La amputación de miembros inferiores puede ocurrir incluso después de la angioplastia de vasos obstruidos en isquemia de extremidades críticas (CLI). Las células progenitoras mononucleares (MPC) reflejan la reparación vascular. El protocolo actual describe la cuantificación de los MPCs de la circulación cercana a la angioplastia, y su relación con la disfunción endotelial y la predicción de la amputación de las extremidades inferiores.
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Artículo de método
Predicción de la amputación utilizando células progenitoras mononucleares circulantes locales en pacientes tratados con angioplastia con isquemia de extremidades críticas
En este artículo
Resumen
Resumen
La isquemia crítica de las extremidades (CLI) representa una etapa avanzada de la enfermedad arterial periférica. La angioplastia mejora el flujo sanguíneo a la extremidad inferior; sin embargo, algunos pacientes progresan irreversiblemente a la amputación de extremidades. El alcance del daño vascular y los mecanismos de reparación vascular son factores que afectan el resultado posterior a la angioplastia. Las células progenitoras mononucleares (MPC) son reactivas para el daño vascular y la reparación, con la capacidad de reflejar enfermedades vasculares. El protocolo actual describe la cuantificación de los MPCs obtenidos de la circulación sanguínea de los vasos cercanos al sitio de la angioplastia, así como su relación con la disfunción endotelial y su capacidad predictiva para la amputación de extremidades en los próximos 30 días después de la angioplastia en pacientes con CLI.
Introducción
Enfermedad arterial periférica (PAD) se caracteriza por una obstrucción vascular crónica y progresiva con limitación del suministro de sangre1. A escala mundial, pad de las extremidades inferiores afecta a alrededor del 10% de la población de edad avanzada, mientras que hasta el 7% de estos casos se someten a la amputación de extremidades2,3.
La isquemia de las extremidades críticas (CLI) representa la presentación más seria del PAD1. Por lo general, los pacientes experimentan dolor en reposo, úlceras o gangrena atribuible a arterias ocluidas; mientras que el pronóstico clínico es desfavorable y marcado por un 30% de riesgo de amputación y mortalidad de extremidades durante 1 año3,4,5.
La angioplastia es un procedimiento endovascular mínimamente invasivo que puede restaurar el flujo sanguíneo a la extremidad inferior en pacientes con CLI; sin embargo, algunos pacientes inevitablemente requerirán una amputación importante de las extremidades, incluso después de la terapia de angioplastia1,5. La identificación temprana de resultados desfavorables después de la angioplastia es bastante valiosa, debido a la posibilidad de la aplicación de la terapia.
Los factores de riesgo tradicionales pueden proporcionar una capacidad predictiva limitada para la amputación de extremidades principales en pacientes con CLI sometidos a angioplastia6. Los biomarcadores orientados a la fisiopatología representan métodos novedosos con aplicaciones clínicas potenciales, que pueden resultar específicamente útiles en enfermedades relacionadas con lesiones vasculares7. Hoy en día, la participación de poblaciones celulares propietarias de propiedades de reparación endotelial, en el sitio de la placa aterosclerótica, ha sido cada vez más reconocida8,9.
Las células progenitoras mononucleares (MPC) se derivan de la médula ósea y de las características estructurales y funcionales propias de las células madre con capacidades regenerativas vasculares. Debido a la capacidad de MPC para proliferar, migrar y mostrar adherencia vascular; estas células se han convertido en buenos candidatos para reflejar la reparación endotelial en respuesta a la isquemia10,11,12. Además, el continuo interés por los mecanismos que subyacen a lesiones vasculares ha motivado la exploración del papel pronóstico de los biomarcadores locales, ya que se considera que reflejan daños vasculares y reparación7,13,14.
El propósito del presente estudio es describir cómo determinar la cantidad de MPCs que circulan cerca de la obstrucción vascular en pacientes con CLI sometidos a angioplastia; y cómo evaluar la relación entre los MPCs con indicadores de disfunción endotelial y amputación de extremidades.
En comparación con el pronóstico basado en comorbilidades y rasgos vasculares intrínsecos, la cantidad de MPCs locales muestra una capacidad específica para predecir el resultado clínico con respecto a la disfunción endotelial y la amputación de extremidades. Consistentemente, algunos estudios han descrito el papel pronóstico de biomarcadores similares durante la evaluación de pacientes con PAD15,16.
Basado en resultados anteriores7, el método descrito aquí puede ser útil para una identificación temprana de la población en riesgo de resultados vasculares adversos en varios entornos clínicos, tales como isquemia coronaria y miembro inferior, accidente cerebrovascular, vasculitis, trombosis venosa y otros que implican lesiones vasculares y reparación.
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Protocolo
El comité de ética de la investigación institucional del Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE aprobó este protocolo prospectivo, todos los pacientes inscritos proporcionaron consentimiento informado por escrito.
1. Evaluación del bloque vascular de las extremidades inferiores, muestreo de sangre y angioplastia de globos
NOTA: La muestra de estudio utilizada para este experimento estaba compuesta por 20 pacientes diabéticos, de 68 años y 10 de cada 20 eran hombres. La mitad de la muestra eran fumadores y las co-morbilidades más frecuentes eran diabetes mellitus tipo 2, hipertensión arterial sistémica y/o dislipidemia. La muestra estaba destinada a estandarizarse para las morbilidades de edad, sexo y co.. No se pudo descartar un posible sesgo debido a la influencia clínico-demográfica en la relación entre los MPCs y la CLI.
- Evaluar la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades de acuerdo con la clasificación13 de Rutherford (ver Tabla Suplementaria 1).
- Realice angiografía de miembros inferiores, muestreo de sangre y angioplastia de globos.
- Use anticoagulante y medicamentos anestésicos antes de la cirugía.
- Coloque una aguja de 18 G en el vaso sanguíneo en el sitio de la ingle seleccionado.
- Coloque un introductor y avance un cable guía flexible. A continuación, la guía inicial se cambia aún más para un introductor de 6 P.
- Utilice la inyección periódica de medios de contraste o CO2 bajo guía fluoroscópica para identificar la trayectoria arterial y los sitios vasculares bloqueados (Figura 1).
NOTA: Utilice medios de contraste de 40 cc, diluidos 1:1 en 0.9% solución salina, o CO2 a 10 a 20 ml por disparo a una presión de 12 psi. - Introducir dos cables guía de navegación 0.014 Fr y dos cables guía de soporte 0.014 Fr en el buque y avanzar hasta el sitio bloqueado.
NOTA: Dos cables guía fr de 0,014 fr (260 cm de largo) se utilizan para la navegación y dos cables guía fr de 0,014 fr (260 cm de largo) se utilizan para el soporte, durante un solo procedimiento. - Introducir 5 fr y 3 fr catéteres secuencialmente y recoger 10 ml de sangre del sitio más cercano a la obstrucción vascular. Mantenga muestras de sangre en el hielo.
NOTA: Los tamaños de los catéteres pueden ser 5 Fr y 3 Fr, y se cambian durante el procedimiento. - Avance un cable guía de nuevo. A continuación, introduzca un catéter de globo de angioplastia, que contiene un globo inflable situado al final del catéter. Avance el catéter del globo de angioplastia y coloque el globo justo en el lugar de la lesión. Realice la angioplastia inflando el globo contra la placa de bloqueo ubicada en la pared vascular. Verifique la restauración del flujo sanguíneo.
NOTA: Se puede colocar un stent en el área bloqueada para ayudar a mantener la arteria abierta después del procedimiento. - Introducir un catéter y avanzar hasta el sitio más cercano al bloque vascular. Recoger 10 ml de sangre a intervalos de tiempo de 30 minutos después de la angioplastia. Mantenga muestras de sangre en el hielo.
NOTA: Se recomienda la recolección de muestras de sangre antes y después de la angioplastia para evaluar aún más la influencia de la angioplastia en el número de MPCs. - Retire todos los cables bajo guía fluoroscópica.
- Proporcionar procedimientos de atención postoperatoria, incluyendo terapia anti-coagulación usando enoxaparina a 1 mg/kg subcutáneo cada 12 h, aspirina 100 mg, estatina y analgesia. Comprimir en el sitio de pinchazo vascular durante 24 h.
2. Cuantificación de células progenitoras mononucleares circulantes (MPCs) (Figura 2)
- A un tubo cónico fresco de 15 ml, transfiera 6 ml de la sangre recolectada y diluya 1:1 (v/v) con PBS.
NOTA: Procesa la sangre dentro de 1 h a partir de la recolección. - Prepárese para la separación del gradiente de densidad, añadiendo 2 ml del medio de gradiente de densidad a 3 tubos de ensayo cada uno. A continuación, agregue 3 coácuotas de volumen iguales de la sangre diluida en cada tubo de ensayo.
NOTA: No exceda tres cuartas partes de la capacidad máxima del tubo de ensayo. - Centrífuga a 1.800 x g durante 30 min a 4 °C. Recoja la capa de interfaz presente como anillo con una pipeta y transfiérala a un nuevo tubo. Añadir 2 ml de PBS y girar a 1.800 x g durante 6 minutos a 4 °C. Guarde el pellet, ya que esto contendrá MPCs.
- Lave el pellet que contiene MPCs con PBS por centrifugación como se describe en el paso 2.3. Utilice PBS fresco para cada lavado y gire a 1.800 x g durante 2 minutos a 4 °C. Repita el proceso 6 veces.
- Después del último lavado, utilice 1 ml de PBS para resuspend el pellet celular. Diluir 20 μL de la suspensión celular con 20 μL de 0.4% de tripa azul, 1:1 (v/v). Utilice 10 μL de esta suspensión celular para el recuento de células utilizando hemociclo y un microscopio ligero.
- Aliquot 1 x 106 MPCs en tubos de citometría de flujo de flujo de 5 ml previamente etiquetados.
NOTA: Prepare los anticuerpos de control coincidentes con isotipo correspondientes. - Centrífuga los tubos a 1.800 x g durante 6 minutos a 4 °C. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Diluir anticuerpo primario en 100 μL de solución de incubación de anticuerpos [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%] y añadir al tubo. Resuspend durante 10 s e incubar durante 20 min a 4 °C, en la oscuridad.
NOTA: Las concentraciones finales de anticuerpos primarios utilizados en el protocolo actual fueron CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. El protocolo puede detenerse a este paso mediante la fijación de linfocitos en un 4% de paraformaldehído en PBS y el almacenamiento de muestras de hasta 24 h a 4 °C. - Centrífuga a 1.800 x g durante 2 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Resuspend en 500 μL de 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
- Realice análisis de citometría de flujo.
- Configure el fondo con anticuerpos de control coincidentes con isotipos. Luego, en la gráfica FSC/SSC, algunos linfocitos se propagan, tratando de excluir desechos celulares, granulocitos residuales y otras partículas. Dicha distribución se considera 100%.
NOTA: Los linfocitos generalmente se propagan en la región inferior izquierda de la parcela. - Utilice una puerta con inmunofenotipo común que contenga un alto número de células CD45+ y CD34+. A continuación, seleccione dos inmunofenotipos positivos utilizando gate que previamente identificó CD45+, CD34+, y añadiendo KDR (VEGFR-2)+, CD133+ o CD184+. Identifique las subpoblaciones de MPCs mediante sus marcadores de superficie celular específicos. Preséntese como el porcentaje de eventos cerrados.
- Configure el fondo con anticuerpos de control coincidentes con isotipos. Luego, en la gráfica FSC/SSC, algunos linfocitos se propagan, tratando de excluir desechos celulares, granulocitos residuales y otras partículas. Dicha distribución se considera 100%.
- Identificar las subpoblaciones principales de los MPC. En el presente estudio los inmunofenotipos analizados fueron CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ y CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
NOTA: Estos marcadores de superficie celular se utilizaron para el estudio: CD45 (linfocitos), CD34 (células endoteliales y/o vasculares), KDR (VEGFR-2) (marcador de membrana de células endoteliales), CD133 (células progenitoras endoteliales) y CD184 (células madre hematopoyéticas y células endoteliales).
3. Relación de MPCs con modificación de la función endotelial y prueba hemodinámica (FMD)
- Determinar la dilatación mediada por flujo (FMD), pre y post-angioplastia.
- Utilice un transductor lineal vascular para medir el diámetro de la arteria braquial.
- Coloque el manguito del esfigmomanómetro por encima del sitio de medición en el antebrazo e insuflar a 50 mmHg por encima de la presión arterial sistólica durante 5 minutos y desinflarse.
- Determine de nuevo el diámetro de la arteria braquial en los siguientes 60 s. Utilice la ecuación siguiente para estimar fmd.
NOTA: Calcular el grado de dilatación utilizando la ecuación (%) = (diámetro máximo después de la isquemia transitoria - diámetro basal) × 100 / diámetro basal.
- Correlacione el número de MPCs con el valor FMD de línea base y el delta posterior a la angioplastia de FMD.
4. Habilidad pronóstico de los MPCs para la amputación de extremidades
- Programe citas médicas periódicas después de la angioplastia con balón y el alta del paciente, para evaluar la calidad del flujo sanguíneo a la extremidad inferior.
- Evaluar la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades a las 2 semanas después de la angioplastia. Evaluar la resolución del dolor de reposo, la isquemia inferior y la preservación de un pie funcional, según la clasificación13de Rutherford.
- Compare la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades, al inicio frente al seguimiento. Identifique aquellos casos que requieran una amputación importante debido a un resultado desfavorable.
- Correlacione el número de MPCs con la proporción de pacientes que requieren una amputación importante de la extremidad inferior.
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Resultados
Se recogieron muestras de sangre de arterias bloqueadas, en el lugar para la angioplastia, de 20 pacientes diabéticos, de 68 años y 10 de cada 20 eran hombres. La mitad de la población de muestras eran fumadores. Las lesiones vasculares se anotaron principalmente como Rutherford clase VI; mientras que los pacientes mostraron una mayor prevalencia de diabetes mellitus tipo 2 (100%), hipertensión (70%) y dislipidemia (55%).
Un seguimiento clínico de 30 días después de que se llevó a cabo la angi...
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Discusión
La recolección de sangre en el sitio preciso del bloque vascular puede mostrar dificultades técnicas; por lo tanto, realizamos la recolección de sangre en las proximidades al bloque vascular. Del mismo modo, la cantidad de MPCs cerca de la placa vascular parece ser altamente dinámica y puede originar variaciones antes y después de la angioplastia. De acuerdo con nuestras observaciones, se recomienda evaluar los cambios de referencia y 30min-post-angioplastia en el número de MPCs, ya que pueden reflejar varios procesos fi...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo del Programa Institucional E015 para el proyecto ID 356.2015.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BSA | Roche | 10735086001 | Albúmina sérica bovina (BSA) como agente tampón, estabilizador, estándar y para mezcla. |
| Perlas de calibración | Miltenyi Biotec / MACS# | 130-093-607 | MACQLas perlas de calibración de Miltenyi |
| Miltenyi Biotec / MACS# | 130-080-801 | Anticuerpo conjugado a R-Ficoeritrina en tampón PBS/EDTA | |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, isotipo recombinante IgG1 humana, conjugado |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / | MACS#130-093-601 | Anticuerpo conjugado a R-Ficoeritrina en tampón PBS/EDTA |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / | MACS#130-081-001 | El clon de anticuerpo monoclonal AC136 detecta un epítopo de clase III del CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS# | 130-092-880 | Anticuerpo monoclonal CD45, humano conjugado |
| Tubos cónicos | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml |
| Tubos de citometría FALCON | Marca Corning | #352052 | Tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 mL. Estilo 12x75. Estéril. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Metales pesados, (como Pb) < 10 ppm, Fe< 0.01%, As< 1ppm, Insolubles< 0.005% |
| Neubauer mejorado | Sin marca | Sin número de catálogo | Hemocitómetro para recuento de células. (rango 0,1000 mm, 0,0025 mm2) |
| Tubos de extracción de sangre K2 EDTA | BD Vacutainer | #367863 | Tubo vacutainer de plástico lila (K2E) 10,8 mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Estéril y verificado sobre la presencia de endotoxinas. Densidad: 1.077± 0,001 g/mL |
| Paraformaldehído | SIGMA-ALDRICH | Fijación de muestras biológicas, (polvo, 95%) | |
| Pipeta de transferencia 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | La pipeta de transferencia es una herramienta que facilita la transferencia de líquidos con mayor precisión. |
| Tubos de ensayo | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Tubos de ensayo resistentes al calor. TAMAÑO/TAPA 13 x 100 mm |
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