Producción automatizada de neuronas corticales y dopaminérgicas derivadas de células madre no inducidas por humanos con monitoreo integrado de células vivas

Resumen

Mostramos la automatización de cultivos de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y diferenciaciones neuronales compatibles con imágenes y análisis automatizados.

Resumen

El cultivo manual y los protocolos de diferenciación para células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son difíciles de estandarizar, muestran una alta variabilidad y son propensos a la diferenciación espontánea en tipos de células no deseadas. Los métodos requieren mucha mano de obra y no son fácilmente susceptibles a experimentos a gran escala. Para superar estas limitaciones, desarrollamos un sistema automatizado de cultivo celular acoplado a un sistema de imágenes de alto rendimiento e implementamos protocolos para mantener múltiples líneas hiPSC en diferenciación paralela y neuronal. Describimos la automatización de un protocolo de diferenciación a corto plazo utilizando Neurogenin-2 (NGN2) sobreexpresión para producir neuronas corticales derivadas de hiPSC en un plazo de 6 a 20128 días, y la implementación de un protocolo de diferenciación a largo plazo para generar neuronas dopaminérgicas medias (mDA) derivadas de hiPSC en un plazo de 65 días. Además, aplicamos el enfoque NGN2 a una pequeña célula precursora neuronal derivada de moléculas (smNPC) transducidas con lentivirus GFP y establecimos un ensayo automatizado de crecimiento de neuritas de células vivas. Presentamos un sistema automatizado con protocolos adecuados para el cultivo rutinario de hiPSC y la diferenciación en neuronas corticales y dopaminérgicas. Nuestra plataforma es adecuada para la cultura manos libres a largo plazo y las pruebas de detección de alto contenido/alto rendimiento basado en hiPSC, RNAi y CRISPR/Cas9 para identificar nuevos mecanismos de enfermedad y objetivos farmacológicos.

Introducción

Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se autonuevan y pueden diferenciarse en casi cualquier tipo de célula adulta. Estas características hacen de hiPSC una herramienta útil para el modelado de enfermedades en la investigación básica y el descubrimiento de fármacos¹. El iPSC humano conserva los antecedentes genéticos del donante que permiten derivar los tipos de células relevantes para la enfermedad que son más afectados /implicados en el curso de la enfermedad, por ejemplo, diferentes subtipos neuronales para enfermedades neurodegenerativas^2,3. Además, hiPSC supera algunas de las limitaciones de los modelos de sobreexpresión animal y celular modelando enfermedades en un contexto humano y niveles de expresión de proteínas fisiológicas, y ha demostrado ser un valioso activo en el modelado de enfermedades que van desde trastornos monogénicos, complejos y epigenéticos, así como enfermedades de aparición tardía⁴.

A pesar de estos beneficios y oportunidades, todavía es necesario abordar varias limitaciones de la hiPSC. La cultura hiPSC actual y los protocolos de diferenciación no son rentables, difíciles de estandarizar y requieren mucho trabajo. Los pasos de cultivo manuales pueden dar lugar a una alta variabilidad en los rendimientos y fenotipos debido a las diferencias en el crecimiento y la diferenciación espontánea de hiPSC. Por lo tanto, la variación dependiente del experimentador debe reducirse mediante la implementación de técnicas de manipulación más estandarizadas y la simplificación de los protocolos que se pueden lograr mediante la automatización⁵. El establecimiento de protocolos automatizados de cultura y diferenciación de hiPSC establecerá estándares comunes para proyectos de investigación académica e industrial, y permitirá la generación de modelos de enfermedades biológicamente relevantes y resultados más reproducibles.

Trabajos anteriores han intentado la automatización de cultivos hiPSC^6,7,8 pero sus protocolos se han restringido a formatos de placa de cultivo celular específicos dependientes del sistema y carentes de adaptabilidad a diferentes formatos de ensayo. Estos sistemas son útiles en el volumen de células, pero pueden no ser adecuados para la diferenciación automatizada en los tipos celulares deseados, fenotipado de enfermedad, y propósitos de cribado. Además, se ha descrito una plataforma automatizada a gran escala para la derivación, generación de hiPSC y diferenciación⁹ pero a una escala que sólo puede lograrse mediante laboratorios de alto rendimiento dedicados a la producción de líneas que parecen atractivas pero que pueden ser inasequibles para muchos laboratorios académicos.

Desarrollamos un sistema de cultivo celular totalmente automatizado basado en una estación de manipulación de líquidos en un entorno filtrado por aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) en combinación con una incubadora de_CO2 de gran capacidad, un citómetro de imágenes de campo brillante y un brazo robótico para el transporte de placas. Estos componentes proporcionan la base para el cultivo y diferenciación hiPSC estable y reproducible. Complementamos el sistema con un sistema automatizado de almacenamiento de -20 oC para el almacenamiento compuesto o de virus y un imager de celda en vivo confocal de disco giratorio de alta velocidad. Se generaron protocolos personalizados que permitieron la siembra automática de células, los cambios de medios, las comprobaciones de confluencia, la expansión celular y la generación de placas de ensayo con tratamiento de muestras e imágenes de placas, lo que hace que el sistema sea compatible con exámenes de alto contenido/alto rendimiento. El sistema automatizado de cultivo celular e imágenes se opera mediante el software de control y la interfaz gráfica de usuario (GUI) personalizada. La GUI permite a los usuarios importar archivos CSV que contienen parámetros específicos de línea de celda necesarios para la ejecución de métodos. Además, la GUI permite programar numerosos experimentos en cualquier secuencia utilizando la vista de calendario integrada, lo que permite un control total del tiempo en que se inicia cada método.

Nuestro sistema automatizado de cultivo celular utiliza velocidades de pipeteo estandarizadas, tiempos de paso, umbrales de confluencia, densidades de siembra y volúmenes medios con la flexibilidad de cultivar células en una variedad de formatos de placa (formato de placa de 96, 48, 24, 12, 6 o 1 pozo). Hemos adaptado un protocolo de diferenciación a corto plazo publicado recientemente para convertir hiPSC en neuronas que pueden producir neuronas positivas TUBB3 en 6 días^10,11. También establecimos la diferenciación automatizada y la toma de imágenes de células precursoras neuronales de moléculas pequeñas (smNPC) en neuronas que expresan constitutivamente la GFP bajo EF1a promotor¹² e iPSC en neuronas dopaminérgicas de cerebro medio (mDA), adaptando un protocolo de inhibición de doble SMAD publicado anteriormente¹³ que produce neuronas mDA en 65 días.

Protocolo

1. Procedimientos básicos para automatizar cultivos celulares e imágenes

1. Cargar nuevas placas y puntas de cultivo
   1. Abra la GUI y haga clic en el botón de vista de proceso de recurso/instrumento. Para ejecutar cualquier proceso de recurso/instrumento, seleccione el proceso de recurso/instrumento y haga clic en el botón Ejecutar proceso de instrumento.
   2. Ejecute el proceso de recursos RunHepaHood y Reloading (consulte el paso 1.1.1). Abra la puerta, cargue las placas de cultivo celular y las puntas desechables en la posición correspondiente como se indica en la imagen emergente en el PC de control.
   3. Limpie la puerta con 70% de etanol para la descontaminación y ciérrela. Ejecute el proceso de instrumento Descontaminación desde la GUI (consulte el paso 1.1.1). El sistema es esterilizado por radiación UV durante 30 min.
2. Recargar medios de cultivo y/o reactivo de disociación
   1. Ejecute el paso del instrumento RunHepahood (véase el paso 1.1.1). Abra la puerta principal de la estación de manipulación de líquidos. Descontamine los depósitos (que contienen medios, PBS y/o reactivo de disociación) con un 70% de etanol y colóquelos en la cubierta al positón asignado (como se define en el archivo cfg.csv). Des-lid los depósitos.
   2. Descontamine la puerta con 70% de etanol y ciérrela. Apague el capó HEPA ejecutando el proceso de recurso/instrumento "InitHepaHood" desde la GUI.
3. Crear una nueva "línea celular" y proyecto en la GUI
   1. Cree/modifique los archivos definidos por el usuario "Cell line"-files que consisten en los archivos Config (*.cfg.csv), la importación (*.imp.csv), el recurso (*.rsv.csv) y los archivos de flujo de trabajo (*.wfl.csv).
   2. Abra la GUI y cree una nueva "Línea de celda" haciendo clic en el botón Agregar línea de celda en la vista "Editor de líneas de celda". Se abre un asistente donde es necesario seleccionar el archivo Config y debe especificarse un nombre de proyecto con una breve descripción.
   3. Navegue por este asistente utilizando la punta de flecha verde y confirme la configuración haciendo clic en la marca de verificación verde. Cree un nuevo proyecto para la "Línea de celda" generada haciendo clic en el botón Agregar proyecto.
   4. Escriba un nombre y una descripción del proyecto y defina un color de proyecto que será visible en la vista de calendario de la GUI. Vaya a la página siguiente del asistente haciendo clic en la punta de flecha.
   5. Cree un nuevo lote haciendo clic en el botón Agregar lote y dando un nombre y una descripción breves en la ventana emergente. Seleccione todos los pasos del proceso y programe la hora de inicio para cada uno de los pasos del proceso. Cierre la ventana haciendo clic en Aceptar.
4. Ejecute un método automatizado utilizando la GUI
   1. Vaya a la vista de calendario de la GUI y haga clic en el botón Agregar paso de proceso.
   2. Seleccione la línea Celda y después de navegar a la página siguiente del asistente elija el proyecto. Marque el lote que se va a utilizar y haga clic en la punta de flecha que apunta a la derecha. Dependiendo del método utilizado, los lotes deben estar vacíos (para recibir placas nuevas) o contener placas de cultivo o placas de ensayo (todos los demás procesos).
   3. Vaya a la página siguiente del asistente y seleccione el paso de proceso que se ejecutará. Vaya a la última página de este asistente y programe el experimento. En la sección "Detalles del parámetro" se pueden modificar las variables necesarias para ejecutar el método. Confirme haciendo clic en Aceptar.
5. Carga de placas de cultivo y ensayo en la incubadora de_CO2
   NOTA: Las placas de 1 pozo se definen como placas de cultivo, ya que se utilizan comúnmente en las células a granel. Todas las placas de varios pozos se definen como placas de ensayo.
   1. Ejecute el proceso del instrumento "RunHepaHood" desde la GUI como se describe en el paso 1.1.1. y abrir la puerta frente al brazo robótico.
   2. Limpie la parte inferior de las placas de ensayo con un 70% de etanol y un tejido libre de pelusas si las placas se cargan para obtener imágenes automatizadas. Coloque las placas de cultivo o de ensayo en el estante izquierdo. Asegúrese de que la orientación de la placa es correcta. Para las placas de ensayo, bien A1 tiene que apuntar hacia el brazo robótico mientras que los bordes de las placas de cultivo tienen que apuntar a la derecha.
   3. Limpie la puerta con 70% de etanol para la descontaminación y ciérrela.
   4. Ejecute el método "Carga de placas de cultivo" para importar placas de 1 pozo o "Carga de placas de ensayo" para importar placas multi-pozo como se describe en el paso 1.4. Utilice un lote vacío para ejecutar ambos métodos. Si los códigos de barras de placa ya están presentes en este lote, anule la selección haciendo clic en las casillas de verificación.
   5. Transporte placas individuales desde el estante hasta la plataforma de incubadora DE_CO2 utilizando el brazo robótico. La estación de transporte de placas incorporada recupera la placa y las almacena en uno de los bastidores de la incubadora_CO2. Las células se mantienen a 37oC y 5% de CO₂.
6. Descarga de placas de la incubadora_CO2
   1. Ejecute el método "Descargar placas" (véase el paso 1.4). Seleccione el lote que contiene las placas que deben exportarse. Las placas individuales se pueden seleccionar por sus códigos de barras.
   2. Transporte las placas desde la incubadora de_CO2 hasta el estante izquierdo utilizando el brazo robótico.
   3. Inicie la campana HEPA utilizando el proceso de instrumento "RunHepaHood" como se describe en el paso 1.1.1. y abrir la puerta frente al brazo robótico. Retire las placas, descontamine la puerta con un 70% de etanol antes de cerrarla y apague la campana HEPA.

2. Protocolos de automatización

1. Siembra de placas de tubos
   1. Inicie el capó HEPA ejecutando el proceso de instrumento RunHepaHood (consulte el paso 1.1.1). Abra la puerta frente a la estación de manipulación de líquidos. Introduzca el tubo de 50 ml que contiene la suspensión celular y desentrase el tubo.
   2. Abra la puerta delante del brazo robótico y cargue las placas de cultivo recubiertas para las células receptoras en el estante. Descontamine y cierre ambas puertas. Ejecute el método "Seeding of plates from tubes" (ver paso 1.4).
   3. Cuente las células en el citómetro de imágenes de campo brillante utilizando la función de recuento directo de células. Para el recuento de celdas, utilice 16 pozos como réplicas en un formato de placa de 384 pozos.
   4. Transporte la placa de conteo de 384 pozos desde la cubierta hasta el citómetro de imágenes de campo brillante a través del plato giratorio utilizando el brazo robótico e inicie el proceso de imagen. El citometro determina automáticamente el número de célula por mililitro. Vuelva a colocar la placa de conteo en su posición original con el brazo robótico.
   5. Transporte un cultivo recubierto o una placa de ensayo desde el estante hasta la cubierta de pipeteo utilizando el brazo robótico. Retire las celdas de recubrimiento y semillas en el número definido por el usuario y el volumen adecuado para el formato de placa (véase la Tabla 1). Mueva la placa al agitador en la cubierta durante 10 s a 500 rpm para la distribución celular y transfiera a la incubadora de_CO2.
2. Evaluación automatizada de la confluencia
   1. Ejecute el método "Comprobar confluencia" como se describe en el paso 1.4. Seleccione un lote que contenga al menos una placa de cultivo y ninguna placa de ensayo. En la sección "Detalles de parámetros" introduzca "iPSCf_2020" para la configuración de adquisición de imágenes y análisis de imágenes.
   2. Transporte la primera placa desde la incubadora de_CO2 hasta el citómetro de imagen de campo brillante a través del plato giratorio utilizando el brazo robótico.
   3. Realizar imágenes de células en el citómetro de imágenes de campo brillante para la comprobación de la confluencia de colonias de hiPSC. Utilice la aplicación "confluencia" y la imagen 13 campos del pate de 1 pozo y calcule automáticamente el área promedio ocupada por las celdas.
   4. Transporte la placa de vuelta a la incubadora de_CO2 utilizando el brazo robótico. Repita los pasos 2.2.2. a 2.2.4. para las placas restantes.
3. Cambio de medios de placas de cultivo o placas de ensayo
   1. Ejecute el método "Cambio de medios de placas de cultivo" como se describe en el paso 1.4. y seleccione un lote que contenga sólo placas de cultivo. Establezca la variable que indica si se utilizan puntas o agujas para los pasos de pipeteo en la sección "Detalles del parámetro". Para el cambio de medios de cualquier placa de varios pozos, ejecute el método "Media Change Of Assay Plates" y seleccione un lote que contenga placas de ensayo.
   2. Transporte las placas individuales desde la incubadora de_CO2 hasta la cubierta utilizando el brazo robótico y des-lid las placas. Incline automáticamente las placas y aspire los medios antiguos y deséchelo en el módulo de recogida de residuos. Añadir 12 ml de medios frescos. Vuelva a tapar la placa y transporte las placas de vuelta a la incubadora de_CO2 utilizando el brazo robótico.
4. Subcultivación
   NOTA: Ejecute el proceso del instrumento "RunHepaHood" desde la GUI como se describe en 1.1.1. y abrir la puerta principal de la estación de manipulación de líquidos. Cargue el medio y el reactivo de disociación en las posiciones requeridas (véase el paso 1.2). Si es necesario rellenar las propinas, utilice la opción "Recargar" como se describe en el paso 1.1. Introduzca un tubo de 50 ml para recibir la suspensión celular y desentrane el tubo.
   1. Ejecute el método "Subcultivación de células adherentes" (véase el paso 1.4). Seleccione el lote que contiene placas de cultivo que necesitan subcultivación.
   2. Transporte las placas desde la incubadora de_CO2 hasta la cubierta utilizando el brazo robótico y des-lid las placas. Incline automáticamente las placas y retire los medios antiguos y deséchelos en el módulo de recogida de residuos. Lave las células una vez con 8 ml de PBS. Agregue 8 mL de 0,5 mM EDTA para el passaging basado en grupos. Incubar en la cubierta durante 8 min.
   3. Retire la solución EDTA de las placas y deseche en el módulo de recogida de residuos. Añadir 12 ml de medio fresco y transportar las placas a la coctelera. Agitar a 2000 rpm durante 1 min para desalojar las colonias.
   4. Triturar la suspensión celular durante cinco ciclos de pipeteo para romper las colonias de iPSC en un tamaño más pequeño (50 u201280 m). Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 ml en la cubierta. Las celdas de semillas sembran automáticamente como se describe en el paso 2.1.5 usando una relación de división de 1 en 7.
      NOTA: Opcional, passaging de una sola celda. Genere una suspensión de una sola célula utilizando un reactivo de disociación de una sola célula (consulte Tabla de materiales). En lugar de 0,5 mM de EDTA en el paso 2.4.2., utilice 8 ml de reactivo de disociación de una sola célula e incubar durante 20 min a 37 oC. Recoger la suspensión celular en un tubo de 50 ml y añadir el mismo volumen de medios. La disociación utilizando el reactivo de disociación de una sola célula requiere un paso manual para peletizar las células. Células centrífugas a 300 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en 12 ml del medio requerido y proceder con "Seeding de placas de los tubos" (ver paso 2.1). Complementar los medios con 2 M de tiazovivin el día de la siembra cuando se utiliza la suspensión de una sola célula de hiPSCs.
5. Imágenes automatizadas de alto contenido y alto rendimiento
   NOTA: La configuración de medición debe estar disponible (consulte Archivo suplementario 1: paso 1.1). Las placas de ensayo a tomar imágenes están disponibles en la incubadora.
   1. Ejecute el método "Imaging" (consulte el paso 1.4). Seleccione un lote que contenga al menos una placa de ensayo y ninguna placa de cultivo. En la sección "Detalles del parámetro", introduzca el tipo de placa, las definiciones de placa (para las placas de imagen estándar de 96 pozos: "Plate-96-20170918113842") y el nombre de la configuración de medición.
   2. Transporte la placa de ensayo a través del plato giratorio al microscopio confocal automatizado utilizando el brazo robótico para iniciar el proceso de toma de imágenes. Recuperar la placa al final de la imagen del microscopio y transportarla de vuelta a la incubadora de_CO2. Repita el proceso de las placas restantes en el lote.

3. Mantenimiento automatizado y expansión de hiPSC

1. La secuencia de comprobaciones automatizadas de confluencia, cambios en los medios y subcultivación
   1. Células de semillas en placas de 1 pozo utilizando el método "Seeding of plates from tubes" (ver paso 2.1). Alternativamente, importe manualmente las placas de 1 pozo de siembra utilizando el método "Carga de placa de cultivo" (véase el paso 1.5).
   2. Programe controles automatizados de confluencia diariamente para monitorear el crecimiento de las colonias desde el día 1 hasta el día 6 del cultivo para iPSC (ver paso 2.2).
   3. Actualice los medios cada segundo día utilizando el método "Cambio de medios de las placas de cultivo" (consulte el paso 2.3). Se utilizan 12 ml de medio por placa.
   4. El día 6, inicie el proceso de "Subcultivación" (ver paso 2.4.).

4. Diferenciación automatizada

1. IPSC humano a neuronas NGN2 corticales
   NOTA: Preparación manual de hiPSC. El protocolo implica la sobreexpresión de NGN2 utilizando vectores lentivirales para la entrega. Transdacea hiPSC con NGN2 a rTTA3 lentivirus en una proporción de 1:2 (> 10⁷ TU/mL). A continuación, se seleccionan las células para un pasaje con 0,5 g/ml de puromicina. Un protocolo detallado para generar líneas estables hiPSC-NGN2 se encuentra en el archivo suplementario 1: paso 2.
   1. Continúe con el proceso de "Subcultivación" como se describe utilizando el reactivo de disociación de una sola célula descrito en la nota del paso 2.4.4. cuando hiPSC alcanza el 70-u201280% de confluencia
   2. Retire el sobrenadante y resusppend el gránulo celular en 12 ml de medios NGN2(Tabla de materiales)que contengan 2,5 g/ml de doxiciclina (dox) y 2 m de tiazovivina.
   3. Comience a diferenciar utilizando el método "Seeding of plates fromtubes" (ver paso 2.1). Establezca la densidad de siembra deseada de iPSC en 30.000/cm² (véase la tabla 1). El iPSC se ensomata en placas pre-recubiertas con 0,1 mg/ml de poli-l-ornitina (PLO) y laminina de 5 g/ml.
      NOTA: Las placas de 1 pozo son preferidas para los estudios basados en ARN y proteómica, mientras que el formato de placa de 96 pozos se prefiere para experimentos de imágenes. También se pueden utilizar otros formatos de placas de ensayo como placas de 48, 24, 12 o 6 pozos.
   4. En el día 1 de diferenciación, Refrescar los medios utilizando el "Cambio de medios de las placas de ensayo (ver paso 2.3) utilizando el medio NGN2, complementado con 2,5 g/mL dox y 10 M N-[2S-(3,5-difluorofenil)acetil]-L-alanyl-2-fenil-glicina, 1,1-dimetiletil ester).-D-L-alanil-2-fenila-glicina, 1,1-dimetilil ester(DAPT). Continúe con los cambios de los medios cada 2-u20123 días hasta el día deseado de diferenciación (véase el paso 2.3).
   5. En el día 4 de diferenciación, llevar a cabo otro cambio de medios (ver paso 2.3.) utilizando el medio NGN2 complementado con 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), 10 ng/mL factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) y 10 ng/mL factor neurotrófico 3 (NT-3) para mejorar la maduración. Al final del experimento, exporte las placas de cultivo del sistema para experimentos posteriores (véase el paso 1.6).
2. Células precursoras neuronales de moléculas pequeñas (smNPC) a las neuronas NGN2
   NOTA: Derive smNPC siguiendo la versión adaptada del protocolo publicado¹² (consulte Archivo suplementario 1: paso 5). Modifique el smNPC con el virus NGN2 y rTTA3 (consulte Archivo suplementario 1: paso 2). Una ronda de transducción de NGN2 y RTTA es suficiente para generar una población estable. Modifique aún más smNPC con lentivirus pLVX-EF1a-AcGFP1-N1, lo que permite realizar la monitorización de células vivas. Para la transducción lentiviral de GFP se utiliza una multiplicidad de infección (MOI) de 10.
   1. Pasaje smNPC al llegar a la confluencia utilizando reactivo de disociación de una sola célula como se describe en el paso 2.4. Nota.
   2. Células de semillas que utilizan el sistema automatizado de cultivo celular con una densidad celular de 50.000/cm2 utilizando el método "Seeding of plates from tubes" (ver paso 2.1.) en placas pre-recubiertas con 0,1 mg/ml de PLO, y 5 g/ml de laminina en medio NGN2 complementado con 2,5 g/ml de dox.
   3. En el día 3, realice un cambio de medios (consulte el paso 1.3.) utilizando un medio NGN2 fresco que contenga 2,5 g/ml de dox y DAPT de 10 oM. Después del día 3, realice cambios en los medios cada tercer día con un medio NGN2 fresco que contenga 2,5 g/ml dox, BDNF, GDNF y NT-3 a 10 ng/ml cada uno.
   4. Células de imagen diariamente utilizando el método "Automated high content, high throughput imaging" (consulte el paso 2.5) para monitorear el estado de diferenciación usando GFP como lectura para el crecimiento de la neurita. Ajuste la potencia del láser al 80% y utilice un tiempo de exposición de 30 ms. Adquiera un gran número de campos (por ejemplo, 25 campos) utilizando el objetivo 20x.
3. Análisis de imágenes por lotes
   1. Realice análisis de imágenes con el software de análisis de imágenes 1, utilizando la plantilla de crecimiento de neurita.
   2. Abra el software. Seleccione la opción "Datos" y vaya a la carpeta de datos de imágenes, haga clic en Aceptar para cargar los datos que se analizarán. Haga clic en Abrir y en la barra de menú superior, seleccione protocolo y en el menú de la aplicación seleccione neurite outgrowth. Vaya a "algoritmos" y utilice el canal "488" para definir el núcleo, el cuerpo celular y la neurita. Ajuste los parámetros de umbral para cada uno.
   3. Seleccione los pozos que se utilizarán para el análisis de imágenes. En la parte inferior derecha, haga clic en el vínculo y seleccione las entidades que desea analizar, como el promedio de recuento de celdas, el total de la longitud total del esqueleto. Continúe con "pre-analizar" seguido de "vista previa".
   4. Compruebe si la configuración de vista previa es aceptable e inicie el análisis en el modo por lotes. Los resultados están disponibles en la carpeta principal en "informes" en formato de archivo .csv que se puede abrir en Excel.
      NOTA: El script de análisis de imágenes está disponible bajo petición.
   5. Longitud media de neurita de la gráfica obtenida por la longitud total de la neurita normalizada al número de célula.

5. Diferenciación automatizada de hiPSC en neuronas dopaminérgicas de cerebro medio (mDA)

1. Preparación manual de hiPSC
   1. Disociar 70-u201280% hiPSC confluente en células individuales utilizando el reactivo de disociación de una sola célula. En resumen, incubar células con reactivo de disociación de una sola célula (100 l/cm²) durante 30 min a 37oC, recoger la suspensión celular en un tubo cónico, centrífuga a 200 x g durante 5 min y resuspend pellet celular en medio de cultivo iPSC.
   2. Semilla 200.000 células/cm² en placas extracelulares recubiertas de 1 poc y medio de cultivo iPSC complementado con 10 M Y-27632. Células de cultivo durante la noche a 37oC y 5% DE CO₂.
2. Diferenciación automatizada: Fase 1
   1. Prepare el sistema de cultivo automatizado como se describe en el paso 1.1-u20121.2.
   2. Cargar placas de cultivo que contienen células en la incubadora de_CO2 del sistema de cultivo automatizado (ver paso 1.5).
   3. Preparar el medio KSR (ver Tabla de Materiales)y complementar con moléculas pequeñas (ver Tabla 2) necesario para el día de inicio 0 de diferenciación. Utilice sólo medios recién preparados con moléculas pequeñas y factores de crecimiento.
   4. Realizar cambios de medios de las placas de cultivo como se describe en el paso 2.3 en los días 0 y 1 de diferenciación y luego cada segundo día hasta el día 25.
   5. A partir del día 5, cambie la formulación de medios gradualmente como se describe en detalle en el Cuadro 3.
   6. El día 11, añadir el medio de diferenciación de neuronas mDA complementado con CHIR (hasta el día 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGF-3 y DAPT (ver la Tabla de Materiales).
   7. El día 25, descargue las placas (véase el paso 1.6.)
3. Replating manual 1
   1. Disociar precursores de 25 mDA de día en células individuales utilizando el reactivo de disociación de una sola célula. En resumen, incubar células con reactivo de disociación de una sola célula (100 l/cm²) durante 40 min a 37oC, recoger la suspensión celular en un tubo cónico, centrífuga a 200 x g durante 5 min y pellet celular resuspend en medio de diferenciación de neurona mDA.
   2. Semillas 400.000 células/cm² en placas de cultivo de 1 pocillo recubiertas previamente con 0,1 mg/ml de PLO, 10 g/ml de laminina y 2 g/ml de fibronectina en el medio de diferenciación de la neurona mDA complementado con 10 m Y-27632 (hasta el día 26) y moléculas pequeñas y factores de crecimiento descritos en la Tabla 2. Células de cultivo durante la noche a 37oC y 5% DE CO₂.
4. Diferenciación automatizada: Fase 2
   1. Placas de cultivo de carga que contienen neuronas mDA en la incubadora de_CO2 del sistema de cultivo automatizado como se describe en el paso 1.5
   2. Preparar el medio de diferenciación de neuronas mDA (ver Tabla de Materiales)y complementar con moléculas pequeñas y factores de crecimiento necesarios para la diferenciación final a partir del día 26 (ver Tabla 2).
   3. Realizar cambios en los medios de las placas de cultivo como se describe en el paso 2.3 del día 26 de diferenciación y luego cada 3 u20124 días hasta el día 65.
      NOTA: Para propósitos de imágenes de alto rendimiento, se recomienda reoplar las neuronas mDA en placas de 96 pocillos a baja densidad en el día 32 de diferenciación, como se describe en el paso 5.5.
5. Replating manual 2
   1. Descargue las placas de cultivo como se describe en el paso 1.6. Disociar el día 32 mDA neuronas en células individuales como se describe en el paso 5.3.1.
   2. Semillas 100.000 células/cm² en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con 0,1 mg/ml de PLO, 10 g/ml de laminina y 2 g/ml de fibronectina en el medio de diferenciación de la neurona mDA complementado con 10 m Y-27632 (hasta el día 33) y moléculas pequeñas y factores de crecimiento (ver Tabla 2). Células de cultivo durante la noche a 37oC y 5% DE CO₂.
   3. En el día 33, reemplace el medio por medio de diferenciación de neuronas DA recién preparados complementado con moléculas pequeñas y factores de crecimiento (sin Y-27632). Cambie el medio manualmente cada 3-u20124 días hasta el día 65.

6. Inmunostaining, adquisición y análisis automatizados de imágenes de alto rendimiento

1. Tinción por fluorescencia
   1. Realice la inmunosuchación fluorescente como se describe en el archivo suplementario 1: paso 4.
   2. Celdas de imagen como se describe en el archivo suplementario 1: paso 1.2.
   3. Cargue los archivos de imágenes generados por el sistema de imágenes al software de análisis de imágenes 2 (consulte Tabla de materiales) para realizar un análisis de imágenes más completo, como se describe en el paso 6.2.
2. Análisis de imágenes utilizando el software de análisis de imágenes 2
   1. Una vez que los archivos de imágenes se cargan en el software de análisis de imágenes 2, vaya a la función "análisis de imágenes" y cree el algoritmo de análisis mediante el menú desplegable.
   2. Seleccione núcleos utilizando la tarea "buscar núcleos", que detecta regiones en la imagen pertenecientes a núcleos celulares (aquí manchado con Hoechst). Excluya los núcleos de las células muertas (núcleos piknóticos) estableciendo un umbral para el área nuclear o el diámetro.
   3. Seleccione el citoplasma celular utilizando la tarea "Encontrar citoplasma". Esta tarea detecta regiones alrededor de núcleos pertenecientes al citoplasma celular. Incluya solo celdas bien segmentadas. Excluir células mitóticas, apoptóticas y mal segmentadas. Elimine las celdas que tocan el borde de la imagen.
   4. Agregue las tareas "calcular propiedades morfológicas" y "calcular propiedades de intensidad". Los parámetros morfológicos incluyen el cálculo de propiedades morfológicas como el área de una región de interés. Los parámetros de intensidad incluyen el cálculo de las propiedades de intensidad, como la intensidad media de una región de interés (por ejemplo, citoplasma de las neuronas).
   5. Seleccione una subpoblación (por ejemplo, neuronas TH positivas) de la población de entrada (todos los citoplasmas seleccionados) utilizando una o más condiciones, morfología y/o intensidad.
      NOTA: Por lo general, la intensidad se elige para las neuronas. Sobre la base de controles negativos, es posible definir por encima de qué umbral de intensidad las neuronas se consideran positivas para TH.
   6. Defina los resultados de salida. Este es el último bloque de construcción de cada análisis. Define los valores de lectura del ensayo para cada pozo de una placa de referencia cultural (resultados por pozo).
   7. Ejecute el análisis por lotes y exporte los resultados. Normalice el número de celdas positivas en el número total de núcleos y represente los datos como el porcentaje de celdas positivas.

7. Reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)

1. Realice el protocolo qRT-PCR como se describe en el archivo suplementario 1:paso 3.

Resultados

Nuestro sistema automatizado de cultivo celular e imágenes fue diseñado para minimizar la intervención humana, lo que nos permite estandarizar el cultivo de hiPSC y la diferenciación en diferentes tipos celulares como las neuronas dopaminérgicas corticales o de cerebro medio (mDA). En la Figura 1se muestra una visión general esquemática de nuestro sistema automatizado de cultivo celular con dispositivos de imágenes integrados. La introducción inicial de cultivos celulares en este sistema automatizado de cultivo celular se puede realizar sembrando automáticamente las células de un tubo de 50 ml o utilizando el método "Carga de placas de cultivo" o "Carga de placas de ensayo" para la importación de placas de cultivo o ensayo. Un componente central de nuestro sistema es la estación de manipulación de líquidos donde se llevan a cabo todos los pasos de transferencia de líquidos, como cambios de medios o subcultivaciones. El diseño de cubierta personalizado del controlador de líquidos se representa en la figura 2. La estación de manipulación de líquidos está equipada con cuatro posiciones. Se pueden transferir hasta cuatro placas desde la incubadora a la cubierta, lo que permite cambios de medios paralelos. Dado que en el método de subcultivación, tanto las placas de cultivo de padre e hija deben acomodarse en la cubierta, el número máximo de placas de cultivo procesadas en paralelo se limita a dos. Una característica importante de la estación de manipulación de líquidos es la posibilidad de inclinar las placas durante el cambio de medios para la eliminación completa del sobrenadante de cultivo celular. Además, la estación de manipulación de líquidos está equipada con agitadores para favorecer la disociación enzimática de las células durante la ejecución del protocolo de subcultivación. Nuestro sistema de cultivo automatizado también está equipado con dos sistemas de imágenes: un citómetro de imágenes de campo brillante para realizar controles de confluencia y recuento de células y, por lo tanto, monitorear el crecimiento celular con el tiempo, y un microscopio confocal de disco giratorio doble para obtener imágenes rápidas, de alto contenido y de alta resolución de las células.

Los cultivos hiPSC son monitoreados diariamente para el crecimiento en el citómetro de imágenes de campo brillante y analizados para detectar el porcentaje de confluencia. La imagen de campo brillante en el panel izquierdo y en el panel derecho una máscara verde del análisis de la imagen de campo brillante obtenida con el citómetro (Figura 3A). A lo largo del tiempo se observa un crecimiento homogéneo de hiPSC, como lo demuestran los porcentajes de confluencia de dos líneas hiPSC (n x 4 placas) cultivadas en paralelo y sometidas a comprobaciones de confluencia desde el día 1 hasta el día 6 (Figura 3B). Al alcanzar el umbral establecido, se pasa el paso de la hiPSC. Las líneas celulares se cultivaban manualmente (m) o mediante el sistema de automatización (a) y se observaban para el mantenimiento de la morfología típica de las células madre para al menos dos pasajes, imágenes representativas de campo brillante (Figura 4A). El hiPSC cultivado manualmente (no se muestra) o en el sistema automatizado exhibió el marcador típico de células madre OCT4 (rojo) y SSEA4 (verde), como se muestra en el ensayo de inmunofluorescencia (Figura 4B). La expresión de los marcadores de pluripotencia OCT4, NANOG y REX1 también fue evaluada a nivel de ARNm por qRT-PCR (Figura 4C). Se realizaron cuantificaciones relativas con muestras recogidas de una línea celular cultivadas manualmente (m) y en el sistema de cultivo automatizado (a) en duplicados (réplicas 1 y 2). Los niveles de expresión de los tres marcadores de pluripotencia en las réplicas cultivadas en el sistema de referencia cultural automatizado son similares a la expresión de marcador después de la referencia cultural manual. En el día 8 (D8), la expresión de marcadores de pluripotencia estaba ausente en las neuronas corticales diferenciadas (Diff) de hiPSC.

Una aplicación importante del sistema de cultivo automatizado es la diferenciación de hiPSC en diferentes tipos celulares, incluidas las neuronas. Aquí mostramos la diferenciación de hiPSC en neuronas utilizando la estrategia NGN2, que produce un cultivo de neuronas corticales puras en muy poco tiempo (aproximadamente 6 días). Las neuronas diferenciadas en el sistema de cultivo automatizado (a) presentaron morfología y organización de la red neuronal similares a las neuronas cultivadas manualmente (m) (Figura 5A). Las neuronas corticales diferenciadas automatizadas fueron positivas para TUBB3 (clase III específica de neuronas β-tubulina, rojo) y BRN2 (marcador de capa cortical superior, verde) (Figura 5B), comparable a las neuronas diferenciadas manualmente (datos no mostrados). La expresión de marcadores neuronales incluyendo la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2), la molécula de adhesión de células neuronales (NCAM1) y Synapsin-1 (SYN1), así como los marcadores de neurona cortical BRN2 y CUX1 (capa cortical superior) se enriquecieron en neuronas en el día 8 (D8) de diferenciación (Figura 5C). Se observó una expresión muy baja o nula de estos marcadores en hiPSC. Se realizaron cuantificaciones relativas con muestras recogidas de una línea celular cultivadas manualmente (m) y en el sistema de cultivo automatizado (a) en duplicados (réplicas 1 y 2). Los niveles de expresión de las réplicas muestran variaciones similares entre las diferenciaciones manual y automatizada.

La capacidad de creación de imágenes integrada del sistema de cultivo automatizado permite la recopilación de datos manos libres para el estado de los cultivos, lo que permite la adquisición automatizada a largo plazo de lecturas fenotípicas. Utilizando el enfoque NGN2 de una línea de precursor neural derivado de molécula pequeña (smNPC) transducida con Lentivirus GFP, establecimos un ensayo automatizado de crecimiento de neurita de células vivas en el que se midió la longitud del neurito durante 11 días de diferenciación sin ninguna intervención manual. La complejidad del neurito aumentó con el tiempo, como lo demuestra el área ocupada con neuritas los días 1, 3 y 11, expresión GFP e imágenes enmascaradas del análisis (Figura 6A, B). El aumento de la longitud de la neurita desde el día 1 al 11 de la diferenciación se cuantificó y mostró un desarrollo similar en diferentes pozos. En aras de la simplicidad, los datos de sólo 3 columnas con 6 pozos cada uno de una placa de 96 pozos se representan en el gráfico representativo, aunque se analizaron todos los pozos internos60 (Figura 6C).

Otra aplicación del sistema de cultivo automatizado que se muestra aquí es la diferenciación de hiPSC en neuronas mDA. La diferenciación se basa en los cambios en los medios de comunicación siguiendo un protocolo preestablecido y se realizó en el sistema de cultivo automatizado de los días 0 a 65. Los cambios automatizados en los medios no causaron desprendimiento de células ni ningún otro cambio visualmente detectable en la diferenciación. Al final de la diferenciación, en el día 65, las neuronas mDA muestran la organización celular y la morfología (soma esférico, dendritas largas y espinosas) comparables a la diferenciación manual(Figura 7A, B). A nivel de ARNm, las neuronas mDA diferenciadas en el sistema de cultivo automatizado muestran la expresión de marcadores neuronales y mDA, MAP2 y TH (tirosina hidroxilasa), respectivamente (Figura 7C). Ambas diferenciaciones generaron cantidades sustanciales de neuronas positivas TH y MAP2(Figura 7D).

Figura 1: Descripción general esquemática de la plataforma automatizada de creación de imágenes y cultivo celular.
El sistema fue diseñado con una carcasa de policarbonato y dos campanas HEPA (A y B) equipadas con cuatro lámparas UV que garantizan un entorno estéril para aplicaciones de cultivo celular. Las placas de cultivo celular se cargan en estantes frente al brazo robótico al que se puede acceder a través de la puerta delantera (C). Las placas se cargan en la incubadora_CO2 (D) con una capacidad de 456 placas. Un citómetro de células de campo brillante (E) se utiliza para las comprobaciones de confluencia y el recuento de células durante las rutinas de subcultivación. La estación de manipulación de líquidos está por debajo de una de las campanas HEPA (B). El diseño de la cubierta del controlador de líquidos se describe en la Figura 2. El brazo de pipeteo de la estación de manipulación de líquidos lleva un cabezal de pipeteo de 96 canales, ocho canales de pipeteo de 1 ml y cuatro canales de pipeteo de 5 ml. En el caso de los canales de pipeteo de 1 ml, se pueden utilizar puntas o agujas para transferencias de líquidos. A efectos de cribado, las células sembradas en placas de ensayo se pueden tratar con muestras almacenadas a -20 oC en el sistema automatizado de almacenamiento de -20 oC (F) después de descongelar estas muestras en una segunda incubadora (G). Las imágenes de alto rendimiento se realizan en el microscopio confocal automatizado (H) que ofrece adquirir imágenes en modo confocal utilizando dos discos giratorios o en modo de epifluorescencia. Una cámara de células vivas integrada en el microscopio permite realizar imágenes a largo plazo de las células cultivadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El diseño de la cubierta de la estación de manipulación de líquidos.
Las posiciones de las puntas se indican con "50 l" para las puntas de 50 l, por "estándar" para puntas de 300 l, por "alto" para puntas de 1 ml y por "5 ml" para puntas de 5 ml. Componentes de la cubierta: (A) Cuatro posiciones de agitador calentadas (velocidad máxima: 2500 rpm) que se pueden utilizar para cualquier placa de cultivo o formato de placa de ensayo. Las posiciones del agitador están equipadas con pinzas sujetables que también se utilizan para la alineación de la placa después de los transportes a la cubierta. Además, las posiciones del agitador funcionan como una posición de estacionamiento de la tapa para las placas durante los pasos de transferencia de líquido. Para fines representativos, todas las posiciones de coctelera están ocupadas por 96 placas de ensayo de pozo. (B) Cuatro módulos de inclinación para el procesamiento de cuatro placas de cualquier formato simultáneamente se colocan en la parte superior. La posición más baja marca la cámara de recogida de residuos para placas de cultivo y ensayo y el cabezal de pipeteo de 96 canales. Para fines representativos, todos los módulos de inclinación están ocupados por placas de ensayo de 96 pozos. (C) En la posición superior, se encuentra la placa de 384 pozos para el conteo de celdas. A continuación se muestran dos posiciones para placas que están ocupadas por placas de 96 pozos para fines representativos y un bastidor para cuatro tubos de 50 ml y cuatro tubos de 15 ml. La posición más baja está ocupada por puntas de 5 ml. (D) Tres líneas de medios con posiciones para depósitos de medios. Las líneas de medios poseen sensores de nivel de líquido que permiten llenar automáticamente el depósito de medios con hasta 250 ml de medios. (E) Dos módulos de residuos líquidos con drenaje activo se basan en la parte superior, por debajo de un módulo de temperatura controlada con una posición para un contenedor (blanco) y un bastidor de punta de 5 ml se encuentran. (F) Cinco posiciones para puntas de 1 ml. (G) Dos módulos de temperatura controlada se colocan en la parte inferior y una posición para aparcar una de sus tapas en la parte superior. (H) Posiciones para dos bastidores de puntas anidados de 50 l (NTR) en la parte superior seguido de dos posiciones para un solo canal y 96 canales de recogida de puntas de 300 l y un bastidor de punta de 5 ml en la parte inferior. (I) Un apilador para placas de conteo de 384 pocillos en la parte superior seguido de tres NTR de 300 l y un bastidor de punta de 5 ml en la parte inferior. (J) Estación de almacenamiento y lavado para tres juegos de ocho agujas metálicas reutilizables de 1 ml. (K) Posición de los residuos para canales de pipeteo de 1 ml y 5 ml y NTR vacío (gris), así como un bloque de agarre para canales de 1 y 5 ml (blanco) utilizados para pasos de transporte en cubierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comprobación automatizada de la confluencia de hiPSC.
(A) Imágenes representativas de campo brillante (BF) de hiPSC tomadas por el citómetro celular (izquierda) y después del análisis automatizado de confluencia (derecha) que indican el área proporcional ocupada por las células en verde; (B) Porcentajes de confluencia registrados a partir de dos líneas hiPSC (#1 iPS y #2) desde el día 1 al 6 del cultivo, n á 4 placas de 1 poc por línea celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Transmisión de hiPSC.
(A) Imagen BF de una línea hiPSC cultivada manualmente (izquierda) y utilizando el sistema de cultivo automatizado (derecha). Las imágenes fueron tomadas 6 días después de la segunda aprobación; (B) Imágenes representativas de la vidrida de hiPSC para los marcadores de pluripotencia OCT4 y SSEA4, y contratenidas con Hoechst 33342 (Nuclei); (C) Resultados de qRT-PCR para los marcadores de pluripotencia OCT4, NANOG y REX1 en una línea hiPSC cultivados en duplicados (1 y 2) manualmente (m) y en el sistema de cultivo automatizado (a), y las respectivas neuronas corticales derivadas de hiPSC (Diff) en el día 8 (D8) de diferenciación. Los datos se representan como la cantidad relativa (RQ) utilizando iPS_a_1 como muestra de referencia. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de 3 réplicas técnicas de la reacción qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 y RPLPO se utilizaron como genes de limpieza. Barra de escala: 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Neuronas corticales derivadas de iPSC humanas.
(A) Imágenes de Campo brillante del día 6, manualmente (m) y automatizadas (a) neuronas corticales diferenciadas que muestran redes neuronales similares; (B) Imágenes representativas de células manchadas para TUBB3 (pan neuronal), BRN2 (neuronas corticales) y Hoechst 33342 (núcleos) el día 8 de diferenciación; (C) Resultados de qRT-PCR para genes marcadores de neuronas corticales (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 y SYN1) enriquecidos en el día 8 (D8) de diferenciación. Los datos se representan como la cantidad relativa (RQ) utilizando iPS_a_1 como muestra de referencia. Las barras de error representan el SD de 3 réplicas técnicas de la reacción qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 y RPLPO se utilizaron como genes de limpieza. Barra de escala: 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Un ensayo de alto rendimiento para el crecimiento de la neurita.
(A) Imágenes representativas de células que expresan la GFP los días 1, 3 y 11 de diferenciación; (B) Imágenes binarias representativas de neuritas en los días 1, 3 y 11 de diferenciación. El crecimiento de la neurita se cuantificó utilizando el software de análisis de imágenes de alto contenido 1 y se representa como longitud de neurita; (B) El gráfico muestra el aumento de la longitud de la neurita en las neuronas NGN2 derivadas de NPC y la formación de una red densa. Se obtienen imágenes de tres placas de 96 pozos con celdas en los 60 pozos internos. Para simplificar, solo se muestran tres columnas de pozos por placa de 96 pozos como ejemplo con n 6 pozos por columna. Se analizó un promedio de 1308 células por pozo. Las barras de error representan el error estándar de la media (S.E.M.). Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Neuronas mDA derivadas de iPSC humanas.
Las neuronas de Midbrain DA se diferencian manualmente (m) y en el sistema de cultivo automatizado (a). (A, B) Imágenes fluorescentes representativas de las neuronas mDA manchadas para la tirosina hidroxilasa (TH, marcador de neurona mDA; verde), MAP2 (marcador neuronal; rojo) y Hoechst 33342 (núcleos; azul); (C) Resultados representativos de qRT-PCR para genes marcadores de neuronas mDA diferenciados manualmente y en el sistema de cultivo automatizado. Los niveles de expresión TH y MAP2 se representan como cantidad relativa (RQ) normalizada a genes de limpieza (OAZ1 y GAPDH); (D) Porcentajes de neuronas positivas TH y MAP2 generadas por diferenciación manual y automatizada. Las barras de error representan el SD de dos diferenciaciones independientes realizadas con dos líneas iPSC distintas (#1 y #2). Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de celda	Propósito	Paso de protocolo	Densidad celular	Formato de placa	Número de celda/pozo
Diferenciación NGN2
Ipsc	Generación de línea estable NGN2	S.2.3.	30.000 células/cm2	12-pozo	1,17,000
Ipsc	Diferenciación de neuronas NGN2	3.1.3.	30.000 células/cm2	1-pozo	25,20,000
Ipsc	Diferenciación de neuronas NGN2	3.1.3.	30.000 células/cm2	96-pozo	9,600
generación de smNPC
smNPC	Días de replating 12 y 16	S5.9. y S5.11.	70.000 células/cm2	6-pozo	6,72,000
smNPC	Replating del pasaje 5	5.11.	50.000 células/cm2	6-pozo	4,80,000
smNPC	neuronas smNPC a NGN2	3.2.2	50.000 células/cm2	96-pozo	16,000
diferenciación mDA
Ipsc	diferenciación de neuronas mDA	4.1.2.	200.000 células/cm2	1-pozo	1,68,00,000
Neuronas DA	Día 25 replating	4.3.2.	400.000 células/cm2	1-pozo	3,36,00,000
Neuronas DA	Día 25 replating	4.5.2.	100.000 células/cm2	96-pozo	32,000
Capa	Propósito	Paso de protocolo	Concentración/ Dilución	Formato de placa	Detalles del recubrimiento
Cultura iPS
Matriz extracelular	línea iPSC, NGN2, neuronas mDA	1.5.7. y S2.3.	1 alícuota*; 25 mL DMEM/F-12	1-/12-bueno	8/0.5 mL/pozo; 1 h en RT
Diferenciación NGN2
Poli-L-Ornitina	Diferenciación de neuronas NGN2	3.1.3. y 3.2.2.	0,1 mg/ml; Pbs	1-/96-pozo	8/0.1 mL/pozo; 12 h a 37oC; 3x lavado PBS
Laminin	Diferenciación de neuronas NGN2	3.1.3. y 3.2.2.	5 g/ml; Pbs	1-/96-pozo	8/0.1 mL/pozo; 4 h a 37oC
generación de smNPC
Matriz extracelular	generación y cultura smNPC	S5.6., S5.9., S5.11.	1 alícuota*; 25 mL DMEM/F-12	6-pozo	1 mL; 2 h en RT
diferenciación mDA
Matriz extracelular	diferenciación mDA	4.1.2.	1 alícuota*; 25 mL DMEM/F-12	1-pozo	12 mL; 12 h a 37oC
Poli-L-Ornitina	diferenciación mDA	4.3.2. y 4.5.2.	0,1 mg/ml; Pbs	1-/96-pozo	12/0.1 mL/pozo; 12 h a 37oC; 3x lavado PBS
Laminin	diferenciación mDA	4.3.2. y 4.5.2.	10 g/ml; Pbs	1-/96-pozo	12/0.1 mL/pozo; 12 h a 37oC
Fibronectina	diferenciación mDA	4.3.2. y 4.5.2.	2 g/ml; Pbs	1-/96-pozo	12/0.1 mL/pozo; 12 h a 37oC
*Una alícuota de matriz extracelular se define como el factor de dilución (en L) presente en el Certificado de Análisis de este producto.

Tabla 1: Densidad y recubrimiento de celdas de siembra respectivas al formato de placa.

Día	Reactivo
Día 0 - 1	100 nM LDN193189, 10 m SB431542
Día 1 - 3	100 nM LDN193189, 10 m SB431542, 1 mM SHH, 2 mM purmortamina, 100ng/mL FGF-8b
Día 3 - 5	100 nM LDN193189, 10 m SB431542, 1 mM SHH, 2 mM purmortamina, 100ng/mL FGF-8b, CHIR99021 de 3 m
Día 5 - 7	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM purmortamina, 100ng/mLFGF-8b, 3 M CHIR99021
Día 7 - 9	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, CHIR99021
Día 9 - 11	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, CHIR99021
Día 11 - 13	3 M de ácido L-ascórbico (AA1), 20 ng/ml BDNF, 0,2 mM de ácido L-ascórbico (AA1), 20 ng/ml GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGF-3, 10 m DAPT
Día 13 - 65	20 ng/mL BDNF, 0,2 mM de ácido L-ascórbico (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGF-3, DAPT de 10 m

Tabla 2: Adición de moléculas pequeñas para la diferenciación de neuronas dopaminérgicas.

Día	Medio KSR	N2 medio	Medio de diferenciación
Día 0 - 1	100%	0	0
Día 1 - 3	100%	0	0
Día 3 - 5	100%	0	0
Día 5 - 7	75%	25%	0
Día 7 - 9	50%	50%	0
Día 9 - 11	25%	75%	0
Día 11 - 13	0	0	100%
Día 13 - 65	0	0	100%

Tabla 3: Gradiente de medios para la diferenciación de neuronas dopaminérgicas.

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Discusión

Introducimos un sistema automatizado de cultivo celular con capacidades de imagen integradas para la estandarización del cultivo hiPSC y la diferenciación neuronal. Debido a la mínima intervención del usuario, la variación experimental es baja asegurando la reproducibilidad de los fenotipos celulares durante la diferenciación. El programador basado en calendario admite la organización y la paralelización de experimentos y permite un alto grado de flexibilidad en el momento en que se llevan a cabo los experimentos. Los métodos existentes se pueden adaptar fácilmente y se puede aumentar el espectro de métodos disponibles. Además, se puede utilizar un gran número de formatos de placa de ensayo que añaden flexibilidad a este sistema. El sistema mínimo que consiste en una incubadora de_CO2, un brazo robótico, un citómetro de celdas de campo brillante y una estación de manipulación de líquidos forma la unidad básica necesaria para la cultura y diferenciación hiPSC, con costos asequibles para los laboratorios de investigación académica. La combinación del sistema automatizado de cultivo celular con un sistema automatizado de almacenamiento de -20 oC para el almacenamiento de compuestos, bibliotecas RNAi o bibliotecas CRISPR/Cas9, y la integración de un microscopio de alto contenido/alto rendimiento permiten la ejecución de exámenes fenotípicos.

En el estudio actual, el sistema automatizado de cultivo celular utilizó puntas desechables y los medios de cultivo se reabastecieron manualmente en el depósito, limitando así el uso de la estación de manipulación de líquidos para cambios en los medios y otros procesos de cultivo especialmente durante la noche. Para eludir esta limitación, los métodos se pueden ajustar al uso de agujas en lugar de puntas desechables y, después de instalar conexiones de tubos entre las líneas de medios y bolsas de medios almacenadas en una nevera, los depósitos de medios se pueden rellenar automáticamente con medios frescos precalentados por los elementos del calentador. Esto reduciría las interferencias del usuario causadas por el llenado manual de puntas, medios de cultivo e intercambios de reservorios.

Nuestro sistema automatizado de cultivo celular ofrece varias ventajas. Uno es el sistema de rastreo de códigos de barras. Las placas cargadas en el sistema se identifican mediante un código de barras único que es leído y guardado por el sistema que permite el seguimiento de las muestras durante y después de la ejecución del método. Otra ventaja es la posibilidad de crear proyectos específicos para cada usuario. Aquí, las placas de referencia cultural cargadas en el sistema se pueden asignar a un proyecto específico y agruparse en lotes. La estructuración en lotes simplifica la ejecución del mismo procedimiento a todas las placas de un determinado lote, ya que no es necesario seleccionar placas individuales. Además, un editor de clases líquidas permite ajustar la velocidad y la altura del pipeteo, así como los parámetros de aspiración y dosificación para cada paso de transferencia de líquido. Cada proceso se documenta en archivos de registro que permiten volver a trazar qué tareas se han realizado para una referencia cultural o placa de ensayo determinada.

Las neuronas y otros tipos de células derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son herramientas in vitro útiles para estudiar los mecanismos de las enfermedades neurodegenerativas en poblaciones específicas de pacientes (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas para la enfermedad de Parkinson) que ofrecen la posibilidad de exámenes de drogas personalizados. El cultivo de hiPSC es muy intensivo en tiempo y exige que las personas capacitadas ejecuten protocolos complejos de diferenciación, generalmente limitados a la producción a baja escala. Adaptamos el cultivo libre de alimentadores de hiPSC a un cultivo automatizado e implementamos dos protocolos de diferenciación neuronal, un protocolo de diferenciación rápida de neuronas corticales basado en la sobreexpresión NGN2 bajo un promotor de tet-on^10,11, y un protocolo a largo plazo basado en moléculas pequeñas para la generación de neuronas dopaminérgicas de cerebroinérgico medio (mDA)¹³. La transferencia directa y reproducibilidad de los protocolos manuales de cultura y diferenciación hace que el sistema de cultivo automatizado sea muy útil. El iPSC humano cultivado en el sistema automatizado de cultivo celular mostró una morfología constante de las células madre y expresó importantes marcadores de pluripotencia, reproducibles entre experimentos independientes. Además, la automatización del protocolo de cultivo hiPSC favoreció la cultura y la expansión de un mayor número de líneas celulares en paralelo. Comprobaciones automatizadas de confluencia programadas para realizarse durante la noche ahorrando tiempo dejando el sistema libre durante el día para los pasos del proceso descendente llevados a cabo cuando el usuario estaba en el laboratorio (por ejemplo, la cosecha de células o la replata manual para diferenciaciones). Al alcanzar el umbral de confluencia definido por el usuario, las células se distribuyen y se replatan en placas extracelulares recubiertas de matriz disponibles en el apilador del sistema automatizado de cultivo celular. Cada ronda de paso dura unos 70 minutos y genera cuatro placas de 1 pozo a partir de una placa principal, lo que se traduce en una capacidad de 20 pasajes en un día.

La automatización del protocolo de diferenciación NGN2 se realizó con éxito y permitió la generación de una población homogénea de células neuronales a través de diferentes pasajes y comparable a las diferenciaciones manuales. Además, los costos experimentales de los estudios de cribado a gran escala que implican múltiples líneas celulares o experimentos de cribado con miles de condiciones/compuestos de prueba se reducirían debido a las rápidas diferenciaciones. Las lecturas rentables y de alto rendimiento, incluidas las mediciones de crecimiento de neuritas en vivo, se pueden desarrollar, implementar y utilizar fácilmente como lecturas fenotípicas para el modelado de enfermedades, como se mostró anteriormente^14,15,16. Por lo tanto, adaptamos aún más el protocolo NGN2 utilizando células precursoras neuronales derivadas de moléculas pequeñas (smNPC) que constituyen una GFP excesivamente expresiva. Las células smNPC ofrecen más ventajas, incluyendo costos reducidos con medios de cultivo (un tercio del costo con cultivo iPSC) y el tiempo necesario para ampliar los experimentos. Los rendimientos celulares de smNPC son 7 a 10 veces mayores que los obtenidos con iPSC. Las neuronas diferenciadoras fueron monitoreadas e imágenes con éxito durante varios días utilizando un proceso de imágenes totalmente automatizado sin la necesidad de tinciones manuales de anticuerpos o etiquetado químico, ahorrando costos y tiempo necesario para los procedimientos manuales, incluyendo la imagen por sí mismo. La imagen actual de los 60 pozos internos de una placa de 96 pozos tarda alrededor de 16 minutos por placa cuando se muestran 25 campos por pozo, lo que significa que los datos para una detección basada en imágenes para 1000 compuestos, podrían ser adquiridos y analizados en un día. En el futuro, esta lectura podría utilizarse en estudios de cribado compuestos para el rescate de defectos de crecimiento de neuritas.

Además, también demostramos la transferencia de un protocolo de diferenciación manual para generar neuronas dopaminérgicas de cerebro medio (mDA) a partir de iPSC. Este pequeño protocolo de diferenciación basado en moléculas toma 65 días y es laborioso debido a los múltiples pasos de replata y cambios frecuentes en los medios, principalmente cada 2 días, lo que limita la producción de neuronas mDA a pocas líneas iPSC al mismo tiempo. El protocolo automatizado de diferenciación mDA tiene la gran ventaja de ampliar la diferenciación a docenas de líneas iPSC. Se pueden diferenciar en paralelo hasta 30 líneas celulares. Dado que la diferenciación se basa principalmente en los cambios en los medios, casi todo el proceso de diferenciación se puede llevar a cabo sin interferencias humanas. Usando el programador basado en calendario del sistema automatizado, podríamos planificar los cambios de medios de acuerdo con los pasos de diferenciación. Una limitación de trabajar con un número tan grande de líneas celulares y placas de cultivo fue la imposibilidad de realizar cambios en los medios de comunicación durante la noche. La razón principal es el hecho de que nuestro sistema está configurado para el uso de puntas desechables y el llenado manual de medios de cultivo que requieren un usuario en el laboratorio para ejecutar este paso manual. Para facilitar el proceso de modificación de medios, las placas cargadas en el sistema se asignaron a un proyecto y se agruparon en lotes. El tamaño del lote se adaptó entonces al número de puntas desechables y al volumen de medios de cultivo disponibles. Como se mencionó anteriormente, esta limitación se puede superar fácilmente mediante la implementación de agujas reutilizables / lavables y el llenado automatizado de medios. El transeúnte/replating automatizado de células, como se muestra para iPSC, es una de las comodidades que ofrece nuestro sistema automatizado de cultivo celular. Hemos probado el replating automatizado de las neuronas mDA en el día 25 de diferenciación. Sin embargo, la disociación de las neuronas mDA requiere una incubación más larga (40 min) con la enzima de disociación que iPSC (8 min) extendiendo el proceso de replating automatizado a más de 1 h por línea celular. Como consecuencia, el replatado automatizado de 30 líneas celulares en el mismo día se hizo imposible. Acelerar otros pasos durante el replating automatizado (transporte de placas, pipeteo) y adaptar el sistema al uso de agujas y líneas de medios que haga posible un trabajo nocturno resolvería esta limitación. A pesar de los inconvenientes, podríamos transferir con éxito el protocolo manual a una diferenciación automatizada de las neuronas mDA que producen cultivos con cantidades sustanciales de células positivas MAP2 (neuronas) y TH (mDA).

Diferenciar docenas de líneas celulares iPSC en paralelo es de gran interés en proyectos que investigan los mecanismos moleculares de las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, completar tareas más rápido con menos errores y a costos reducidos es un gran desafío. Debido a la automatización de los protocolos presentados aquí (iPSC, smNPC y mDA neurona), podríamos acelerar, reducir los costos y aumentar la reproducibilidad en nuestros proyectos. El desarrollo de proyectos como FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) que involucran cientos de líneas celulares para pacientes muestra la necesidad de protocolos automatizados de cultivo y diferenciación. Nuestras perspectivas futuras incluyen la transferencia de modelos manuales de cultivo celular 3 dimensional (3D) al sistema automatizado. Las adaptaciones menores en los ajustes de definición de placas y el uso de adaptadores permitirán el uso de placas comerciales o a medida y cámaras microfluídicas necesarias para los cultivos 3D. Además, la implementación de un modelo automatizado de imágenes sin etiquetas nos permitirá realizar un seguimiento del crecimiento neuronal en tiempo real y traducir los cambios en el crecimiento de la neurita, la organización de las neuronas y la muerte celular en una mejor comprensión de los mecanismos de la enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpos	Distribuidor	>Número de catálogo	>Dilución
iPSC marcador de pluripotencia
ratón anti-SSEA4	Abcam	ab16287	1 a 33
Conejo anti-Oct3/4	Abcam	ab19857	De 1 a 200
NGN2 fuertes
ratón fuerte anti-TUBB3	R & D	MAB1195	1 a 500
Conejo anti-BRN2	NEB	12137	1 a 1.000
marcadores neuronales mDA
Chicken anti-TH	Pel-Freez Biologicals	12137	1 a 750
Ratón anti-MAP2	Santa Cruz	sc-74421	1 a 750
Anticuerpos secundarios
IgY anti-pollo para cabras, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11039	1 a 2.000
IgG anti-ratones para cabras, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029	1 a 2.000
IgG anti-ratones para cabras, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	1 a 2.000
IgG anti-conejo para cabras, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 a 2.000
IgG anti-conejos para cabras IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 a 2.000
IgG anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	a 2.000
Núcleos contratinción
Hoechest 33342	Invitrogen	H3570	1 a 8.000
Instrumentos	Distributor	Número de catálogo	Descripción/Aplicación
Agilent Sistema TapeStation	Agilent technologies	4200	Electroforesis automatizada para muestras de ADN y ARN
Automatizado -20 ° Sistema de almacenamiento C	Hamilton Storage Technologies	Sample Access Manager (SAM -20C, serie 3200)	Almacenamiento de reactivos Lector de
código de barras	Honeywell	Lector de códigos de barras Honeywell Escáner	de código de barras
Citomatizado de células de campo claro	Nexcelom	Celigo	Comprobación de confluencias y
CellVoyager 7000	Yokogawa	CellVoyager 7000	Microscopio confocal automatizado
Cytomat para cultivos celulares	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 24 C, CU	12 apiladores paso 28 mm, 12 apiladores paso 23 mm (total de 456 placas)
Cytomat para la descongelación de muestras	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 2-LIN, 60 DU (unidad de secado)	2 apiladores paso 28 mm (total de 42 placas)
Filtros HEPA	Hamilton Robotics	Campana Flow Star	UV modificada por Hamilton Robotics Estación
tratamiento de líquidos	Hamilton	Robotics Microlab Star	Channels: 8 canales de 1 ml, 4 de 5 ml y 96 canales MPH
Depósito de medios	Hamilton Robotics	188211APE	Depósito de medios/reactivos
Sistema de agua pura	Veolia Water	ELGA PURELAB Classic	Proporciona agua pura para estación de lavado de agujas
Sistema de PCR QuantStudio 12K Flex Real-Time	Thermo Fisher Scientific	QSTUDIO12KOA	Máquina de PCR en tiempo real
Brazo robótico	Hamilton Robotics	Rackrunner	Transporte de placas
Mesa giratoria	Hamilton Robotics	Mesa giratoria Ajustar la orientación de la placa
alimentación ininterrumpida	APC	Smart UPS RT, 10000 VA Potencia suministro	Fuente de alimentación
de respaldo VIAFLO-pipetas Integra		4500	Pipeta electrónica
ViiA 7 Sistema de PCR en tiempo real	Applied Biosystems	4453545	Máquina
Materiales	Distributor	>Número de catálogo	< strong>Notes
1 pocillo placa de cultivo (84 cm2)	Thermo Fischer Scientific		165218 Nunc OmniTray
(9,6 cm2)	Greiner Bio-One	657160	TC tratada con tapa
Placa de cultivo de 12 pocillos (3,9 cm2)	Greiner Bio-One	665180	TC tratada con tapa
Placa de cultivo de 96 pocillos (0,32 cm2)	Perkin Elmer	6005558	CellCarrier-96 Punta de placa negra
, 50-µ L	Hamilton Robotics	235987	Puntas de 50 uL
Puntas, 300 y micro; L	Hamilton Robotics	235985	300-µ Puntas L
Puntas, 1000-µ L	Hamilton Robotics	235939	1000-µ Puntas en L
Puntas de 5 mL	Hamilton Robotics	184022	Puntas de 5 mL
Tubos, 15 mL	Greiner Bio-One	188271	Tubos de 15 mL
Tubos, 50 mL	Greiner Bio-One	227261	Tubos de 50 mL Viales
criogénicos de 2,0 mL	de Nalgene Sigma Aldrich	V5007	Crioviales
plásmidos	Distributor	Número de catálogo	Notas
pLV_hEF1a_rtTA3	Addgene	61472	Amable regalo de Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro	Addgene	61474	Amable regalo de Ron Weiss
lentivirus pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 Takara	Bio	631983
Primadores	Secuencia (adelante)	Secuencia (inversa)	Fuente
iPSC pluripotencia
OCT4 (ID 4505967a1)	CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG	GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC	PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3)	CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA	CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC	PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1)	AGAAACGGGCAAAGACAAGAC	GCTGACAGGTTTTATTTCCGC	PrimerBank
NGN2 neuronas
MAP2 (ID 87578393c1)	CTCAGCACCGCTAACAGAGG	CATTGGCGCTTCGGACAAG	PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1)	CGGCGGATCAAACTGGGATTT	TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT	PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2)	CGAGACCTCCACACTTCGTG	TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG	PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3)	TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC	CTCACAGCGATAAGTGCCCTC	PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)	TGCTCAGCAGTACAACGTACC	GACACTTGCGATGTCCTGGAA	PrimerBank
mDA neuronas
TH	CGGGCTTCGGACCAGGTGTA	CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA	NCBI primer-BLAST
MAP2	GGATCAACGGAGAGCTGAC	TCAGGACTGCTACAGCCTCA	NCBI primer-BLAST
strong>Housekeeping genes
GAPDH	GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG	GAGCCAGCCTTCTCCATG	NCBI primer-BLAST
OAZ1	AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT	ATGAAGACATGGTCGGCTCG	NCBI primer-BLAST
RPLPO	CCTCATATCCGGGGGAATGTG	GCAGCAGGGGGCATTG NCBI	primer-BLAST
RPL13A	GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC	TGGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC	NCBI primer-BLAST
Medios y reactivos	>Distribuidor	>Número de catálogo	>Concentración de uso
>Matriz de recubrimiento
Matriz extracelular (Matrigel)	Corning	354277	10 μ g/mL
de fibronectina	Corning	356008	2 μ g/mL
Laminin	Sigma	L2020	5 - 10 μ g/mL
de poli-L-ornitina (PLO)	Sigma	P3655	0,1 mg/mL
medio de cultivo
cultivo (Essential 8 Flex medium)	Gibco	A2858501
neuronas NGN2 - medio NGN2
2-mercaptoetanol	Gibco	21985023	0,909 mL (50 y micro; M)
B27 suplemento	Gibco	12587010	10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX	Gibco	31331093	484.75 mL
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL ( 2 mM)
Insulina	Sigma	I9278	0.25 mL (2.5 &; g/mL)
MEM Aminoácidos No Esenciales	Gibco	11140050	5 mL (0.5%)
Suplemento de N2	Gibco	17502048	5 mL (0.5%)
Medio neurobasal	Gibco	21103049	485 mL
mDA neuronas - SRM medio
2-mercaptoetanol	Gibco		21985023 0.5 mL (55 µ M)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12	Gibco	12660012	409.5 mL
Knockout sérum de reemplazo (reemplazo de suero)	Gibco	10828028	75 mL (15%)
MEM Aminoácidos No Esenciales	Gibco	11140050	5 mL (1%)
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	5 mL (1%)
mDA fuertes - N2 Suplemento
B27	Gibco	12587010	10 mL (2%)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
Suplemento de N2	Gibco	17502048	5 mL (1%)
Medio neurobasal	Gibco	21103049	475 mL
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	5 mL(1%)
mDA fuertes - Medio de diferenciación
B27	fuerte Gibco		12587010 10 mL (2%)
Medio neurobasal	Gibco	21103049	485 mL
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	5 mL (1%)
fuertes - Suplementos
Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)	Peprotech	450-02	10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R& D	4423/10	2 y mu; M
Doxiciclina (dox)	Sigma	D9891	2.5 μ g/mL
Factor neurotrófico derivado de glial (GDNF)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
Ácido L-ascórbico 2-fosfato magnesio (AA2)	Sigma	A8960	64 mg/L
Factor neurotrófico-3 (NT-3)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
Purmorfamina (PMA)	Caimán	10009634	0,5 μ
M Puromicina	Sigma	P8833-10MG	0.5 μ g/mL
de tiazovivina	Merk Millipore	420220-10MG	2 μ Neuronas M
mDA - Suplementos cerebro<
br/> (BDNF)	Peprotech	450-02	20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R& D	4423/10	3 y mu; M
DAPT	Caimán	13197	10 y micro; M
Dibutiril-cAMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	1 mM
Factor de Crecimiento de Fibroblastos 8B (FGF-8b)	Peprotech	100-25	100 ng/mL
Factor Neurotrófico Derivado de Glial (GDNF)	Peprotech	450-10	20 ng/mL
Ácido L-ascórbico (AA1)	Sigma	A4403	0.2 mM
LDN193189 (LDN)	Cayman	11802	100 nM
Purmorfamina (Purm)	Caimán	10009634	2 μ M
Erizo Sónico/Shh (C24II) N-Terminus (SHH)	R& D	1845-SH	100 ng/mL
SB431542 (SB)	Caimán	13031	10 μ M
Factor de Crecimiento Transformante type ß 3 (TGFß 3)	R& D	243-B3	1 ng/mL
Y-27632	Caimán	10005583	10 µ Reactivos
>disociación M
Reactivo de disociación de una sola célula (StemPro Accutase)	Gibco	A1110501	1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Gibco	11575020	0.5
mM< aislamiento > ARN fuerte y kit < aislamiento >
aislamiento	Qiagen	74106	Rneasy MiniKit
Tampón de lisis de ARN	Thermo Fisher Scientific	15596018	Tampón de lisis de Trizol (tampón de lisis de ARN )
Transcriptasa inversa (kit)	Thermo Fisher Scientific	18080-085	SuperScript III Reverse Transcriptasa
Software	Company	>Número de catálogo	Description/Application
Cell Culture Framework (CCF) (Interfaz gráfica de usuario, GUI)	Hamilton Robotics	Interfaz de usuario personalizada	para el sistema automatizado
CellPathFinder software (software de análisis de imágenes 1)	Yokogawa	CellPathfinder HCS Software Herramienta de análisis de	imágenes
Sistema de medición CellVoyager	Yokogawa	Incluido con CellVoyager 7000	Microscopio de control
software Columbus (software de análisis de imágenes 2)	Perkin Elmer	Columbus	Herramienta de análisis de imágenes
Aplicación de qPCR basada en la nube	Thermo Fisher Scientific	Themo Fisher	Software de análisis para datos qRT-PCR
Venus software	Hamilton Robotics	VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software	Software de control para el sistema automatizado

1 Orbit recuento de células de Sistema de Unidad de PCR en tiempo realPlacas de cultivo de 6 pocillos <iPSC medio de ARNc kit de