Predicción de la amputación utilizando células progenitoras mononucleares circulantes locales en pacientes tratados con angioplastia con isquemia de extremidades críticas

Enfermedad arterial periférica (PAD) se caracteriza por una obstrucción vascular crónica y progresiva con limitación del suministro de sangre^1. A escala mundial, pad de las extremidades inferiores afecta a alrededor del 10% de la población de edad avanzada, mientras que hasta el 7% de estos casos se someten a la amputación de extremidades^2,3.

La isquemia de las extremidades críticas (CLI) representa la presentación más seria del PAD¹. Por lo general, los pacientes experimentan dolor en reposo, úlceras o gangrena atribuible a arterias ocluidas; mientras que el pronóstico clínico es desfavorable y marcado por un 30% de riesgo de amputación y mortalidad de extremidades durante 1 año^3,4,5.

La angioplastia es un procedimiento endovascular mínimamente invasivo que puede restaurar el flujo sanguíneo a la extremidad inferior en pacientes con CLI; sin embargo, algunos pacientes inevitablemente requerirán una amputación importante de las extremidades, incluso después de la terapia de angioplastia^1,5. La identificación temprana de resultados desfavorables después de la angioplastia es bastante valiosa, debido a la posibilidad de la aplicación de la terapia.

Los factores de riesgo tradicionales pueden proporcionar una capacidad predictiva limitada para la amputación de extremidades principales en pacientes con CLI sometidos a angioplastia^6. Los biomarcadores orientados a la fisiopatología representan métodos novedosos con aplicaciones clínicas potenciales, que pueden resultar específicamente útiles en enfermedades relacionadas con lesiones vasculares^7. Hoy en día, la participación de poblaciones celulares propietarias de propiedades de reparación endotelial, en el sitio de la placa aterosclerótica, ha sido cada vez más reconocida^8,9.

Las células progenitoras mononucleares (MPC) se derivan de la médula ósea y de las características estructurales y funcionales propias de las células madre con capacidades regenerativas vasculares. Debido a la capacidad de MPC para proliferar, migrar y mostrar adherencia vascular; estas células se han convertido en buenos candidatos para reflejar la reparación endotelial en respuesta a la isquemia^10,11,12. Además, el continuo interés por los mecanismos que subyacen a lesiones vasculares ha motivado la exploración del papel pronóstico de los biomarcadores locales, ya que se considera que reflejan daños vasculares y reparación^7,13,14.

El propósito del presente estudio es describir cómo determinar la cantidad de MPCs que circulan cerca de la obstrucción vascular en pacientes con CLI sometidos a angioplastia; y cómo evaluar la relación entre los MPCs con indicadores de disfunción endotelial y amputación de extremidades.

En comparación con el pronóstico basado en comorbilidades y rasgos vasculares intrínsecos, la cantidad de MPCs locales muestra una capacidad específica para predecir el resultado clínico con respecto a la disfunción endotelial y la amputación de extremidades. Consistentemente, algunos estudios han descrito el papel pronóstico de biomarcadores similares durante la evaluación de pacientes con PAD^15,16.

Basado en resultados anteriores⁷, el método descrito aquí puede ser útil para una identificación temprana de la población en riesgo de resultados vasculares adversos en varios entornos clínicos, tales como isquemia coronaria y miembro inferior, accidente cerebrovascular, vasculitis, trombosis venosa y otros que implican lesiones vasculares y reparación.

El comité de ética de la investigación institucional del Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE aprobó este protocolo prospectivo, todos los pacientes inscritos proporcionaron consentimiento informado por escrito.

1. Evaluación del bloque vascular de las extremidades inferiores, muestreo de sangre y angioplastia de globos

NOTA: La muestra de estudio utilizada para este experimento estaba compuesta por 20 pacientes diabéticos, de 68 años y 10 de cada 20 eran hombres. La mitad de la muestra eran fumadores y las co-morbilidades más frecuentes eran diabetes mellitus tipo 2, hipertensión arterial sistémica y/o dislipidemia. La muestra estaba destinada a estandarizarse para las morbilidades de edad, sexo y co.. No se pudo descartar un posible sesgo debido a la influencia clínico-demográfica en la relación entre los MPCs y la CLI.

1. Evaluar la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades de acuerdo con la clasificación¹³ de Rutherford (ver Tabla Suplementaria 1).
2. Realice angiografía de miembros inferiores, muestreo de sangre y angioplastia de globos.
   1. Use anticoagulante y medicamentos anestésicos antes de la cirugía.
   2. Coloque una aguja de 18 G en el vaso sanguíneo en el sitio de la ingle seleccionado.
   3. Coloque un introductor y avance un cable guía flexible. A continuación, la guía inicial se cambia aún más para un introductor de 6 P.
   4. Utilice la inyección periódica de medios de contraste o CO₂ bajo guía fluoroscópica para identificar la trayectoria arterial y los sitios vasculares bloqueados (Figura 1).
      NOTA: Utilice medios de contraste de 40 cc, diluidos 1:1 en 0.9% solución salina, o CO₂ a 10 a 20 ml por disparo a una presión de 12 psi.
   5. Introducir dos cables guía de navegación 0.014 Fr y dos cables guía de soporte 0.014 Fr en el buque y avanzar hasta el sitio bloqueado.
      NOTA: Dos cables guía fr de 0,014 fr (260 cm de largo) se utilizan para la navegación y dos cables guía fr de 0,014 fr (260 cm de largo) se utilizan para el soporte, durante un solo procedimiento.
   6. Introducir 5 fr y 3 fr catéteres secuencialmente y recoger 10 ml de sangre del sitio más cercano a la obstrucción vascular. Mantenga muestras de sangre en el hielo.
      NOTA: Los tamaños de los catéteres pueden ser 5 Fr y 3 Fr, y se cambian durante el procedimiento.
   7. Avance un cable guía de nuevo. A continuación, introduzca un catéter de globo de angioplastia, que contiene un globo inflable situado al final del catéter. Avance el catéter del globo de angioplastia y coloque el globo justo en el lugar de la lesión. Realice la angioplastia inflando el globo contra la placa de bloqueo ubicada en la pared vascular. Verifique la restauración del flujo sanguíneo.
      NOTA: Se puede colocar un stent en el área bloqueada para ayudar a mantener la arteria abierta después del procedimiento.
   8. Introducir un catéter y avanzar hasta el sitio más cercano al bloque vascular. Recoger 10 ml de sangre a intervalos de tiempo de 30 minutos después de la angioplastia. Mantenga muestras de sangre en el hielo.
      NOTA: Se recomienda la recolección de muestras de sangre antes y después de la angioplastia para evaluar aún más la influencia de la angioplastia en el número de MPCs.
   9. Retire todos los cables bajo guía fluoroscópica.
   10. Proporcionar procedimientos de atención postoperatoria, incluyendo terapia anti-coagulación usando enoxaparina a 1 mg/kg subcutáneo cada 12 h, aspirina 100 mg, estatina y analgesia. Comprimir en el sitio de pinchazo vascular durante 24 h.

2. Cuantificación de células progenitoras mononucleares circulantes (MPCs) (Figura 2)

1. A un tubo cónico fresco de 15 ml, transfiera 6 ml de la sangre recolectada y diluya 1:1 (v/v) con PBS.
   NOTA: Procesa la sangre dentro de 1 h a partir de la recolección.
2. Prepárese para la separación del gradiente de densidad, añadiendo 2 ml del medio de gradiente de densidad a 3 tubos de ensayo cada uno. A continuación, agregue 3 coácuotas de volumen iguales de la sangre diluida en cada tubo de ensayo.
   NOTA: No exceda tres cuartas partes de la capacidad máxima del tubo de ensayo.
3. Centrífuga a 1.800 x g durante 30 min a 4 °C. Recoja la capa de interfaz presente como anillo con una pipeta y transfiérala a un nuevo tubo. Añadir 2 ml de PBS y girar a 1.800 x g durante 6 minutos a 4 °C. Guarde el pellet, ya que esto contendrá MPCs.
4. Lave el pellet que contiene MPCs con PBS por centrifugación como se describe en el paso 2.3. Utilice PBS fresco para cada lavado y gire a 1.800 x g durante 2 minutos a 4 °C. Repita el proceso 6 veces.
5. Después del último lavado, utilice 1 ml de PBS para resuspend el pellet celular. Diluir 20 μL de la suspensión celular con 20 μL de 0.4% de tripa azul, 1:1 (v/v). Utilice 10 μL de esta suspensión celular para el recuento de células utilizando hemociclo y un microscopio ligero.
6. Aliquot 1 x 10⁶ MPCs en tubos de citometría de flujo de flujo de 5 ml previamente etiquetados.
   NOTA: Prepare los anticuerpos de control coincidentes con isotipo correspondientes.
7. Centrífuga los tubos a 1.800 x g durante 6 minutos a 4 °C. Aspirar y desechar el sobrenadante.
8. Diluir anticuerpo primario en 100 μL de solución de incubación de anticuerpos [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%] y añadir al tubo. Resuspend durante 10 s e incubar durante 20 min a 4 °C, en la oscuridad.
   NOTA: Las concentraciones finales de anticuerpos primarios utilizados en el protocolo actual fueron CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. El protocolo puede detenerse a este paso mediante la fijación de linfocitos en un 4% de paraformaldehído en PBS y el almacenamiento de muestras de hasta 24 h a 4 °C.
9. Centrífuga a 1.800 x g durante 2 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Resuspend en 500 μL de 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
10. Realice análisis de citometría de flujo.
    1. Configure el fondo con anticuerpos de control coincidentes con isotipos. Luego, en la gráfica FSC/SSC, algunos linfocitos se propagan, tratando de excluir desechos celulares, granulocitos residuales y otras partículas. Dicha distribución se considera 100%.
       NOTA: Los linfocitos generalmente se propagan en la región inferior izquierda de la parcela.
    2. Utilice una puerta con inmunofenotipo común que contenga un alto número de células CD45⁺ y CD34⁺. A continuación, seleccione dos inmunofenotipos positivos utilizando gate que previamente identificó CD45⁺, CD34⁺, y añadiendo KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺ o CD184⁺. Identifique las subpoblaciones de MPCs mediante sus marcadores de superficie celular específicos. Preséntese como el porcentaje de eventos cerrados.
11. Identificar las subpoblaciones principales de los MPC. En el presente estudio los inmunofenotipos analizados fueron CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ y CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    NOTA: Estos marcadores de superficie celular se utilizaron para el estudio: CD45 (linfocitos), CD34 (células endoteliales y/o vasculares), KDR (VEGFR-2) (marcador de membrana de células endoteliales), CD133 (células progenitoras endoteliales) y CD184 (células madre hematopoyéticas y células endoteliales).

3. Relación de MPCs con modificación de la función endotelial y prueba hemodinámica (FMD)

1. Determinar la dilatación mediada por flujo (FMD), pre y post-angioplastia.
   1. Utilice un transductor lineal vascular para medir el diámetro de la arteria braquial.
   2. Coloque el manguito del esfigmomanómetro por encima del sitio de medición en el antebrazo e insuflar a 50 mmHg por encima de la presión arterial sistólica durante 5 minutos y desinflarse.
   3. Determine de nuevo el diámetro de la arteria braquial en los siguientes 60 s. Utilice la ecuación siguiente para estimar fmd.
      NOTA: Calcular el grado de dilatación utilizando la ecuación (%) = (diámetro máximo después de la isquemia transitoria - diámetro basal) × 100 / diámetro basal.
2. Correlacione el número de MPCs con el valor FMD de línea base y el delta posterior a la angioplastia de FMD.

4. Habilidad pronóstico de los MPCs para la amputación de extremidades

1. Programe citas médicas periódicas después de la angioplastia con balón y el alta del paciente, para evaluar la calidad del flujo sanguíneo a la extremidad inferior.
2. Evaluar la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades a las 2 semanas después de la angioplastia. Evaluar la resolución del dolor de reposo, la isquemia inferior y la preservación de un pie funcional, según la clasificación¹³de Rutherford.
3. Compare la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades, al inicio frente al seguimiento. Identifique aquellos casos que requieran una amputación importante debido a un resultado desfavorable.
4. Correlacione el número de MPCs con la proporción de pacientes que requieren una amputación importante de la extremidad inferior.

Se recogieron muestras de sangre de arterias bloqueadas, en el lugar para la angioplastia, de 20 pacientes diabéticos, de 68 años y 10 de cada 20 eran hombres. La mitad de la población de muestras eran fumadores. Las lesiones vasculares se anotaron principalmente como Rutherford clase VI; mientras que los pacientes mostraron una mayor prevalencia de diabetes mellitus tipo 2 (100%), hipertensión (70%) y dislipidemia (55%).

Un seguimiento clínico de 30 días después de que se llevó a cabo la angioplastia de las extremidades inferiores. El porcentaje de subpoblaciones de MPC en la línea de base o dinámica después de la angioplastia se correlacionó (análisis de Spearman) con el grado de disfunción endotelial, evaluado por la FMD; y el número basal de MPCs se comparó entre pacientes sometidos, o no, amputación de extremidades después de la angioplastia (U-Mann Whitney). El estudio mostró que los MPCs basales subpoblación CD45+CD34+KDR+ se correlacionaron negativamente con FMD(Figura 3A, izquierda), mientras que el cambio de MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ después de la angioplastia se correlacionó significativamente con la mejora de fmd (Figura 3B,derecha). Además, se observó un mayor número basal de MPCs de subpoblación CD45+CD34+KDR+ (Figura 4A,B, izquierda) en aquellos pacientes que evolucionaron a la amputación de extremidades; así como la reducción posterior a la angioplastia de la subpoblación DE MPC CD45+CD34+CD133+CD184+ (Figura 4A,C,derecha).

Figura 1: Angiografía de las extremidades inferiores y recolección de sangre. (A) Trayectoria vascular evidenciada por los medios de contraste bajo fluoroscopia. (B) Obstrucción vascular antes de la angioplastia. (C) Obstrucción vascular después de la angioplastia. (D) El cirujano vascular utiliza un catéter para recoger sangre de la ubicación más cercana a la obstrucción vascular y la placa de ateroma, y el investigador del laboratorio está listo para obtener la muestra de sangre. Las flechas indican el sitio de las obstrucciones vasculares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación de muestras de sangre y determinación de células progenitoras mononucleares (MPCs). (A) Preparación del gradiente de densidad. B) Los linfocitos anillan la separación después de la centrifugación sanguínea. (C) Colección de la fase de linfocitos. (D) Centrifugación. (E) Formación de pellets en la parte inferior del tubo de ensayo. (F) Recuento de suspensión celular. (G) Preparación de linfocitos para la citometría de flujo. (H) Determinación de subpoblaciones celulares por citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Relación de MPCs con indicadores hemodinámicos. (A) Posición del ultrasonido para adquirir FMD y resultados representativos. (B) Relación entre subpoblacións %MPCs de línea base (izquierda, CD45+CD34+KDR+; derecha, CD45+CD34+CD133+CD184+) y valores FMD de línea base; así como la relación de (C) %MPCs después de la angioplastia con la mejora de la FMD después de la angioplastia. Abreviaturas: MPCs, Células Progenitoras Mononucleares; FMD, Dilatación mediada por flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: MPCs y pronóstico de amputación de miembros inferiores después de la angioplastia. (A) Imágenes representativas de citometría de flujo de subpoblaciones de MPCs. (B) La asociación de subpoblacións %MPCs basales (izquierda, CD45+CD34+KDR+; derecha, CD45+CD34+CD133+CD184+), o (C) %MPCs después de la angioplastia, con amputación de extremidades inferiores después de la angioplastia, durante un seguimiento de 30 días. Abreviaturas: MPCs, Células Progenitoras Mononucleares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1: Clasificación de Rutherford de la gravedad de la isquemia de las extremidades. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.