Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

Summary

Aquí se presenta un protocolo para la microdisección de captura láser (LCM) de tejidos vegetales. LCM es una técnica microscópica para aislar áreas de tejido de una manera libre de contaminación. El procedimiento incluye fijación de tejido, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN. El ARN se utiliza en el análisis de transcriptomas de transcriptomas específicos del tejido aguas abajo y resueltos temporalmente.

Abstract

El desarrollo de un organismo multicelular complejo se rige por tipos celulares distintos que tienen diferentes perfiles transcripcionales. Para identificar las redes reguladoras transcripcionales que rigen los procesos de desarrollo es necesario medir los perfiles de expresión génica espacial y temporal de estos tipos de células individuales. Por lo tanto, la comprensión del control espacio-temporal de la expresión génica es esencial para comprender cómo se regulan los procesos biológicos y de desarrollo. Aquí, describimos un método de microdisección de captura láser (LCM) para aislar un pequeño número de células de tres órganos embrionarios de cebada durante un curso de tiempo durante la germinación seguido de perfiles de transcripción. El método consiste en fijación de tejidos, procesamiento de tejidos, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN seguido de PCR en tiempo real o ARN-seq. Este método nos ha permitido obtener perfiles espaciales y temporales de transcriptomas de órganos de semillas de diferentes números de células (decenas a cientos), proporcionando una especificidad tisular mucho mayor que los análisis típicos de tejido a granel. A partir de estos datos pudimos definir y comparar redes reguladoras transcripcionales, así como predecir los factores de transcripción regulatorias candidatos para tejidos individuales. El método debe ser aplicable a otros tejidos vegetales con una optimización mínima.

Introduction

El desarrollo y crecimiento de las plantas implican la acción coordinada de las redes reguladoras transcripcionales dentro de diferentes células que existen en un entorno celular complejo. Para entender la actividad de estas redes reguladoras, requerimos el conocimiento de la expresión génica espacial y temporal dentro de diferentes tipos de células en todas las etapas del desarrollo. Sin embargo, los análisis de la expresión génica se llevan a cabo más comúnmente en órganos enteros o muestras de tejido a granel debido al desafío técnico de aislar y analizar un pequeño número de células. El método que describimos aquí ha permitido obtener análisis de transcriptomas es....

Protocol

Como el producto final es ARN, tenga cuidado de evitar contaminar el trabajo con ARN. Usar guantes es imprescindible. Utilice agua tratada con pirocarbonato de dietil (DEPC), tampones, etc. Búferes de autoclave y cristalería de hornear antes de su uso.

1. Fijación de tejidos

1. Preparar fijador de elección dependiendo de la especie y los tipos de tejido; para la semilla de cebada, utilice el fijador del agricultor (75% etanol, 25% ácido acético glacial (v/v)).
2. Enfríe el fijador en hielo antes de cosechar los tejidos.
3. Recoger el material vegetal de interés y, si es necesario, diseccionarlo en trozos de tamaño adecu....

Results

Generamos transcriptomas espaciales y temporales específicos de tejidos a partir de semillas de cebada durante la germinación utilizando nuestro protocolo LCM RNA-seq¹⁰. El estudio se llevó a cabo aplicando LCM ARN-seq a un pequeño número de células de tres órganos embrionarios (plumule, radicle tip, scutellum) cada 8 h durante un curso de tiempo de 48 horas durante la germinación (0-48 h, 7 puntos de tiempo) (Figura 2A,B).

Discussion

Muchos estudios de expresión génica específicos de los tejidos se han visto limitados por la disección manual de muestras, que consume mucho tiempo, requiere mucho trabajo, tiene un alto riesgo de contaminación y sólo puede utilizar muestras de que un agente humano es lo suficientemente hábil para cosechar. LCM es una técnica precisa y sin contacto para recoger células de secciones de tejido fijo utilizando un rayo láser operado mecánicamente bajo visualización microscópica.

Una buena preparac.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido acético 100 % ACS/R.	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaco	Zeiss	415190-9181-000
Moldes de base transparente 8 X 10	Leica	3803015
Pirocarbonato de dietilo	Sigma-Aldrich	40718-25ML
ScreenTape de ARN de alta sensibilidad	Agilent	5067-5579
Low­ perfil disp.blades DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II Kit de amplificación de ARNa	Ambion (ThermoFisher)	AMB17515
en columna DNasa I Set de digestión	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen (Ciencia integrada)	7102-08
Parafina (Surgipath Paraplast)	Leica	39601006
PicoPure	ABI (ThermoFisher)	KIT0214
Solución de descontaminación de ARNasa RNaseZap	Ambion (ThermoFisher)	AM9780
Xileno	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC28975.360
Procesador de tejidos de sobremesa	Leica Biosystems	TP1020
Módulo de inclusión de parafina calentada Leica	Biosystems	EG1150H
Placa fría	Leica Biosystems	EG1150C
Safemate Clase 2 Cabinas de seguridad biológica	LAF Technologies Pty Ltd Safemate	1.5
Leica Microtomo rotativo totalmente automatizado Leica	Biosystems	RM2265	con software PALMRobo v 4.6
Sistema Zeiss PALM MicroBeam LCM	Miscroscopia
TapeStation	Agilent	TapeStation 2200