Una pantalla supresora para la caracterización de los vínculos genéticos que regulan la vida cronológica en Saccharomyces cerevisiae

Resumen

Aquí hay un protocolo para identificar interacciones genéticas a través de una mayor pantalla supresora de número de copia en Saccharomyces cerevisiae. Este método permite a los investigadores identificar, clonar y probar supresores en mutantes de levadura de corta duración. Probamos el efecto del aumento del número de copia de SIR2 en la vida útil en un mutante nulo de autofagia.

Resumen

El envejecimiento es el deterioro dependiente del tiempo de los procesos biológicos normales de un organismo que aumenta la probabilidad de muerte. Muchos factores genéticos contribuyen a las alteraciones en el proceso normal de envejecimiento. Estos factores se cruzan de maneras complejas, como lo demuestra la riqueza de enlaces documentados identificados y conservados en muchos organismos. La mayoría de estos estudios se centran en mutantes nulos con pérdida de función que permiten la detección rápida de muchos genes simultáneamente. Hay mucho menos trabajo que se centra en caracterizar el papel que la sobreexpresión de un gen en este proceso. En el presente trabajo, presentamos una metodología sencilla para identificar y clonar genes en la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae,para el estudio en la supresión del fenotipo cronológico de corta duración observado en muchos orígenes genéticos. Este protocolo está diseñado para ser accesible a investigadores de una amplia variedad de orígenes y en diversas etapas académicas. El gen SIR2, que codifica para una deacetilasa histona, fue seleccionado para clonar en el vector pRS315, ya que ha habido informes contradictorios sobre su efecto en la vida cronológica. SIR2 también desempeña un papel en la autofagia, que resulta cuando se interrumpe a través de la eliminación de varios genes, incluyendo el factor de transcripción ATG1. Como prueba de principio, clonamos el gen SIR2 para realizar una pantalla supresora en el fenotipo de vida útil acortado característico del mutante atg1 é de autofagia deficiente y lo comparamos con un fondo genético de tipo salvaje isogénico.

Introducción

El envejecimiento es la pérdida de integridad dependiente del tiempo en innumerables procesos biológicos que, en última instancia, aumenta la probabilidad de muerte del organismo. El envejecimiento es casi inevitable para todas las especies. A nivel celular hay varias señas de identidad bien caracterizadas que se asocian con el envejecimiento, incluyendo: inestabilidad genómica, alteraciones epigenéticas, pérdida de proteostasis, disfunción mitocondrial, detección de nutrientes desregulada, senescencia celular, y desgaste de los telómeros^1,2. En organismos unicelulares, como las levaduras, esto conduce a una reducción del potencial replicativo y la vida cronológica^{de 3,4}. Estos cambios celulares se manifiestan en organismos más complejos, como los seres humanos, como patologías que incluyen cánceres, insuficiencia cardíaca, neurodegeneración, diabetes, y osteoporosis^5,6,7. A pesar de las muchas complejidades que caracterizan el proceso de envejecimiento, hay conservación de estas señas de identidad moleculares subyacentes a este proceso a través de organismos ampliamente divergentes^8,,9,,10. La identificación de las alteraciones de estas vías durante el envejecimiento llevó a la comprensión de que pueden ser manipuladas a través de cambios en el estilo de vida – restricción dietética se muestra para extender sustancialmente la vida útil en muchos organismos¹¹. Estos caminos convergen y se cruzan entre sí y muchos otros caminos, de maneras complejas. La elucidación y caracterización de estas interacciones ofrece un potencial de intervenciones terapéuticas para prolongar la vida útil y la salud^12,13,14.

La conservación de los fundamentos moleculares del envejecimiento permite la disección funcional de las interacciones genéticas subyacentes al proceso mediante el uso de organismos modelo más simples, incluso en la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Hay dos tipos establecidos de envejecimiento modelados por levaduras en ciernes: envejecimiento cronológico (la vida cronológica, CLS) y envejecimiento replicativo (la vida útil replicativa, RLS)¹⁷. El envejecimiento cronológico mide la cantidad de tiempo que una célula puede sobrevivir en un estado no divisorio. Esto es análogo al envejecimiento que se ve en las células que pasan la mayor parte de su vida en G_0,como las neuronas⁴. Alternativamente, la vida útil replicativa es el número de veces que una celda puede dividir antes del agotamiento y es un modelo para los tipos de celdas mitolíticamente activos (por ejemplo, el número de células hijas que puede tener una celda)¹⁸.

El objetivo general de este método es presentar un protocolo que permita la disección funcional de la genética del envejecimiento utilizando S. cerevisiae. Si bien ha habido muchos estudios excelentes realizados por muchos investigadores que han llevado a nuestra comprensión actual, quedan muchas oportunidades disponibles para que los investigadores en ciernes contribuyan al campo del envejecimiento desde el principio de su carrera académica. Presentamos una metodología clara que permitirá a los investigadores seguir avanzando en el campo del envejecimiento. Este protocolo está diseñado para ser accesible para todos los investigadores independientemente de la etapa de su carrera académica proporcionando las herramientas necesarias para formular y probar sus propias hipótesis novedosas. La ventaja de nuestro enfoque es que este es un método rentable fácilmente accesible para todos los investigadores independientemente de la institución – y no requiere equipos costosos y especializados necesarios para algunos protocolos¹⁹. Hay varias maneras diferentes de diseñar este tipo de pantalla, el enfoque descrito en este trabajo es particularmente susceptible de detección de mutantes nulos de genes no esenciales que exhiben una severa reducción en la vida cronológica en comparación con una cepa de levadura de tipo salvaje isogénico.

Como nuestra prueba de principio, clonamos SIR2, una deacetilasa de lisina reportada como exhibiendo un CLS extendido y acortado cuando está sobreexpresado. Recientemente se encontró que la sobreexpresión de SIR2 aumenta el CLS en las levaduras vitivinícolas; sin embargo, varios grupos no han comunicado ninguna relación entre la extensión SIR2 y CLS, dejando su papel bajo la caracterización^20,21,22. Debido a estos informes contradictorios en la literatura, seleccionamos este gen para agregar investigación independiente para ayudar a aclarar el papel de SIR2 en el envejecimiento cronológico, si existe. Además, el aumento del número de copia de un homólogo SIR2 prolonga la vida útil en un sistema de modelo de gusano nematodo²³.

La autofagia es un sistema de degradación intracelular para suministrar productos citosólicos, como proteínas y orgánulos, al lisosoma^24. La autofagia está íntimamente ligada a la longevidad a través de su papel en la degradación de proteínas dañadas y orgánulos para mantener la homeostasis celular²⁵. La inducción de la autofagia depende de la orquestación de la expresión de muchos genes, y la deleción del gen ATG1 da como resultado un CLS anormalmente corto en levadura en ciernes²⁶. ATG1 codifica para una proteína serina/trotónina quinasa que se requiere para la formación de vesículas en autofagia y la vía de citoplasma a vacuola (equivalente lisosomal fúngico)^27,28. Aquí, presentamos nuestro método para una pantalla de número de copia mayor, probando el efecto del aumento de la copia SIR2 en el CLS en un tipo salvaje y un fondo atg1-null. Este método es particularmente susceptible a investigadores junior y grupos de investigación en instituciones principalmente de pregrado, muchas de las cuales sirven a comunidades subrepresentadas en las ciencias y tienen recursos limitados.

Protocolo

1. Identificar posibles interacciones genéticas para el cribado

1. Identificar los antecedentes genéticos para la caracterización, que resulta en una vida cronológica anormalmente corta (CLS) en Saccharomyces cerevisiae utilizando la base de datos del genoma de Saccharomyces (la SGD, https://www.yeastgenome.org^29,30), que recopila información fenotípica conocida para este organismo.
   1. Seleccione la pestaña Función de las opciones de la parte superior de la página web.
   2. Seleccione Fenotipo seguido de seleccionar Examinar todos los fenotipos.
   3. En las opciones de Ontología de fenotipo de levadura, desplácese hasta la subpartida Desarrollo y seleccione Duración cronológica, que se encuentra en la subpartida Duración.
   4. Seleccione el calificador para la disminución,lo que permite la identificación de genes que exhiben un fenotipo que da como resultado una disminución del fenotipo cronológico de la vida útil cuando se eliminan. Para este método de prueba de método atg1 fue seleccionado, lo que resulta en un fenotipo CLS de corta duración y se interrumpe para la autofagia²⁶.
2. Identificar los genes objetivo para detectar interacciones genéticas que puedan suprimir el fenotipo, en función de los atributos ontología notificados o previstos, del mutante identificado en la parte 1.2. Repita la búsqueda de fenotipos como se encuentra en los pasos 1.1.1-1.1.4 anteriores, consultando genes que dan como resultado un CLS más largo cuando se sobreexpresan en un fondo de tipo salvaje. SIR2 se seleccionó en función del fenotipo CLS notificado y las interacciones notificadas con autofagia^31,32.

2. Preparar reactivos

NOTA: A menos que se especifique lo contrario, cada solución a 121 oC durante 20 minutos para esterilizar antes de su uso.

1. Medios líquidos YPAD: Añadir 1% Extracto de levadura, 2% Peptona, 2% Dextrosa (glucosa), y 40 mg de adenina (como sulfato de adenina deshidratado) por litro de agua destilada doble. Mezcle bien con un agitador magnético.
2. Medios líquidos LB: Añadir triptona (10 g), Extracto de levadura (5 g) y Cloruro de sodio (10 g) por litro de agua destilada doble. Mezcle bien con un agitador magnético.
3. Preparar 1000x (100 mg/ml) de ampicilina, en agua doble destilada. Mezclar bien y filtrar esterilizar.
4. Sintético completo – Medios líquidos de leucina (SC-LEU): Añadir 1,7 g de base de nitrógeno de levadura con aminoácidos, 2% glucosa, 1,92 g de mezcla de deserción SC-LEU, 5 g de sulfato de amonio por litro de agua destilada doble. Mezcle bien con un agitador magnético.
5. Tampón TE: Mezclar Tris (concentración final de 10 mM), EDTA (concentración final de 1 mM) en la solución con agua destilada doble. Mezcle bien con un agitador magnético.
6. Preparar 50% PEG 3350 en solución con agua doble destilada. Mezcle bien con un agitador magnético.
7. Preparar una solución de acetato de litio de 1 M y 100 mM con agua destilada doble. Mezcle bien con un agitador magnético.
   NOTA: Para hacer placas de agar maciza añadir 20 g de agar (por litro con agua doble destilada) a los medios preparados en 2.1 y 2.2 arriba antes del autoclavado. Si prepara las placas de ampicilina añadir 1 ml de la ampicilina a los medios en 2.2 arriba después de que se ha enfriado a aproximadamente 60 oC. Vierta en placas estériles y deje que se ajuste a 48–72 h antes de su uso. Almacene las placas a 4 oC para un almacenamiento más largo.

3. Diseñar la estrategia de clonación para clonar SIR2 en el vector pRS315

1. Diseñe imprimaciones PCR para amplificar el gen SIR2 para clonar en el vector pRS315.
   1. Diseñe imprimaciones manualmente para tener 21–22 nucleótidos de complementariedad a las regiones intergénicas aguas arriba y aguas abajo del SIR2. Asegúrese de que todo el gen, junto con las regiones no traducibles del ARNm se clone mediante la asignación de esas entidades de los datasets disponibles^33,34.
   2. Asegúrese de que el diseño de la imprimación PCR da como resultado imprimaciones hacia adelante y hacia atrás que tienen una temperatura de fusión (Tm) por encima de 53 oC y por debajo de 60 oC.
      NOTA: Idealmente, ambas imprimaciones deben tener una Tm tan cercana entre sí como la secuencia permitirá, con un contenido aproximado de GC de entre 40-50%, asegurándose de evitar las repeticiones de dinucleótidos y equilibrar la distribución GC y AT a lo largo de la secuencia.
   3. Después del diseño de las imprimaciones PCR que permitirán la generación del amplión para la clonación, añadir sitios de destino de digestión enzimática de restricción (R.E.D.) al extremo de 5' de cada imprimación que son compatibles con el vector de clonación de plásmidos. En este método, se añade un sitio de digestión de enzimas de restricción HindIII (5'-AAGCTT-3') a la imprimación ascendente, hacia delante y un sitio de digestión enzimática de restricción SacII (5'-CCGCGG-3') a la imprimación descendente y inversa.
      NOTA: El uso de los sitios SacII e HindIII requiere que el sitio de corte de consenso para cada endonucleasa no esté presente en el gen objetivo. Si cualquiera de las enzimas se dirige dentro del gen objetivo, se deben elegir enzimas de restricción alternativas. Hay muchos que son compatibles con la región de polienlacio en el vector pRS315.
   4. Por último, agregue un voladizo de secuencia de cuatro nucleótidos (5'-NNNN-3') al extremo de 5' de cada imprimación para permitir que la enzima de restricción se una y di digiere el amplón. Una vez que los imprimadores han sido diseñados, tienen los oligonucleótidos sintetizados comercialmente para clonar el gen SIR2.
   5. Resuspensión de las imprimaciones PCR: Centrifugar las imprimaciones PCR utilizando un microfug de sobremesa a la velocidad máxima durante 4 min. Añadir solución TE para hacer una concentración de stock de 100 m. Almacene la concentración de stock a -20 oC y diluya 1/10 para su uso en aplicaciones de PCR.
      NOTA: Para hacer un stock de 100 m, disolver las imprimaciones en un volumen de tampón TE estéril que es 10 veces la cantidad de nmoles en el tubo de imprimación, utilizando microlitros de TE. Por ejemplo, si el tubo contiene 15,6 nmoles de imprimación, añada 156 l de tampón TE.
2. Aislar la levadura de tipo salvaje gDNA para amplificación PCR de la construcción de clonación SIR2.
   NOTA: Varias opciones de alta calidad están disponibles comercialmente para aislar la levadura gDNA. La utilización de un kit que incluye la digestión de la pared celular fúngica con cicolyase da como resultado un gDNA de mejor calidad (mayor rendimiento, menos impurezas). El protocolo siguiente devuelve constantemente alta concentración y pureza. Los detalles de un kit que recomendamos se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
   1. Cultivar 5 ml de levadura de tipo salvaje durante 48-72 h a la fase post-log en medios enriquecidos, como YPAD. Pele el medio de las células de levadura a >800 x g durante 3 min a temperatura ambiente, retire los medios de crecimiento y resuspend en 120 l de tampón de digestión de zymolyase complementado con 5 ml de zymolyase (2 unidades de enzima/ L). Mezclar la muestra por vórtice e incubar a 37oC durante 40 min.
   2. Añadir 120 l de un tampón de lísis caotrópica (p. ej., cloruro de guanidinio), 250 l de cloroformo y vórtice la muestra durante 60 s.
   3. Centrifugar a >8.000 x g durante 2 min y transfiera el sobrenadante a una columna de purificación en un tubo de recogida estéril.
   4. Centrifugar a >8.000 x g para 60 s y deseche el flujo a través. El gDNA se enlazará a la matriz de columnas.
   5. Lavar la columna dos veces con 300 ml de un tampón de lavado a base de etanol, repitiendo el paso de centrifugación desde arriba (3.2.4). Deseche el flujo después de cada giro. Transfiera la columna a un tubo de microfuge de 1,5 ml, añada 60 ml de tampón TE e incubar a temperatura ambiente durante 60 s. Flash gira la muestra durante 30 s para eluir el ADN.
      NOTA: Determinar la concentración del ADN en la muestra (Absorbencia a 260 nm) y la calidad (Absorbancia 260nm/280nm). Un rendimiento típico será de 100-200 ng/L de gDNA con una relación de absorbancia a 260 nm/280nm tan cerca de 1.8 como sea posible.
3. Amplifique y aísle el vector plásmido pRS315 para la clonación.
   NOTA: Varias opciones de alta calidad están disponibles comercialmente para la purificación de vectores de plásmido. Se recomienda una química de columna basada en sílice para este paso. Los cambios que se indican a continuación han llevado a la mayor concentración y pureza. Los detalles se encuentran en la Tabla de Materiales.
   1. Cultivar un cultivo de 5 ml de E. coli que contiene el vector pRS315 durante la noche en medios de ampicilina LB+ (80 g/ml). Pele el cultivo por centrifugación a >8.000 x g durante 2 min a RT (15–25 oC).
   2. Re-suspenda las células bacterianas peletadas en 250 ml de tampón TE con RNase A (100 g/ml) y transfiera a un tubo de microcentrífuga. Asegúrese de que no queden grumos de células.
   3. Añadir 250 l de tampón de lysis y mezclar invirtiendo el tubo 6-8 veces. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. No permita que la lesis proceda durante más de 5 minutos – un poco menos es preferible.
   4. Añadir 350 l de tampón de neutralización y mezclar inmediatamente y a fondo invirtiendo el tubo 10 veces. Centrífuga durante 10 min a >8.000 x g.
   5. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante desde arriba a una columna de centrifugado de sílice por pipeteo. Centrifugar durante 30 s y deseche el flujo a través.
   6. Agregue 500 l de un tampón de lavado de sal alta y centrífuga como en el paso 3.3.5. Deseche el flujo a través. Lave la columna de espín de unión de ADN añadiendo 750 ml de un tampón de lavado a base de etanol, para eliminar las sales residuales y centrífuga como en el paso 3.3.5.
   7. Deseche el flujo a través y centrífuga durante 2 minutos adicionales a >8.000 x g para eliminar el tampón de lavado residual. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de microcentrífuga limpio y etiquetado de 1,5 ml. Para eluir el ADN, agregue 20 l de tampón de TE al centro de la columna de espín, incubar durante 1 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 min a >8.000 x g.
   8. Utilice un espectrofotómetro para determinar la cantidad (absorbencia a 260 nm) y la calidad (Absorbencia 260 nm/280 nm) del ADN. Un rendimiento típico será de 1–2 g/l.
4. Amplificación PCR del gen candidato, SIR2, a partir de ADN genómico de tipo salvaje
   1. Para producir un ampliente adecuado para la clonación, utilice una polimerasa PCR de alta fidelidad (HF) para evitar que se amplifica la generación no intencional de mutaciones en la secuencia.
      NOTA: Muchas opciones de PCR de alta fidelidad diferentes están disponibles comercialmente. Para facilitar la optimización de las condiciones de reacción pcR, utilice la combinación de dos búferes: uno que sea un búfer HF estándar y otro optimizado para amplificadores complejos y de GC altos. Los detalles se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
   2. PCR amplificar la construcción SIR2 para clonación como se describe en el Cuadro 1.
      NOTA: Para maximizar el éxito en los pasos de clonación, se pueden configurar y concentrar varios pasos de limpieza de columnas PCR idénticos de 50 l. Asegúrese de configurar una reacción de control de plantilla sin gDNA (control negativo).
   3. Configure las condiciones de ciclo PCR como se describe en el Cuadro 2.
      NOTA: Diferentes pares de imprimación varían en su temperatura de recocido y diferentes polimerasas funcionan a diferentes velocidades. Asegúrese de optimizar las condiciones de amplificación en función de la enzima seleccionada y las especificaciones de la combinación de imprimación tal como está diseñada.
   4. Verificar el éxito de la reacción PCR visualizando la reacción pcR, que produciría aproximadamente 2,5 kb de fragmento de ADN, en un gel de 1,0% TAE-agarose (con 0,5 g/ml de bromuro de etidio para la visualización).
5. Digestión y ligadura del gen candidato, SIR2, en el vector plásmido pRS315.
   1. Realizar la digestión de restricción del vector y el inserto: ADN de 625 ng (ya sea el vector o la plaquita), agua q.s. para llevar el volumen de reacción final a 50 l, 5 l de tampón, SacII de 1 l y 1 l de HindIII. Incubar las digestiones de restricción a 37oC durante 3 h, seguidas de 80oC durante 20 min para calentar las enzimas. Los resúmenes se pueden almacenar a 4 oC antes de continuar con el siguiente paso.
   2. Configure una reacción de ligadura de 15 l para crear el plásmido deseado: 6 ml de agua estéril, vector digerido de 2 l (50 ng de ADN), inserción digerida de 4 l (100 ng de ADN), reacción tampón T4 de 2 l y 1 l de ligasa de ADN T4. Incubar las reacciones de ligadura durante la noche a 16oC, seguidas de 80oC durante 20 minutos para calentar la enzima.
      NOTA: Configure un control sin plaquita, sustituyendo 4 ml adicionales de agua estéril (10 l en total) en lugar de la plaquita.
   3. Transforma las reacciones de ligadura en E. coli.
      NOTA: Hay muchas opciones disponibles para las celdas competentes que están disponibles. Este protocolo utiliza células químicamente competentes que se almacenan a -80 oC antes de su uso.
      1. Descongelar un tubo de 50 l de células E. coli congeladas y competentes sobre hielo hasta que se descongele e añada inmediatamente 15 l de la reacción de ligadura. Deslice el tubo varias veces. Inmediatamente devolver los tubos al hielo e incubar durante 30 min.
      2. Golpee el calor de las células durante 20 s en un baño de agua a exactamente 42 oC, e inmediatamente devuelva los tubos al hielo durante una incubación de 2 minutos. Añadir 450 l de medios de recuperación de temperatura ambiente (p. ej., SOC o LB) a cada reacción de transformación e incubar durante 60 minutos a 37 oC con agitación.
      3. Para cada reacción de transformación, haga una dilución 1:10 de las células. Utilizando una técnica estéril, placa 150 l de las células sin diluir y las diluciones 1:10 en las placas de ampicilina LB + (80 g/ml)³⁵. Incubar las placas a 37oC durante la noche.
6. Pantalla de transformantes prospectivos para el vector de sobreexpresión.
   1. Usando una técnica estéril, inocular los transformadores potenciales que crecieron en 5 ml de LB + ampicilina (80 g/ml) y crecer de la noche a la mañana. Siguiendo el procedimiento descrito en la sección 3.3.1–3.3.7 anterior, aísle los plásmidos de cada posible transformador y pantalla para la integración exitosa de la plaquita mediante la digestión de restricción seguida de la electroforesis de gel en un gel de agua-agarosa del 1,0% (con bromuro de etidio de 0,5 g/ml para la visualización).

4. Transformar el vector en cepas de levadura atg y de tipo salvaje

NOTA: Esto se realiza utilizando un protocolo de transformación de acetato de litio modificado³⁶.

1. Pellet 15 mL de tipo salvaje y atg1-null células de levadura cultivadas durante la noche en medios YPAD a la fase de registro temprano a medio (O.D. 600nm a 0.4-0.9) de crecimiento durante 3 minutos a > 800 x g a temperatura ambiente.
2. Decantar el sobrenadante, volver a suspender el pellet celular en 1 ml de ddH estéril₂O y transferir el contenido a un tubo de microfugo de 1,7 ml. Pele las células durante 3 min a > 800 x g a temperatura ambiente.
3. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 250 ml de acetato de litio de 100 mM con pipeteo suave. Divida las células en tubos de microfureja separados para cada una de las transformaciones que realizará. Utilice 50 l de la mezcla de acetato de cilílo-litio por transformación.
4. Configure una combinación de transformación. A cada una de las transformaciones se añaden: 240 l de 50% PEG3350, 36 l de acetato de litio de 1,0 M y 5 l de ADN de espermatozoides de salmón (u otro portador), hervido durante 5 minutos y en hielo.
   NOTA: PEG es muy viscoso. Pipetear y medir cuidadosamente. Mezclar por pipeteo después de la adición de cada componente antes de continuar.
5. Añadir 5 l del plásmido apropiado para cada transformación realizada. Vórtice cada tubo para mezclar bien. Incubar las muestras a 30oC durante 45 min. Muestras de choque térmico a 42oC durante 10 min.
6. Células de pellets durante 3 minutos a > 800 x g a temperatura ambiente, retire cuidadosamente la mezcla de transformación y vuelva a suspender las muestras en 300 ml de células estériles de ddH₂O. Pellet repitiendo el espín anterior, retire cuidadosamente el agua y vuelva a suspender sus muestras en 200 l de ddH estéril₂O.
7. Configurar diluciones 1/10 y 1/100 para cada cepa transformada de levadura.
8. Utilizando la placa de técnica estéril de 150 l de cada muestra en placas SC-leucina para seleccionar para los plásmidos. Esparce las células de manera uniforme y uniforme y deja que la placa se seque antes de invertir e incubar a 30oC para crecer durante 48–72 h.
   NOTA: Una vez que se genera la cepa adecuada, se puede almacenar a largo plazo en un 25% de glicerol a -80 oC. La cuantificación del número de copia presente puede determinarse mediante varias metodologías, entre ellas qPCR, RNA-FISH u otra medida apropiada^37,38.

5. Determinar la vida útil cronológica para comprobar la supresión de fenotipo CLS acortada

1. Probar el efecto de la sobreexpresión del supresor putativo en CLS en la levadura de corta duración, autócmado, determinando el número de unidades formadoras de colonias (Unidades formadoras de colonias) que permanecen en función del tiempo³⁹.
   NOTA: Es necesario configurar esta parte del experimento con los controles adecuados. Un experimento típico comparará una cepa de levadura de tipo salvaje (WT) con el vector vacío, WT con el vector supresor, el mutante de eliminación con el vector vacío y el mutante de eliminación con el vector supresor.
   1. Tome una sola colonia de la cepa para estudiarla e inocularla en los medios SC-LEU. Crecer la cultura a 30oC durante 72 h, con temblores.
   2. Usando un hemocitociómetro, determinar la concentración de células que están presentes en el cultivo⁴⁰.
   3. Diluir una alícuota del cultivo, de modo que el resultado sea un número uniforme de células en un volumen de 150 l de agua estéril. Plato del cultivo utilizando técnica estéril en placas SC-LEU y crecer a 30 oC durante 72 h. Estas placas son el punto de tiempo del tercer día y el experimento se normalizará a este punto de tiempo como 100% viabilidad³⁹.
      NOTA: El número de celdas debe ser 200-500, lo suficientemente grande para el análisis y un número manejable para el recuento. En este estudio, utilizamos 200 células para nuestra cantidad de chapado.
   4. Continúe incubando los cultivos de levadura a 30 oC, tomando alícuotas regulares y enchapados como se describe en 5.1.3. Continúe este proceso hasta que las cepas ya no sean viables, luego compile y analice los resultados.
      NOTA: La lista completa de cepas utilizadas en este estudio se encuentra en la Tabla 3.

Resultados

Como hay informes contradictorios sobre el papel de SIR2 durante el envejecimiento, elegimos este gen para el estudio como un supresor potencial del^fenotipoCLS de acortamiento del mutante atg1 . El papel de SIR2 es algo controvertido, con informes contradictorios sobre su papel en la ampliación de CLS, sin embargo, ha estado claramente relacionado con el aumento de CLS en al menos un fondo de levadura, con un papel tanto en la autofagia como en la mitofagia

Discusión

Desentrañar la genética del envejecimiento es un desafío difícil, con muchas oportunidades de estudio que potencialmente pueden producir información significativa sobre las complejas interacciones que existen. Hay muchos métodos que permiten la rápida generación de mutantes de pérdida de función para el estudio de cepas nulas de levadura^45,,46. Este método presenta un enfoque sencillo para identificar y clonar genes en el vector pRS315 para estudios de supresor d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ADN fúngico/bacteriano	Zymo Research	D6005
Enzima HindIIIHF	New England Biolabs	R3104S
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs	M0530S Kit de
minipreparación de plásmidos	Qiagen	12123
Enzima SacII	New England Biolabs	R0157S
Salmón ADN de esperma	Thermofisher	AM9680
T4 ADN ligasa	New England Biolabs	M0202S