forma, color y textura. Coloque al animal, 2 h después de la sesión de adquisición, en la arena frente a una de las paredes opuestas a los objetos. Permita que el animal explore libremente durante 10 minutos. Vaya al paso 6.13 para la grabación de pruebas utilizando el software de seguimiento del comportamiento.
   4. Prueba de memoria a largo plazo (LMT): reemplace el objeto utilizado con cualquier otro completamente diferente en forma, color y textura de la prueba de memoria a corto plazo. Coloque el animal 24 h después de la sesión de adquisición, en la arena frente a una de las paredes opuestas a los objetos. Permita que el animal explore libremente durante 10 minutos Vaya al paso 6.13 para el registro de la prueba utilizando el software de seguimiento del comportamiento.

6. Configuración del software de seguimiento del comportamiento

1. Abra el software de seguimiento del comportamiento.
2. Inicie sesión en la cuenta utilizando el usuario y la contraseña de la institución.
3. Abra el toque "Nuevo experimento vacío" y elija un nombre para el protocolo (por ejemplo, "NORT").
4. Seleccione "Modo de seguimiento de video".
   NOTA: En este experimento, la cámara está configurada para transmitir el seguimiento de video en vivo. Sin embargo, hay una opción adicional para seleccionar videos pregrabados.
5. Vaya a "Aparato". Defina el área de la arena, ajustando el rectángulo naranja a los límites de la arena proyectada. Determine la región del objeto, ajustando los círculos naranjas en el borde de los objetos dentro de la arena proyectada desde la cámara en la pantalla.
6. Configure la línea de regla móvil de la escala a una posición a lo largo de la longitud conocida de la imagen (la arena). Introduzca la longitud del objeto en milímetros en la opción "La longitud de la línea de regla es" en el panel Configuración. En este caso, la arena mide 500 x 500 mm.
7. Ve a "Seguimiento y comportamiento". Continúe con "Zonas". Haga clic en el menú "Agregar elemento" y seleccione "Nueva zona". Seleccione el área de la arena y asigne un nombre a la nueva zona (por ejemplo, "Campo").
8. Repita el paso anterior con el área de los objetos y asigne un nombre a la nueva zona (por ejemplo, "Objetos").
9. Vaya a "Color animal" y seleccione la opción "Los animales son más claros que el fondo del aparato".
   NOTA: Se utilizaron ratas blancas (Wistar) para este experimento. Sin embargo, el software tiene opciones adicionales para los investigadores que usan ratas negras y manchadas. Ambas razas de animales se pueden utilizar en el mismo experimento.
10. Vaya a "Seguimiento de la cabeza y la cola del animal" y seleccione "Sí, quiero que se rastree la cabeza y la cola del animal".
11. Ir a "Pruebas" | "Etapas" y, en el menú "Agregar elemento", seleccione "Nueva etapa". Asigne a la nueva etapa el nombre "Adquisición". Defina la duración de la etapa (por ejemplo, 600 s).
12. Repita el paso anterior de las etapas "Prueba de memoria a corto plazo" y "Prueba de memoria a largo plazo".
    NOTA: En este protocolo, todas las etapas tienen la misma duración (10 min).
13. Vaya a "Procedimientos". Defina los eventos que se rastrearán para cada etapa (adquisición, prueba de memoria a corto plazo y prueba de memoria a largo plazo).
14. Comience la prueba (con cada animal). Vaya a "Pruebas" (en la barra de menú superior) y seleccione "Agregar una prueba (+)". Asigne un número para el animal que se someterá a la prueba (por ejemplo, "1").
15. Seleccione "Grabar" y nombre los animales y la sesión (por ejemplo, "M1 Acq").
16. Antes de colocar al animal en la arena, haga clic una vez en el botón "Jugar". Se mostrará un mensaje "esperando para comenzar".
17. Después de colocar al animal en la arena, haga clic por segunda vez en el botón "Jugar". La prueba comenzará y finalizará automáticamente.
18. Repita los pasos 6.13-6.16 para la prueba de memoria a corto plazo (2 h después de la sesión de adquisición) y la prueba de memoria a largo plazo (24 h después de la sesión de adquisición).

7. Configuración del dispositivo de electrofisiología inalámbrica

1. Conecte el módem a un host de PC y enciéndalo. Apague cualquier otro dispositivo de red en el PC. Preferiblemente, silencie cualquier otra comunicación inalámbrica en la sala de registro como Bluetooth, teléfonos celulares, otros módems o incluso teléfonos inalámbricos.
2. Conecte el amplificador a la espalda de la rata, como se mencionó en el paso 5.5.
3. Encienda el dispositivo EEG enchufando la batería.
   NOTA: 2 s después de conectar el dispositivo, un led rojo en el amplificador EEG parpadeará, lo que indica que la comunicación con el módem está activa, y luego se encenderá el led verde. Si la comunicación es exitosa, los LED del módem comenzarán a parpadear continuamente. El amplificador ahora está listo para enviar información al módem.
4. Inicie el software EEG y configúrelo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para integrarlo en el dispositivo inalámbrico de adquisición de EEG
5. Pulse el botón "Start Display". El software EEG mostrará la adquisición real de la señal.
   NOTA: Utilice el "Administrador de tareas de Windows" para asignar el modo de prioridad "Tiempo real" para evitar la pérdida de información durante la experimentación.

8. Grabación de señales de electroencefalografía (EEG)

1. Después de verificar que el software de EEG está adquiriendo datos, inicie el software de seguimiento del comportamiento y establezca un protocolo experimental para verificar que el animal esté en la zona de observación y que la configuración funcione correctamente.
2. En este punto, inicie la grabación del software EEG presionando el botón "Iniciar grabación". Después de verificar que la señal de adquisición se está ejecutando, comience la experimentación en el BTS.
3. Una vez finalizado el experimento, vuelva al software EEG y detenga el proceso de grabación. La grabación se guardará utilizando un nombre predeterminado que consiste en la fecha de grabación utilizando el siguiente formato: "aaaa-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". De forma predeterminada, todas las grabaciones se guardan en la carpeta del software EEG (NeurophysData).
4. Compruebe que se han creado ambos archivos de datos. Registre el registro del experimento o cambie el nombre para evitar confusiones.

9. Tarea de comportamiento y sincronización de la señal de EEG

1. Abra MATLAB y ejecute el comando: convert_plx2mat. Dicha función abrirá un cuadro del navegador. Las funciones de conversión son proporcionadas por el fabricante y deben añadirse a la ruta de MATLAB.
2. Seleccione el *.plx para convertir y pulse "Enter" en la línea de comandos de MATLAB para convertirlo a los parámetros predeterminados.
3. Abra el archivo de experimentación BTS y vaya a "Protocolo". Haga clic en la opción "Resultados, informes y datos", seleccione todos los eventos de ambos objetos y haga clic en "Elegir el formato de hora para el informe", seleccione la tercera opción: "Mostrar tiempos de eventos como tiempo real en HH: MM: SS.sss - por ejemplo 13:20: 14.791".
4. Ahora vaya a "Archivo" y haga clic en "Exportar" y "Exportar experimento como XML", marque "Fecha y hora de la prueba", finalmente haga clic en "Crear XML".
5. Vaya a "Exportar datos de prueba" y haga clic en "Guardar datos". Se creará un archivo .csv con las horas de los eventos.
6. Repita los pasos 9.1 a 9.5 para cada archivo. En nuestro caso, los tres experimentos fueron: ACQ, STM y LTM.
7. Una vez que se hayan convertido los archivos de EEG y comportamiento, recójalos en una sola carpeta. La carpeta debe tener seis archivos, los tres archivos .mat y tres .csv, respectivamente. En nuestro caso, los archivos fueron llamados: PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv y PID_03_LTM_M.csv. ID se refiere al número de identificación de un animal.
8. Abra la función "procesa_sujeto.m" con MATLAB y ajuste la segunda línea a la identificación del animal.
9. Ahora mueva MATLAB a dicha carpeta y ejecute: "procesa_sujeto" para crear figuras de banda relativa alfa y beta a potencia asociadas con el reconocimiento de objetos en etapas ACQ, STM y LTM.
   NOTA: "procesa_sujeto" es una función que ejecuta/ejecuta varios análisis de procesamiento de señales. Estos análisis se resumen de la siguiente manera en los pasos 9.10 a 9.15.
10. Filtre cada señal EEG con un filtro de paso de banda Butterworth de 4º orden a [5-40] Hz, utilizando corrección de fase.
11. Inspeccionar visualmente las señales antes del siguiente análisis, y aquellos canales con artefactos derivados de la colocación defectuosa de los electrodos o desajustes por movimientos de animales se excluyeron del análisis adicional.
12. Señales de referencia a promedio común para aliviar artefactos de movimiento.
13. Segmente las señales de EEG para formar épocas de 4 s de longitud sincronizadas por marcas de tiempo derivadas de BTS. Los eventos objetivo fueron la exploración del objeto marcado por la distancia del animal a la frontera de objetos. Estos eventos están marcados en las marcas de tiempo BTS y se utilizaron como identificadores para fijar las posiciones de las ventanas. Por lo tanto, las épocas de EEG están delimitadas por 1 s antes de que comience la exploración a 3 s después. En este punto, no se utilizó ninguna validación sobre la duración de la exploración, pero se considerará para futuras investigaciones.
14. Estimar la densidad de potencia espectral en esas épocas utilizando el método de periodograma de Welch utilizando la longitud de ventana de 1 s, una superposición del 90%, ventana de Hanning antes de la estimación de la transformada de Fourier, con estos parámetros se logró una resolución de 1 Hz.
15. Evaluar la potencia espectral en cada banda evaluando el área bajo periodograma, y los valores presentados corresponden a la energía relativa, significa que la energía de cada banda EEG se dividió por la energía total de la época. Este procedimiento también reduce las estimaciones erróneas debido a artefactos en las señales de EEG.

Los métodos descritos anteriormente se aplicaron para registrar el EEG y la actividad de ratas simultáneamente después del tratamiento de enriquecimiento ambiental. Las ratas Wistar macho de tres meses de edad estuvieron bajo un protocolo de tratamiento de enriquecimiento ambiental a mediano plazo durante 20 días, y fueron operadas para fijar seis electrodos de tornillo de cráneo emparejados en regiones frontales, centrales y parietales referenciadas a un séptimo electrodo ubicado en Nueva Zelanda. Los animales se mantuvieron en condiciones naturales de luz oscura, con acceso ad libitum a alimentos y agua. Este trabajo muestra la integración entre el sistema de EEG y el software de seguimiento del comportamiento para una grabación simultánea en vivo. Solo utilizamos animales tratados bajo protocolo EE ya que no pretendemos comparar la efectividad del tratamiento, sino que solo ejemplificamos las ventajas del equipo. Como evidencia de que el protocolo de alojamiento de enriquecimiento ambiental de 20 días utilizado estimula la neurogénesis adulta, presentamos datos de recuento de células BrdU positivas de animales bajo EE y animales alojados en condiciones estándar a partir de datos no publicados de nuestro laboratorio. Se utilizaron ratas Wistar macho de tres meses de edad. Se les inyectó tres veces BrdU con 12 h entre sí. Los animales fueron anestesiados (pentobarbital [50 mg/kg, i.p.) y sacrificados por perfusión transcárdica (ver Figura 5). Para garantizar que el chaleco conectado al dispositivo EEG no limite los movimientos de los animales, realizamos la prueba de campo abierto (OFT) en dos grupos, un grupo se sometió a cirugía mientras usaba el equipo (chaleco y amplificador de EEG), y el otro grupo de animales permaneció intacto sin usar el hardware. No encontramos diferencias significativas en la distancia recorrida por los animales en 10 min de prueba (ver Figura 5). El protocolo NORT típico consiste en la presentación de dos objetos y la sustitución de uno de ellos por un nuevo objeto. El software de seguimiento del comportamiento monitoreó el tiempo de exploración.

El software de seguimiento del comportamiento registró un grupo de animales para evaluar sus parámetros clave de rendimiento. Por lo tanto, utilizamos tres parámetros para evaluar el rendimiento de la exploración. La relación de preferencia se calculó utilizando el tiempo de cabeza de los animales pasado en la zona del objeto, que informa la cantidad total de tiempo que la cabeza de los animales pasó en cada objeto. Además, calculamos una relación de preferencia para el tiempo dedicado a moverse hacia los objetos, que muestra la cantidad total de tiempo dedicado a cada animal que se movía hacia cada zona del objeto. Además, se calculó el tiempo empleado por visita a cada objeto. La figura 6 muestra los resultados de tres parámetros mencionados anteriormente. En el ensayo de adquisición, no hubo distinciones entre objetos en los tres parámetros evaluados: tiempo de cabeza en la zona de objetos para los tres ensayos, tiempo de movimiento hacia los objetos para los tres ensayos y tiempo por visita en cada objeto. No hubo diferencias en el ensayo STM. Mientras tanto, en el ensayo LTM, se observó una relación de preferencia de exploración significativamente mayor para el nuevo objeto. Además, en el ensayo LTM, también se pudo ver una preferencia por el objeto novedoso en el tiempo dedicado por visita (panel C). El video 1 muestra un ejemplo representativo de una rata grabada en el experimento, mientras que el video 2 muestra un ejemplo representativo de EEG simultáneo y grabación conductual.

Fue posible hacer coincidir los eventos de tiempo rastreados con el seguimiento del comportamiento y la grabación del software EEG utilizando el reloj de la computadora. La Figura 7 y la Figura 8 muestran los cambios en la potencia relativa del EEG sobre las bandas alfa y beta. Estos están relacionados con el control motor, la concentración y la memoria, lo que sugiere que la exploración solo está relacionada con estas funciones. Los resultados del animal 3 muestran que la potencia alfa tiende a reducirse en STM con respecto a ACQ y LTM, lo que sugiere una desincronización relacionada con la exploración o recuperación de la memoria. El número de reconocimiento de objetos (épocas procesadas) fue bajo. En este punto, no es posible determinar si una prueba estadística validaría si tal diferencia es real, o si un artefacto fue capaz de producir tales condiciones experimentales. Sin embargo, la segmentación, el etiquetado y el análisis de épocas se han hecho posibles gracias a una línea de tiempo de eventos de marcado simultáneos en animales y resultados de EEG producidos para futuros proyectos de investigación. La combinación de estos sistemas evita una identificación errónea de eventos mediante un proceso de marcado manual, que se ha convertido en un problema importante para fines de experimentación animal. La combinación del BTS y la actividad electrofisiológica (EP) podría asociarse con precisión con el comportamiento animal; Sin embargo, las condiciones experimentales requieren el uso de técnicas avanzadas de procesamiento de señales para eliminar los artefactos de movimiento y realizar mejoras en la configuración experimental de manera efectiva.

Figura 1: Ejemplos de condiciones de ambiente enriquecido (EE) en jaula. El alojamiento fue provisto de juguetes y tubos, en los que los animales encuentran novedosos y complejos, pero sin relevancia biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Posiciones de los electrodos epidurales en el cráneo de la rata. Los tornillos se utilizaron simultáneamente como anclaje para los auriculares y como electrodos. F = frontal; C = frontoparietal; P = parietal; 3 = izquierda; 4 = derecha; NZ = como referencia terrestre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas de una cirugía de implantación de electrodos epidurales (tornillo de cráneo). Imagen que muestra electrodos intracraneales implantados en ratas en diferentes etapas de la cirugía. Asegúrese de que se siguen técnicas asépticas mientras realiza este procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes representativas de una rata junto con la configuración experimental. La rata fue obligada a usar el chaleco conectado al dispositivo EEG con una batería incorporada, dentro de la arena utilizada para el protocolo NORT. La imagen muestra el auricular y el conector del cable instalado en la rata de la cabeza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Evidencia de capacidad de movimiento y estimulación de neurogénesis adulta por protocolo EE. (A) Imágenes representativas de la actividad animal durante 10 minutos en la prueba de campo abierto (OFT) y la distancia media que recorrieron los animales que llevaban el equipo/cirugía, y los animales sin el equipo/sin cirugía. (B-E) Sección DG representativa con celdas marcadas con BrdU (oscuridad intensa) para EE y grupos de vivienda estándar. Los paneles B y D muestran un bajo aumento del DG, y los paneles C y E muestran el área de la caja con mayor aumento. Los paneles B y C son tejidos del grupo de viviendas EE, los paneles D y E son del grupo de viviendas estándar. El recuadro ilustra el número promedio de celdas marcadas en ambos grupos. ML - capa molecular; GCL – capa de células granulares; SGZ – zona subgranular; flechas - Celdas BrdU+. Los gráficos muestran la media ± SEM. Se utilizó la prueba T-student para comparar grupos. * p≤0,05. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos en la prueba de campo abierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Rendimiento de exploración en la evaluación NORT. (A) Tiempo de cabeza en la zona de objetos para los tres ensayos. (B) El tiempo se mueve hacia los objetos para los tres juicios. (C) Tiempo por visita en cada objeto. Los gráficos muestran la media ± SEM. Se utilizó ANOVA de medidas repetidas bidireccionales con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak en todos los parámetros. * p≤0.05, ** p≤0.01 entre los objetos en el ensayo respectivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Cambios sobre la potencia de la banda alfa EEG asociada con la exploración. Esta figura muestra cambios en la potencia alfa relativa, de medio segundo a 2,5 después de que el animal comienza la exploración de los objetos. Los seis gráficos correspondían a electrodos frontal, central y parietal (de arriba a abajo) y lados izquierdo y derecho. Los diagramas de caja muestran la distribución de dichas series temporales para cada combinación de condiciones de un objeto: "familiar" y "novela", y etapa: "ACQ", "STM" y "LTM". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Cambios sobre la potencia de la banda beta EEG asociada con la exploración. Esta figura muestra cambios en la potencia beta relativa, de medio segundo a 2,5 después de que el animal comienza la exploración de los objetos. Los seis gráficos correspondían a electrodos frontal, central y parietal (de arriba a abajo) y lados izquierdo y derecho. Los diagramas de caja muestran la distribución de dichas series temporales para cada combinación de condiciones de un objeto: "familiar" y "novela", y etapa: "ACQ", "STM" y "LTM". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Video representativo que muestra una rata grabada en el experimento. La rata estaba dentro de la arena utilizada para el protocolo NORT. La rata llevaba el chaleco conectado al dispositivo EEG con una batería incorporada. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Video representativo que muestra EEG simultáneo y grabación de comportamiento. La señal de EEG se mostró en el lado izquierdo, mientras que la prueba de comportamiento (NORT) se mostró en el lado derecho del video. Haga clic aquí para descargar este video.

Sylvia Ortega-Martínez trabaja como empleada de Stoelting Co., una compañía que proporcionó y patrocinó la producción y el acceso abierto a este artículo.