Análisis de sistemas de la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática

Resumen

Este protocolo presenta métodos para caracterizar la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática leve e integrar estos datos como parte de un análisis de sistemas multivariante utilizando regresión parcial de mínimos cuadrados.

Resumen

Las lesiones cerebrales traumáticas leves (MTBIs) son un problema importante de salud pública. La exposición repetida a mTBI puede conducir a déficits funcionales acumulativos y duraderos. Numerosos estudios realizados por nuestro grupo y otros han demostrado que mTBI estimula la expresión de citoquinas y activa la microglía, disminuye el flujo sanguíneo cerebral y el metabolismo, y afecta la reactividad cerebrovascular. Además, varios trabajos han reportado una asociación entre los trastornos en estos marcadores neuroinflamatorios y hemodinámicos y los deterioros cognitivos. A continuación detallamos los métodos para caracterizar la respuesta del tejido neuroinflamatorio y hemodinámico al mTBI en ratones. Específicamente, describimos cómo realizar un modelo de caída de peso de mTBI, cómo medir longitudinalmente el flujo sanguíneo cerebral utilizando una técnica óptica no invasiva llamada espectroscopia de correlación difusa y cómo realizar un inmunoensayo multiplexado luminex en muestras de tejido cerebral para cuantificar citoquinas y fosfoproteínas inmunomoduladoras (por ejemplo, dentro de las vías MAPK y NFκB) que responden y regulan la actividad de la microglía y otras células inmunes neurales. Finalmente, detallamos cómo integrar estos datos utilizando un enfoque de análisis de sistemas multivariante para comprender las relaciones entre todas estas variables. Comprender las relaciones entre estas variables fisiológicas y moleculares nos permitirá, en última instancia, identificar los mecanismos responsables de la mTBI.

Introducción

Visión general
Las lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBIs) afectan a ~ 1.6-3.8 millones de atletas anualmente¹. Estas lesiones, incluidas las lesiones subconmocionales y conmociones cerebrales, pueden dejar a los pacientes con síntomas físicos, emocionales, psicológicos y cognitivos transitorios². Además, el mTBI repetitivo (rmTBI) sostenido dentro de una "ventana de vulnerabilidad" puede conducir a una gravedad acumulativa y a la duración de las consecuencias cognitivas que duran más que los efectos de un solo mTBI solo³ y, en última instancia, incluso a la pérdida permanente de la función ^4,5,6. Aunque muchos pacientes se recuperan en un período de tiempo relativamente corto (<1 semana), el 10-40% de los pacientes sufren efectos más duraderos de mTBI durante > 1 mes, y algunos duran hasta 1 año 3,7,8,9. A pesar de la alta prevalencia y las consecuencias duraderas de estas lesiones, los mecanismos de lesión son poco conocidos y no existen estrategias de tratamiento efectivas.

Dada la alta variabilidad en los resultados después de mTBI / rmTBI, un desafío en la identificación de desencadenantes moleculares en etapa temprana del tejido obtenido en estudios terminales de mTBI / rmTBI es la falta de datos longitudinales que demuestren "enlaces moleculares agudos" definitivos de estos desencadenantes moleculares a resultados a más largo plazo. Para superar este desafío, nuestro grupo ha descubierto que la reducción aguda del flujo sanguíneo cerebral medida agudamente utilizando una herramienta óptica llamada espectroscopia de correlación difusa (DCS), se correlaciona fuertemente con el resultado cognitivo a largo plazo en un modelo de ratón de rmTBI¹⁰. Usando este biomarcador hemodinámico, demostramos que los ratones con flujo sanguíneo cerebral agudamente bajo (y, por extensión, peor resultado predicho a largo plazo) tienen aumentos agudos concomitantes en la fosfo-señalización neuronal dentro de las vías MAPK y NFκB, aumentos en la expresión neuronal de citoquinas proinflamatorias y aumentos en la expresión del marcador fagocito/microglial Iba1¹¹ . Estos datos sugieren un posible papel para la fosfo-señalización neuronal, la expresión de citoquinas y la activación microglial tanto en la regulación aguda del flujo sanguíneo cerebral después de la lesión, así como en el desencadenamiento de una cascada de señalización que conduce a la disfunción neuronal y un peor resultado cognitivo. A continuación, detallamos nuestro enfoque para sondear simultáneamente el entorno hemodinámico y neuroinflamatorio después de rmTBI y cómo integrar estos conjuntos de datos complejos. Específicamente, describimos los procedimientos para cuatro pasos clave para este enfoque integral: (1) un modelo de caída de peso de lesión cerebral traumática leve, (2) evaluación del flujo sanguíneo cerebral con espectroscopia de correlación difusa, (3) cuantificación del entorno neuroinflamatorio y (4) integración de datos (Figura 1). A continuación, proporcionamos una breve introducción a cada uno de estos pasos clave para ayudar a guiar a los lectores a través de la lógica detrás de nuestros métodos. El resto del manuscrito proporciona un protocolo detallado para cada uno de estos pasos clave.

Modelo de caída de peso de lesión cerebral traumática leve
Aunque existen muchos modelos preclínicos excelentes de LCT leve repetitiva 12,13,14,15,16,17,18, empleamos un modelo de lesión craneal cerrada por caída de peso bien establecido y clínicamente relevante. Las características clave de este modelo incluyen (1) impacto contundente del cráneo / cuero cabelludo intacto seguido de una rotación sin restricciones de la cabeza alrededor del cuello, (2) ninguna lesión cerebral estructural manifiesta, edema, daño de la barrera hematoencefálica, muerte celular aguda o pérdida crónica de tejido cerebral, y (3) déficits cognitivos persistentes (hasta 1 año) que surgen solo después de múltiples golpes¹⁹ (Figura 2)..

Evaluación del flujo sanguíneo cerebral con espectroscopia de correlación difusa
La espectroscopia de correlación difusa (EDC) es una técnica óptica no invasiva que mide el flujo sanguíneo ^5,20,21. En DCS, se coloca una fuente de luz infrarroja cercana en la superficie del tejido. Se coloca un detector a una distancia fija de la fuente en la superficie del tejido para detectar la luz que se ha multiplicado dispersa a través del tejido (Figura 3). La dispersión de los glóbulos rojos en movimiento hace que la intensidad de la luz detectada fluctúe con el tiempo. Se utiliza un modelo analítico simple conocido como teoría de difusión de correlación para relacionar estas fluctuaciones de intensidad con un índice de flujo sanguíneo (CBF_i, Figura 4). Aunque las unidades de CBF_i (cm²/s) no son las unidades tradicionales de flujo (mL/min/100 g), un estudio previo en ratones ha demostrado que CBF_i se correlaciona fuertemente con el flujo sanguíneo cerebral medido por espín arterial marcado como MRI²¹.

Como referencia, el instrumento DCS utilizado aquí se construyó internamente y se compone de un láser de longitud de coherencia de 852 nm de largo, una matriz de fotodiodos de avalancha de conteo de fotones y una placa autocorreladora de hardware (tau único, 8 canales, tiempo de muestra mínimo de 100 ns)^21,22. Los datos se adquieren con software casero escrito en LabView. La interfaz animal para el dispositivo consiste en una fibra de fuente multimodo de 400 μm (rango de longitud de onda de 400-2200 nm, núcleo de sílice puro, revestimiento duro TECS) y una fibra detectora monomodo de 780 nm (rango de longitud de onda de 780-970 nm, núcleo de sílice pura, revestimiento duro TECS, corte de modo segundo de 730 ± 30 nm) espaciada a 6 mm de distancia e incrustada en un sensor impreso en 3D negro (4 mm x 8 mm, Figura 3).

Cuantificación del entorno neuroinflamatorio
Aunque la neuroinflamación está regulada por diversos procesos celulares, dos mecanismos clave relevantes son la señalización extracelular por citoquinas / quimiocinas y la señalización intracelular por fosfoproteínas. Para investigar el entorno neuroinflamatorio del cerebro después de la lesión, los cerebros se extraen de ratones, se microdisectan, y las citoquinas / quimiocinas y fosfoproteínas se cuantifican utilizando Luminex (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Los inmunoensayos multiplexados de Luminex permiten la cuantificación simultánea de una colección diversa de estas proteínas mediante el acoplamiento de ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) a perlas magnéticas marcadas fluorescentemente. Se utilizan distintas etiquetas fluorescentes para cada proteína de interés, y las perlas de cada etiqueta se funcionalizan con un anticuerpo de captura contra esa proteína en particular. Cientos de cuentas para capturar cada proteína se mezclan, se colocan en una placa de 96 pocillos y se incuban con la muestra. Después de la incubación de la muestra, se utiliza un imán para atrapar las cuentas en el pozo mientras se lava la muestra. A continuación, el anticuerpo de detección biotinilado se une al analito de interés para formar un sándwich anticuerpo-antígeno similar a un ELISA tradicional, pero con el ELISA para cada proteína que ocurre en una cuenta diferente marcada fluorescentemente. La adición de estreptavidina conjugada con ficoeritrina (SAPE) completa cada reacción. El instrumento Luminex luego lee las cuentas y separa la señal de acuerdo con cada etiqueta fluorescente / proteína.

Integración de datos
Debido a la gran cantidad de analitos (por ejemplo, citoquinas) medidos en el ensayo Luminex, el análisis de datos puede ser difícil de interpretar si cada proteína cuantificada se analiza individualmente. Para simplificar el análisis y capturar las tendencias observadas entre los analitos, utilizamos un método de análisis multivariante llamado regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR, Figura 8)²³. PLSR funciona identificando un eje de pesos correspondientes a cada proteína medida (es decir, citoquinas o fosfoproteínas, denominadas "variables predictoras") que juntas explican de manera óptima la covarinancia de las proteínas medidas con una variable de respuesta (por ejemplo, flujo sanguíneo cerebral). Los pesos se conocen como "cargas" y se ensamblan en un vector conocido como variable latente (LV). Al proyectar (denominado "puntuación") los datos de proteínas medidos en cada uno de los dos LC, los datos se pueden volver a trazar en términos de estos LC. Después de calcular el PLSR, utilizamos una rotación varimax para identificar un nuevo VI que maximiza la covarianza entre las proyecciones de la muestra sobre el VI y la variable^{predictora 24}. Este enfoque nos permite definir LV1 como el eje para el que se explica mejor la varianza de la variable de respuesta. LV2 maximiza la covarinancia entre la variable de respuesta y los datos residuales de LV1, que pueden estar asociados con la variabilidad biológica o técnica entre muestras. Por último, llevamos a cabo una validación cruzada Leave One Out (LOOCV) para garantizar que el modelo PLSR no dependa en gran medida de ninguna muestra²³.

En este protocolo, detallamos los métodos para caracterizar la respuesta del tejido neuroinflamatorio y hemodinámico a mTBI. El flujo de trabajo general se describe en la Figura 1. En este protocolo, los ratones están sujetos a uno o más mTBIs utilizando un modelo de lesión en la cabeza cerrada por caída de peso. El flujo sanguíneo cerebral se mide longitudinalmente antes y en múltiples puntos de tiempo después de la lesión. En el momento del punto de interés para el interrogatorio de los cambios neuroinflamatorios, el animal es sacrificado y se extrae el cerebro. Las regiones cerebrales de interés se aíslan a través de la microdisección y luego se lisan para extraer proteínas. Los lisados se utilizan tanto para los inmunoensayos multiplexados Luminex de citoquinas y expresión de fosfoproteínas como para Western blot. Finalmente, este conjunto de datos holístico se integra utilizando un análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory (IACUC) y siguieron las Pautas de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Modelo de caída de peso de lesión cerebral traumática leve

1. Prepare la configuración de caída de peso. Monte una vise en una superficie plana con un tubo guía de 1 m (2,54 cm de diámetro interior) alineado verticalmente (verifique con un nivel). Utilice un perno de 54 g (diámetro básico del cuerpo de 0,95 cm, diámetro de la cabeza de 2 cm, longitud de 10,2 cm) para el impacto.
2. Anestesia brevemente el ratón. Inducir al ratón con 4,5% de isoflurano en oxígeno al 100% durante 45 segundos. Confirme la profundidad suficiente de la anestesia por la falta de una respuesta de pellizco en el dedo del pie.
3. Inducir lesiones.
   1. Retire rápidamente al ratón de la anestesia y coloque el ratón propenso en el centro de una membrana delgada (tejido de 11,2 cm x 21,3 cm).
   2. Use ambas manos para sostener el tejido tenso con el ratón prono en el centro. Asegure la cola del ratón bajo el pulgar. Coloque la cabeza del ratón debajo del tubo guía (Figura 2).
   3. Deje caer el perno desde la parte superior del tubo guía sobre el aspecto dorsal de la cabeza del ratón, con el objetivo de impactar entre la parte posterior de los ojos y la parte frontal de las orejas. Tras el impacto, el ratón penetrará en el tejido, lo que permitirá una rápida aceleración de la cabeza alrededor del cuello (Figura 2).
4. Recuperación
   1. Después del impacto, coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla de calentamiento de 37 ° C en el aire de la habitación. Monitoree la recuperación durante 1 h después de la lesión. Dentro de 1 h, los ratones deben poder deambular normalmente, encontrar comida y agua, y no exhibir déficits motores brutos.
      NOTA: La analgesia no se utiliza según la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, lo que se justifica debido a la influencia confusa de la analgesia en los parámetros de interés (es decir, flujo sanguíneo cerebral, marcadores de inflamación). La pérdida del conocimiento, definida como el tiempo desde la extracción de la anestesia hasta el tiempo para recuperar el reflejo de enderezamiento, se espera y generalmente dura de 20 s a 3 minutos (Tabla suplementaria 1). Se pueden observar episodios breves (<30 s) de apnea y / o actividad similar a las convulsiones, particularmente después de lesiones repetitivas en la cabeza espaciadas una vez al día.
5. Repita según sea necesario. Esta lesión se puede repetir una vez al día, semanalmente o mensualmente. El número y el espaciamiento de las lesiones dependen de la gravedad deseada de la lesión. Por lo general, empleamos cinco golpes espaciados una vez al día para inducir déficits robustos en el aprendizaje espacial y la memoria.
   NOTA: Estudios anteriores han demostrado que cinco golpes espaciados una vez al día son suficientes para inducir déficits en el aprendizaje espacial y la memoria que duran más de 1 año después de la lesión sin edema, hemorragia o lesión estructural manifiesta en el cerebro¹⁹. Los ratones son pesados diariamente y monitoreados de cerca para detectar signos de deshidratación, déficits motores y pérdida de apetito. Si están deshidratados, los ratones reciben chow húmedo y una inyección subcutánea de 1 ml de solución salina una vez al día. Con el fin de evitar el sufrimiento innecesario y garantizar un punto final humanitario, los ratones son sacrificados si: la deshidratación persiste o empeora >24 h después del tratamiento salino subcutáneo, el peso corporal disminuye en más del 20% desde el inicio previo a la lesión, aparecen déficits motores como dar vueltas o arrastrar las patas y persisten >1 h después de la lesión.

2. Evaluación del flujo sanguíneo cerebral con espectroscopia de correlación difusa

1. Adquisición de datos DCS
   1. Eliminar el vello en el cuero cabelludo. Debido a que DCS funciona mejor en ausencia de vello, es necesario eliminar el pelaje en la cabeza antes del inicio de los experimentos. Por lo general, la depilación se realiza 1-3 días antes del inicio del estudio.
      1. Inducir ratones con 4,5% de isoflurano en oxígeno al 100% durante 45 segundos y mantener con 1-2% de isoflurano en oxígeno al 100%.
      2. Afeitarse la cabeza entre los ojos y las orejas. Luego, use crema depilatoria para eliminar el pelaje en la cabeza como en la Figura 3.
      3. Permita que el animal se recupere de la anestesia en una almohadilla de calentamiento y luego regrese a la jaula.
   2. Medir el flujo sanguíneo cerebral con DCS. Para minimizar los artefactos de movimiento durante la medición, estudie ratones bajo anestesia breve de isoflurano.
      NOTA: Monitoree visualmente la respiración y la respuesta al pellizco del dedo del pie a lo largo de las mediciones y ajuste la concentración de isoflurano según sea necesario para garantizar una profundidad constante de la anestesia. Variaciones significativas en la profundidad de la anestesia podrían alterar el flujo sanguíneo dados los efectos vasomoduladores conocidos del isoflurano²⁵.
      1. Inducir con 4.5% de isoflurano en 100% de oxígeno durante 45 segundos, y luego mantener con 1.0-1.75% de isoflurano en 100% de oxígeno. Confirme la profundidad suficiente de la anestesia por la ausencia de una respuesta de pellizco en el dedo del pie y la respiración normal (entre ~ 60-80 respiraciones por minuto).
      2. Después de un período de estabilización de 2 minutos, apoye suavemente el sensor DCS sobre el hemisferio derecho de modo que el borde superior del sensor óptico se alinee con la parte posterior del ojo y el lado del sensor se alinee a lo largo de la línea media (Figura 3). Coloque una mano sobre el sensor para protegerse de la luz de la habitación. Adquirir 5 segundos de datos (adquisición de 1 Hz).
      3. Reposicione el sensor sobre el hemisferio izquierdo y adquiera 5 segundos de datos.
      4. Repita 3 veces/hemisferio para tener en cuenta las heterogeneidades locales debajo de la superficie del tejido.
   3. Recuperación
      1. Retire el ratón de la anestesia y colóquelo en una almohadilla de calentamiento.
      2. Después de que el ratón recupere su reflejo de enderezamiento, devuélvalo a la jaula.
2. Análisis de datos DCS
   1. Realizar el control de calidad inicial. Cada fotograma de datos DCS consiste en una función de autocorrelación de intensidad normalizada medida (Figura 4A) y una tasa de recuento de fotones (kHz).
      1. Para eliminar fotogramas de datos con un artefacto de movimiento significativo, descarte los fotogramas de datos para los que el valor medio de la cola de la curva (es decir, ) sea > 1,005.
      2. Para eliminar fotogramas de datos con una relación señal-ruido deficiente, descarte los fotogramas de datos si la velocidad de recuento de fotones detectada es de < 20 kHz.
   2. Extraer el índice de flujo sanguíneo cerebral. Usando fminsearch en Matlab, ajuste cada i^ésimo marco de datos medido para CBF_i(i). Restrinja los ajustes a , y encuentre el valor de CBF_i que minimiza la siguiente función de costo:
      
      Donde la suma es sobre todos los tiempos de retardo medidos, y es la solución homogénea semi-infinita de la ecuación de difusión de correlación (Figura 4B):
      
      Aquí β es un factor de coherencia determinado por la configuración experimental, , , , , , R_eff = 0.493 para un índice tisular supuesto de refracción de 1.4, ρ es 6 mm, y μ a y μ son la absorción y el coeficiente de dispersión reducido _del tejido (se supone que es 0.25 y 9.4 / cm, respectivamente^10,26,27).
      NOTA: Debido a que β puede variar ~ 10% con el tiempo, ajuste cada marco de datos para β y CBF_i simultáneamente.
   3. Realizar control de calidad secundario. Dentro de cada repetición (que consta de 5 marcos de datos), descarte los valores atípicos. Los valores atípicos se definen como aquellos valores de CBF_i que caen fuera de 1,5 desviaciones estándar de la media CBF_i para esa repetición. Si se identifica más de 1 punto de datos como un valor atípico, descarte toda la repetición.
   4. Estimar el índice promedio de flujo sanguíneo cerebral: Estimar un CBF_i promedio por hemisferio tomando la media en todos los marcos de datos para todas las repeticiones (Figura 4C). Si no se observan diferencias hemisféricas significativas, promediar entre hemisferios para obtener una estimación del promedio global de CBF_i.

3. Cuantificación multiplexada de citoquinas y fosfoproteínas mediante ensayos de luminex

1. Extracción de tejidos
   NOTA: La cuantificación de citoquinas cerebrales y proteínas de fosfo-señalización utilizando Luminex requiere extracción de tejido.
   1. Anestesiar al ratón utilizando 4,5% de isoflurano en oxígeno al 100% durante 1-2 min. Verifique si hay un plano profundo de anestesia a través de la falta de una respuesta de pellizco en el dedo del pie. Eutanasia a través de la decapitación.
   2. Cosecha el tejido.
      1. Extirpar el cerebro. Por lo general, fije el hemisferio izquierdo para la histología y microdisecte varias regiones del hemisferio derecho dentro de la corteza y el hipocampo (Figura 5).
      2. Coloque las muestras disecadas en tubos de microcentrífuga, congele flash en nitrógeno líquido. Para el análisis de proteínas sensibles a la congelación, es óptimo subdividir las secciones de tejido antes de la congelación instantánea para evitar la congelación y descongelación posterior.
         NOTA: El protocolo se puede pausar y las muestras de tejido se pueden almacenar a -80 °C hasta que estén listas para lisar las muestras. Alternativamente, las muestras pueden lisarse y luego almacenarse a -80 ° C.
   3. Muestras de Lyse.
      1. Prepare el tampón de lisis agregando inhibidor de la proteasa y fluoruro de fenilmetilsulfonilo de 2 mM al tampón de lisis.
      2. Añadir 150 μL del tampón de lisis mixta por aproximadamente 3 μg de tejido animal. Como referencia, las muestras de tejido de la corteza visual del ratón son de aproximadamente 3 μg.
      3. Para homogeneizar el tejido, triture mecánicamente el tejido mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo ~ 15-20 veces usando una pipeta de 1000 μL. Para una trituración óptima de la muestra, se puede utilizar un mortero homogeneizador.
      4. Coloque los tubos de muestra en un rotador durante 30 minutos a 4 °C.
      5. Centrifugar las muestras a 4°C durante 10 min a aproximadamente 15.000 x g, y recoger el sobrenadante. Las muestras pueden procesarse inmediatamente o almacenarse a -80 °C para su posterior análisis.
         NOTA: Los lisados de muestra preparados con este protocolo son compatibles con Western blot, a partir del cual se puede analizar el marcador de fagocitos/microgliales Iba1 y/o el marcador de activación de astrocitos GFAP para complementar el análisis de citoquinas y fosfoproteínas para estudios de neuroinflamación¹¹.
2. Protocolo de inmunoensayo multiplex para citoquinas y fosfoproteínas
   NOTA: Aunque similar en general, hay algunas diferencias menores en los protocolos para los kits de citoquinas y fosfoproteínas. Las diferencias se notan en cada paso. Los pasos para preparar muestras para el ensayo Luminex se describen a continuación.
   1. Preparación de reactivos (día 1, igual para citoquinas y fosfoproteínas)
      1. Permita que los reactivos se calienten a temperatura ambiente (~ 30 min).
      2. Sonicate multiplex botella de perlas magnéticas durante 30 segundos seguido de 1 min de vórtice. Asegúrese de que las perlas magnéticas multiplex estén protegidas de la luz con papel de aluminio o use botellas protectoras de luz proporcionadas.
      3. Prepare el tampón de lavado mezclando 0.1% Tween20 en 1xPBS o, alternativamente, use el tampón de lavado proporcionado en el kit.
   2. Preparación de muestras de tejido lisado (día 1, igual para citoquinas y fosfoproteínas)
      1. Si previamente está congelado, retire las muestras de tejidos lisados del congelador y deje que se descongelen en hielo (~ 20 min). Muestras de centrífuga durante 10 min a 9.167 x g para eliminar el precipitado.
      2. Preparar 25 μL de muestra a la concentración óptima de proteínas determinada por el análisis de rango lineal (ver sección 3.3). Para normalizar el volumen total de todas las muestras, diluya las muestras en el tampón de ensayo proporcionado en el kit.
   3. Preparación de la placa de 96 pocillos (día 1, igual para citoquinas y fosfoproteínas)
      1. Use la placa de 96 pocillos incluida en el kit o una con un fondo delgado (por ejemplo, Brand Tech).
      2. Agregue 200 μL de tampón de lavado (o 1x PBS, 0.1% Tween) en cada pozo y mezcle en el agitador de placas durante 10 min a 750 rpm.
      3. Decanta el tampón de lavado y golpea el plato con una toalla de papel para eliminar los residuos.
   4. Procedimiento de inmunoensayo para citoquinas (día 1)
      1. Agregue lo siguiente a cada pozo en orden.
         1. Añadir 25 μL de tampón de ensayo a todos los pocillos.
            1. Agregue 25 μL de tampón de ensayo adicional SOLO a los pozos de fondo. Para cada ejecución experimental, tenga al menos dos pozos de fondo. Los pozos de fondo no tienen muestra cargada y definen la intensidad fluorescente leída por el instrumento sin muestra.
            2. Añadir 25 μL de cada muestra diluida a los pocillos de muestra correspondientes.
            3. Agregue 25 μL de 1x cuentas magnéticas multiplex a todos los pozos (Figura 6). Asegúrese de vórtice las cuentas durante 1 minuto antes de agregarlas a los pozos.
      2. Selle la placa con sellador de placas y cubra la placa con papel de aluminio. Incubar durante la noche (12-16 h) a 2-8 °C.
   5. Procedimiento de inmunoensayo para citoquinas (día 2)
      1. Coloque la placa de 96 pocillos en el separador magnético, asegurándose de que los pozos estén alineados con los imanes. Dejar reposar durante 2 min. Decantar el contenido del pozo mientras la placa todavía está unida al separador magnético.
      2. Lave la placa 2 veces siguiendo los siguientes pasos.
         1. Agregue 200 μL de tampón de lavado a cada pozo y colóquelo en el agitador durante 2 minutos a temperatura ambiente.
         2. Coloque la placa del pozo en el separador magnético durante 2 minutos a temperatura ambiente.
         3. Decantar el contenido del pozo mientras la placa del pozo todavía está unida al separador magnético.
      3. Añadir 25 μL de anticuerpo de detección por pocillo (Figura 6). Cubrir con papel de aluminio. Incubar durante 1 hora en un agitador de placas (750 rpm) a temperatura ambiente.
      4. Deje el anticuerpo de detección y agregue 25 μL de estreptavidina-ficoeritrina (SAPE) a cada pocillo (Figura 6). Cubrir con papel de aluminio. Incubar durante 30 min en un agitador de placas (750 rpm) a temperatura ambiente.
      5. Coloque la placa del pozo en un separador magnético y deje reposar durante 2 minutos. Decantar el contenido del pozo y separarlo del separador magnético.
      6. Lave bien la placa dos veces (véase el paso 3.2.5.2).
      7. Agregue 75 μL de luminex Drive Fluid (si utiliza el instrumento MAGPIX) a cada pozo o búfer de ensayo (si utiliza 200 o un instrumento FlexMap 3D). Vuelva a suspender las perlas en el agitador de placas durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      8. Lea en Luminex Instrument (MAGPIX, 200 o FlexMap 3D), haciendo referencia al manual del usuario para su correcto funcionamiento (Figura 6).
   6. Procedimiento de inmunoensayo para fosfoproteínas (día 1)
      1. Agregue lo siguiente a cada pozo en orden.
         1. Añadir 25 μL de tampón de ensayo a todos los pocillos.
            1. Agregue 25 μL de tampón de ensayo adicional SOLO a los pozos de fondo. Para cada ejecución experimental, se recomienda tener al menos dos pozos de fondo. Los pozos de fondo no tienen muestra cargada y definen la intensidad fluorescente leída por el instrumento sin muestra.
            2. Añadir 25 μL de cada muestra diluida a cada pocillo de muestra.
            3. Agregue 25 μL de 1x cuentas magnéticas multiplex a todos los pozos (Figura 6).
               NOTA: El kit de ensayo Luminex proporciona perla magnética multiplex en solución madre 20x. Asegúrese de vórtice 20x de la solución de perla magnética multiplex de stock durante 2 minutos, y luego diluirla en tampón de ensayo a 1x solución. Suspensión de perla magnética Vortex 1x multiplex durante 1 minuto antes de agregar a los pozos.
         2. Selle la placa con sellador de placas y cubra la placa con papel de aluminio. Incubar durante la noche (12-16 horas) a 2-8 °C.
   7. Procedimiento de inmunoensayo para fosfoproteínas (día 2)
      1. Coloque la placa del pozo en un separador magnético, asegurándose de que la placa del pozo esté completamente alineada con el separador magnético. Dejar reposar durante 2 min. Decantar el contenido del pozo mientras la placa del pozo todavía está unida al separador magnético.
      2. Lavar la placa 2 veces (ver paso b en el procedimiento de inmunoensayo de citoquinas día 2).
      3. Diluya el anticuerpo de detección de stock 20x a 1x solución en tampón de ensayo. Añadir 25 μL de 1 anticuerpo de detección por pocillo (Figura 6). Cubrir con papel de aluminio. Incubar durante 1 h en un agitador de placas (750 rpm) a temperatura ambiente.
      4. Coloque la placa de 96 pocillos en el separador magnético y déjela reposar durante 2 minutos. Decantar el contenido del pozo, separarlo del separador magnético.
      5. Diluya 25x SAPE de stock en buffer de ensayo a 1x buffer. Agregue 25 μL de 1x SAPE (Figura 6). Cubrir con papel de aluminio e incubar durante 15 min en el agitador de placas (750 rpm) a temperatura ambiente.
      6. Deje el SAPE en los pozos y agregue 25 μL de búfer de amplificación a cada pozo. Cubrir con papel de aluminio.
      7. Incubar durante 15 min en un agitador de placas (750 rpm) a temperatura ambiente.
      8. Coloque la placa del pozo en el separador magnético durante 2 min. Decantar el contenido del pozo y desprenderse del separador magnético.
      9. Agregue 75 μL de luminex Drive Fluid (si utiliza el instrumento MAGPIX) o un búfer de ensayo (si utiliza 200 o un instrumento FlexMap 3D). Vuelva a suspender las perlas en un agitador de placas durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      10. Lea el instrumento Luminex (MAGPIX, 200 o FlexMap 3D), haciendo referencia al manual del usuario para su correcto funcionamiento (Figura 6).
3. Linealidad de la curva de dilución de la muestra
   1. Preparación de muestras: Diluir en serie muestras de prueba con diferente concentración de proteína total. Para los tejidos cerebrales a granel, cargue diluciones en serie de 0-25 μg para las citoquinas y 0-12 μg para las fosfoproteínas. La concentración total de proteínas se puede medir mediante el ensayo de ácido bicinconónico (BCA).
   2. Inmunoensayo multiplex: Realizar el ensayo Luminex (ver sección 3.2) en muestras seleccionadas.
   3. Análisis de datos
      1. Trazar la intensidad fluorescente para cada proteína frente a la cantidad de proteína cargada (Figura 7).
      2. Para cada analito, identifique el rango de proteína total cargada para el cual la relación entre la proteína total y la lectura de intensidad fluorescente es lineal (Figura 7).
      3. Para determinar la cantidad de proteína total que debe cargarse para la ejecución completa del ensayo, identifique la porción lineal de la curva para cada analito y luego seleccione una concentración de proteína que se encuentre dentro del rango lineal para la mayoría de los analitos.
         NOTA: Aunque la mayoría de las proteínas comparten un rango lineal similar, los rangos lineales pueden no superponerse para todas las proteínas. Si este es el caso, puede ser necesario ejecutar cada muestra varias veces con diferentes cantidades de proteína total cargada. Alternativamente, las muestras no lineales pueden quedar fuera del análisis. Además, algunas proteínas pueden no tener un rango lineal en absoluto.

4. Regresión parcial de mínimos cuadrados

NOTA: Se proporciona un código R de ejemplo y una hoja de cálculo de datos de muestra para llevar a cabo el análisis parcial de mínimos cuadrados.

1. Preparación de datos: Formatee los datos como se muestra en la hoja de cálculo de datos de muestra proporcionada, "MyData". Incluya nombres de variables en la fila 1, nombres de ejemplo en la columna A, la variable de respuesta en la columna B y todas las variables predictoras en las columnas C+. Rellene las dos últimas filas con los datos de fondo y establezca ambos nombres de ejemplo en "Fondo".
2. Regresión parcial de mínimos cuadrados en RStudio
   1. Instale R desde www.r-project.org (gratis, de código abierto).
   2. Instale RStudio Desktop desde www.rstudio.com (licencia gratuita de código abierto).
   3. Descargue el código R de ejemplo proporcionado con esta publicación, "PLSR_Sample_Code.R" y guárdelo en la misma carpeta que contiene la hoja de cálculo de datos. Abra el archivo de código en RStudio.
   4. En la sección Entrada de usuario , cambie "dataFileName" por el nombre de la hoja de cálculo de datos.
   5. Lleve a cabo los siguientes pasos resaltando la sección de código que se va a ejecutar y haciendo clic en Ejecutar en la esquina superior derecha del script.
      1. Cargue los paquetes de R necesarios, las funciones, la dirección del directorio de trabajo y los valores de entrada del usuario en RStudio (subsección "Preliminares").
      2. Cargue los datos en RStudio y prepare los datos sin procesar para su procesamiento restando la señal de fondo media de todas las mediciones y anotando z cada analito (subsección "Leer datos y restar fondo")(Figura 8A).
      3. Realice la regresión parcial de mínimos cuadrados en RStudio utilizando el paquete plsRglm v1.2.5²⁸ disponible en Comprehensive R Archive Network (CRAN). Realizar una rotación varimax (paquete de estadísticas v3.6.2)²³ en el plano LV1-LV2 para identificar un nuevo eje horizontal que mejor separe las muestras por la variable de respuesta (subsección "PLS")(Figura 8B).
      4. Realice una validación cruzada Leave One Out (LOOCV) en la que una muestra se deja iterativamente fuera de los datos y se vuelve a calcular el modelo PLSR. Calcular la desviación estándar para las cargas de analitos en todas las ejecuciones de LOOCV (subsección "LOOCV").
3. Crear gráficos representativos: Ejecute el código de ejemplo proporcionado como se detalla anteriormente para crear gráficos representativos que se exporten automáticamente como archivos pdf al directorio de trabajo (la carpeta que contiene los datos y los archivos de código).
   1. Cree un mapa de calor de los datos procesados como se muestra en la Figura 8A (subsección "PLS"). Colorea cada entrada a lo largo de un espectro definido por z-score. Ordenar los analitos por el orden calculado en la variable latente de interés.
   2. Cree un gráfico de puntuaciones con puntuaciones LV1 trazadas a lo largo del eje horizontal y puntuaciones LV2 trazadas a lo largo del eje vertical, como se muestra en la Figura 8B (subsección "PLS"). Coloree cada punto de datos de acuerdo con su medición de variables de respuesta para visualizar la relación entre cada variable latente y la variable de respuesta.
   3. Cree un gráfico de barras que muestre las cargas de cada una de las variables predictoras para visualizar cómo cada analito contribuye a las variables latentes, como se muestra en la Figura 8C (subsección "LOOCV").
   4. Cree un gráfico que retroceda las puntuaciones LV1 con respecto a su variable de respuesta para visualizar qué tan bien el modelo PLSR separa las muestras, como se muestra en la Figura 8D (subsección "PLS").

Resultados

Los datos recopilados previamente se tomaron de trabajos previos en los que un grupo de ocho ratones C57BL/6 fueron sometidos a tres lesiones de cabeza cerrada (Figura 2) espaciadas una vez al día¹¹. En este trabajo, el flujo sanguíneo cerebral se midió con espectroscopia de correlación difusa 4 h después de la última lesión (Figura 3, Figura 4). Después de la evaluación de CBF posterior a la lesión, los anim...

Discusión

A continuación detallamos los métodos para la evaluación de la respuesta hemodinámica y neuroinflamatoria a la lesión cerebral traumática leve repetitiva. Además, hemos demostrado cómo integrar estos datos como parte de un análisis de sistemas multivariante utilizando la regresión parcial de mínimos cuadrados. En el texto a continuación discutiremos algunos de los pasos clave y limitaciones asociadas con el protocolo, así como las ventajas / desventajas de los métodos sobre los métodos existentes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipetas ajustables			cualquier pipeta ajustable
Papel de aluminio	VWR	89107-726
Bio-Plex kit de lisis celular	C Bio-Rad	171304012
BRANDplates microplacas pureGrade, no estériles	BrandTech	781602 96
Mini comprimido inhibidor de proteasa completo	Sigma-Aldrich	11836153001
Crema depilatoria	Amazon	Nair
DiH2O	VWR	VWRL0200-1000
Bloque separador magnético de mano para placas de fondo plano de 96 pocillos	Catálogo Millipore Sigma	40-285
Tablero de autocorrelador de hardware	www.correlator.com	Flex05-8ch
Isoflurano 250 mL	MED-VET INTERNATIONAL	RXISO-250
Kimwipe (11,2 x 21,3 cm)	VWR	21905-026
Mezclador de vórtice de laboratorio	VWR	10153-838
LabView	National Instruments	LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D o MAGPIX con software xPONENT	Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid	Luminex	MPXDF-4PK
Fluido de vaina Luminex	EMD Millipore	SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Panel de perlas magnéticas de citocinas/quimiocinas de ratón - Premezclado 32 Plex - Ensayo Multiplex de Inmunología	Millipore Sigma	MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Señalización 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay	Millipore Sigma	48-660MAG
Mini LabRoller	rotador VWR	10136-084
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo	Sigma-Aldrich	P7626-1G
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	VWR	97064-158
Sellador de placas	VWR	82050-992
Tubos de microfuga de polipropileno	VWR	20901-547
Mini LabRoller	Millipore Sigma	Z674591
Depósitos de reactivos	VWR	89094-668
R Lenguaje
RStudio	www.rstudio.com
Sonicator Agitador
placas de titulación	VWR	12620-926
Tween20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Tubo guía acrílico de 1 m	McMaster-Carr	49035K85
fotodiodo de avalancha de conteo de 4 fotones	Perkin-Elmer	SPCM-AQ4C-IO
400 mmm fibra de fuente multimodo	Thorlabs Inc.	FT-400-EMT
Perno de 54 g	Ace Hardware		0,95 cm diámetro del cuerpo básico, 2 cm de diámetro de la cabeza, 10,2 cm de longitud
780 nm fibra detectora monomodo	Thorlabs Inc.	780HP
852 nm	TOPTICA Photonics	iBeam smart