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Artículo de método

Un nuevo paradigma de acondicionamiento del miedo pavloviano para estudiar la congelación y el comportamiento del vuelo

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DOI:

10.3791/61536

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5 de enero de 2021

 , 
1Department of Psychology, Tulane University, 2Tulane Brain Institute, Tulane University

En este artículo

Resumen

Las respuestas conductuales defensivas están supeditadas a la intensidad de la amenaza, la proximidad y el contexto de exposición. Basándonos en estos factores, desarrollamos un paradigma de acondicionamiento clásico que provoca transiciones claras entre la congelación condicionada y el comportamiento de vuelo dentro de sujetos individuales. Este modelo es crucial para entender las patologías implicadas en la ansiedad, el pánico y los trastornos de estrés postraumáticos.

Resumen

Los comportamientos relacionados con el miedo y la ansiedad contribuyen significativamente a la supervivencia de un organismo. Sin embargo, las respuestas defensivas exageradas a la amenaza percibida son características de varios trastornos de ansiedad, que son la forma más prevalente de enfermedad mental en los Estados Unidos. Descubrir los mecanismos neurobiológicos responsables de los comportamientos defensivos ayudará al desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas. El acondicionamiento del miedo pavloviano es un paradigma de laboratorio ampliamente utilizado para estudiar el aprendizaje y la memoria relacionados con el miedo. Una limitación importante de los paradigmas tradicionales de acondicionamiento del miedo pavloviano es que la congelación es el único comportamiento defensivo monitoreado. Recientemente desarrollamos un paradigma modificado de acondicionamiento del miedo pavloviano que nos permite estudiar tanto la congelación condicionada como el comportamiento de vuelo (también conocido como escape) dentro de sujetos individuales. Este modelo emplea zapatas de mayor intensidad y un mayor número de emparejamientos entre el estímulo condicionado y el estímulo sin condiciones. Además, este paradigma de vuelo condicionado utiliza la presentación en serie de estímulos auditivos de tono puro y ruido blanco como estímulo condicionado. Después del acondicionamiento en este paradigma, los ratones exhiben un comportamiento de congelación en respuesta al estímulo del tono y respuestas de vuelo durante el ruido blanco. Este modelo de acondicionamiento se puede aplicar al estudio de transiciones rápidas y flexibles entre las respuestas conductuales necesarias para la supervivencia.

Introducción

El miedo es una respuesta adaptativa conservada evolutivamente a una amenaza inmediata1,2. Mientras que los organismos poseen respuestas defensivas innatas a una amenaza, las asociaciones aprendidas son cruciales para obtener respuestas defensivas apropiadas a los estímulos predictivos del peligro3. Es probable que la desregulación en los circuitos cerebrales que controlan las respuestas defensivas contribuya a reacciones maladaptivas asociadas con múltiples trastornos de ansiedad debilitantes, como trastorno de estrés postraumático (TEPT), trastorno de pánico4y fobias específicas5,6. La tasa de prevalencia en los Estados Unidos para los trastornos de ansiedad es del 19,1% para los adultos y del 31,9% en los adolescentes7,8. La carga de estas enfermedades es extremadamente alta en la rutina diaria de los individuos y afecta negativamente su calidad de vida.

En las últimas décadas, el acondicionamiento del miedo pavloviano ha servido como un potente sistema modelo para obtener una visión tremenda de los mecanismos neuronales subyacentes al aprendizaje y la memoria relacionados con el miedo9,10,11. El acondicionamiento del miedo pavloviano implica emparejar un estímulo condicionado (CS, como un estímulo auditivo) con un estímulo irreversible sin condiciones (EE.UU.; por ejemplo, un footshock eléctrico)12. Debido a que la congelación es el comportamiento dominante evocado y medido en paradigmas estándar de acondicionamiento pavloviano, los mecanismos de control neuronal de las formas activas de comportamiento defensivo, como las respuestas de escape/vuelo, permanecen en gran medida inexplorados. Estudios previos muestran que diferentes formas de comportamiento defensivo, como el vuelo, se evocan dependiendo de la intensidad de la amenaza, proximidad y contexto13,14. Estudiar cómo el cerebro controla diferentes tipos de comportamiento defensivo puede contribuir significativamente a la comprensión de los procesos neuronales que están regulados en trastornos de miedo y ansiedad.

Para hacer frente a esta necesidad crítica, desarrollamos un paradigma de acondicionamiento pavloviano modificado que provoca saltos de vuelo y escape, además de congelar15. En este paradigma, los ratones están condicionados con un estímulo compuesto serie (SCS) que consiste en un tono puro seguido de ruido blanco. Después de dos días de emparejar el SCS con una fuerte zapata eléctrica, los ratones exhiben congelación en respuesta al componente de tono y vuelo durante el ruido blanco. Los interruptores de comportamiento entre la congelación condicionada y el comportamiento del vuelo son rápidos y consistentes. Curiosamente, los ratones exhiben el comportamiento de vuelo sólo cuando el CS de ruido blanco se presenta en el mismo contexto que un footshock entregado previamente (el contexto de acondicionamiento) pero no en un contexto neutro. En cambio, las respuestas de congelación dominan en este contexto neutro, con niveles significativamente mayores de congelación en respuesta al ruido blanco en comparación con el tono. Esto es consistente con el papel del contexto en la modulación de la intensidad de la respuesta defensiva y con el papel regulatorio de la información contextual en el aprendizaje relacionado con el miedo y la memoria que se encuentra en los paradigmas tradicionales de acondicionamiento de amenazas16,17. Este modelo permite comparaciones directas dentro del sujeto de múltiples comportamientos defensivos de una manera específica del contexto.

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Protocolo

Los siguientes pasos/procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso animal de la Universidad de Tulane.

1. Preparación de ratones

  1. Utilice ratones adultos machos y/o hembras de entre 3 y 5 meses. En el presente estudio, utilizamos ratones macho C57BL/6J obtenidos del Laboratorio Jackson, pero cualquier cepa de ratón de un proveedor de buena reputación se puede utilizar.
  2. Al menos una semana antes del experimento, alberga a todos los ratones individualmente en un ciclo claro/oscuro de 12:12 h a lo largo del estudio. Proporcione a los ratones acceso ad libitum a alimentos y agua.
  3. Realice todos los experimentos conductuales durante el ciclo de luz. Realice todas las sesiones a la misma hora del día dentro de una cohorte individual. Por ejemplo, si inicia el experimento a las 9 a. m. del día 1, continúe comenzando en ese momento hasta que se complete el experimento.

2. Preparación de materiales de estudio

  1. Contextos de estudio
    1. Elija dos contextos diferentes para realizar los experimentos.
    2. Utilice una cámara cilíndrica compuesta por plexiglás transparentes (diámetro 30 cm) como contexto A, con un suelo liso de Plexiglás. La altura de la cámara debe ser suficiente para evitar la fuga (al menos 30 cm de altura).
    3. Para context B utilice una carcasa rectangular (25 cm x 30 cm) con un suelo de rejilla eléctrica utilizado para entregar zapatas de corriente alterna. La altura de esta cámara es muy importante y debe ser de al menos 35 cm. de altura. Como alternativa, utilice una cubierta transparente (asegúrese de que el vídeo se puede grabar a través de este material).
      NOTA: Utilice una cámara con superficies de pared lisas que se puedan limpiar fácilmente.
    4. Utilice una solución de limpieza diferente para limpiar los contextos. Por ejemplo, contexto limpio A con 1% ácido acético y contexto B con 70% etanol. Limpie los contextos antes de comenzar la primera sesión, entre probar ratones individuales y después de completar las sesiones del día. Esto es vital para eliminar las señales olfativas de ratones anteriores. Una limpieza exhaustiva también ayudará a prevenir la escala de orina en la rejilla de choque, lo que comprometerá las sesiones de acondicionamiento.
      NOTA: Las soluciones de limpieza también sirven como una señal olfativa, por lo tanto, utilizan el mismo líquido de limpieza para un contexto particular.
    5. Coloque el contexto A o el contexto B en un cuadro atenuante de sonido durante las sesiones de estudio respectivas.
  2. Generador de audio
    1. Monte un altavoz superior a los contextos para entregar estímulos auditivos a 75 dB.
    2. Utilice un generador de audio programable para generar estímulos auditivos en un horario predefinido. El tono puro de 7,5 kHz es un sonido con una forma de onda sinusoidal, mientras que el ruido blanco es una señal aleatoria que tiene la misma intensidad a diferentes frecuencias, que van desde 1-20.000 Hz.
    3. Utilice pulsos TTL para entregar estímulos auditivos y señales de choque con precisión temporal.
      NOTA: Antes de iniciar los experimentos, mida la salida de intensidad de sonido del altavoz montado en cada cámara utilizando un medidor dB.
  3. Amortiguador: Conecte el amortiguador con el suelo de la red eléctrica que se utiliza para entregar el amortiguador de CA de 0,9 mA. Defina la frecuencia, el inicio y la duración de los choques en un programa informático. Entregue cada estímulo de choque al final de cada SCS durante una duración de 1 s, un total de cinco emparejamientos de choque SCS por sesión de acondicionamiento.

3. Preparación del programa informático y seguimiento de vídeo

  1. Genere protocolos de comportamiento mediante la codificación en un programa de software.
  2. En el programa, defina el estímulo compuesto serie SCS. Este estímulo es una presentación en serie de un tono puro de 10 s (cada pip se presenta para 500 ms, a una frecuencia de 7,5 kHz y una velocidad de 1 Hz) y un ruido blanco de 10 s (500 ms pips a 1 Hz).
  3. Defina los intervalos entre ensayos (ITI) presentados después de cada ensayo, pseudoaleadomly.
  4. Durante el estudio, registre todo el comportamiento del ratón en vídeo para su posterior análisis.
    NOTA: Es posible que las cajas de acondicionamiento de miedo disponibles comercialmente no se configuren para grabar los comportamientos a través de la cámara montada en la parte superior. Esto es muy importante ya que el vídeo grabado se utiliza para calcular el movimiento horizontal, la velocidad y la distancia total recorrida por el animal.
  5. Para establecer el seguimiento de software, coloque un ratón de prueba en cada contexto relevante, ajuste la sensibilidad de seguimiento de curvas de nivel y defina el centro de gravedad. Esto garantizará la adquisición de datos fiables en posición relativa. Además, defina todo el área de contexto accesible al sujeto.
    NOTA: El ajuste del tamaño del contorno para ambos contextos es importante, ya que el cambio de brillo en diferentes contextos cambiará el tamaño del contorno.
  6. Determine un coeficiente de calibración utilizando los tamaños conocidos de las cámaras y las dimensiones de píxeles de la cámara que se pueden utilizar para calcular la velocidad (cm/s).
  7. Sincronice los eventos de marca de tiempo del equipo de adquisición de datos con sus apariciones en tiempo real.

4. Experimento conductual

  1. Encienda todo el equipo: computadoras, controlador de caja de acondicionamiento de miedo, amortiguador y software de grabación de vídeo y marca de tiempo. Asegúrese de que los instrumentos estén encendidos en el orden adecuado.
  2. Compruebe todas las funciones, incluidos el tono, el ruido blanco y la entrega de golpes, y configure el sistema para la adquisición de datos.
  3. Transporte a los animales desde su trastero hasta el salón de acondicionadores. Permítales aclimatarse allí durante al menos 10 minutos.
  4. Saque al animal de la jaula de origen, colóquelo suavemente en el contexto respectivo y, a continuación, active inmediatamente los programas informáticos.
    NOTA: La inicialización tanto del sistema de acondicionamiento del miedo como del software de recopilación de datos (marcas de tiempo, seguimiento del ratón y grabación de vídeo) a la vez se puede sincronizar mediante activaciones mediadas por pulso TTL.
  5. Preacondicionamiento/Preexposición
    1. El día 1, coloque el tema en el contexto A (contexto neutro). Permítale aclimatarse a la cámara durante 3 min (el período de referencia) y, a continuación, exponerla a 4 ensayos de un SCS de 20 s de duración total(Figura 1A-1B).
    2. Mantenga una ITI pseudorrandom promedio de 90 s (rango 80-100 s). La duración total de cada sesión previa a la exposición es de 590 s.
  6. Condicionamiento del miedo
    1. El día 2 y el día 3, coloque el tema en el contexto B. Después de un período de línea de base de 3 minutos, exponga el tema a cinco emparejamientos del SCS co-terminando con un 1 s, 0.9 mA AC footshock.
    2. Mantenga una ITI pseudorrandom promedio de 120 s (rango 90-150 s). Que cada sesión de acondicionamiento dure 820 s en total(Figura 1A).
    3. Dependiendo del objetivo del experimento, sujeto ratones en el día 4 a una prueba de recuperación (ver paso 4.7) o para temer la extinción (ver paso 4.8).
  7. Recuerdo del miedo (para probar la dependencia del contexto)
    1. El día 4, coloque el tema en el Contexto A. Después del período de línea de fondo de 3 minutos, preséntelo con 4 ensayos del SCS sin footshock, sobre 590 s.
    2. Mantenga una ITI pseudorrandom promedio de 90 s (rango 80-100 s).
  8. Temen extinción
    1. El día 4, coloque el tema en el contexto B. Después del período de línea de base de 3 minutos, presente 16 ensayos del SCS sin footshock, a lo largo de 1910 s.
    2. Mantenga una ITI pseudorandom promedio de 90 s (rango 60-120 s).
  9. Devolver al animal a su jaula de origen y repetir el procedimiento para todos los animales.

5. Cuantificación del comportamiento

  1. Pida a un observador ciego al experimento que puntúe los vídeos grabados para congelar el comportamiento mediante umbrales automáticos del detector de congelación seguidos de un análisis fotograma a fotograma de los cambios de píxeles.
    NOTA: Otros paquetes de software también se pueden utilizar para calcular la congelación automáticamente mediante el uso de 2 sistemas de cámara. También es posible que un observador puntúe manualmente el comportamiento de congelación.
  2. Defina la congelación como un cese completo de los movimientos corporales, excepto los necesarios para la respiración, durante un mínimo de 1 s.
  3. Puntúa saltos cuando las 4 patas salen del suelo, lo que resulta en un movimiento vertical y/u horizontal.
  4. Exporte el archivo marcado con marcadores de congelación, salto y evento.
  5. Extraiga eventos relevantes (congelación y saltos) de períodos de tiempo definidos (por ejemplo, 10 s de duración de pre-SCS, tono y ruido blanco, para cada prueba).
  6. Utilizando las duraciones de inicio-detención extraídas de eventos en un archivo de hoja de cálculo, calcule la duración de la congelación (en s) restando la hora de inicio de la hora de finalización, de los períodos de prueba respectivos.
  7. Represente este ensayo de datos o en el día, resumiendo la duración de congelación de todos los ensayos.
    NOTA: Dependiendo del propósito del estudio, los comportamientos de vuelo o congelación se pueden puntuar y calcular a partir de cualquier ensayo/duración de la sesión de estudio.
  8. Suma el número total de saltos de una duración de prueba determinada.
  9. Extraiga el archivo generado por las coordenadas de seguimiento del ratón del movimiento del eje X-Y fotograma por fotograma del centro de gravedad del ratón y calcule la velocidad del ratón (cm/s).
    NOTA: Los datos de velocidad pueden estar presentes en formato cm/s o píxel/s. Convierta la unidad de píxeles a cm/s utilizando el valor de pulgadas o cm/píxel definido en el vídeo para ese contexto de prueba (consulte la sección 3.6).
  10. Después de extraer datos de velocidad para el movimiento fotograma a fotograma del animal, basados en la velocidad de fotogramas del vídeo (preferiblemente 30 fotogramas/s), calcule la velocidad media del animal en un soporte de número de fotograma específico (multiplique las horas de inicio y finalización en s por 30 para obtener el número de fotograma inicial y final).
  11. Calcule las puntuaciones de vuelo dividiendo la velocidad media durante cada SCS por la velocidad media durante los 10 s pre-SCS (línea base, BL) y luego agregando 1 punto para cada salto de escape (speedCS/speedBL + # de saltos). Por lo tanto, una puntuación de vuelo de 1 indica que no hay ningún cambio en el comportamiento del vuelo desde el período anterior al SCS.
  12. Opcionalmente, puntúe vídeos manualmente para otros comportamientos como la crianza y el aseo personal.

6. Análisis estadístico

  1. Analice los datos para obtener una significación estadística utilizando el software de análisis estadístico. Para todas las pruebas, la definición de significancia estadística es P<0.05.
  2. Compruebe los datos para la distribución normal utilizando la prueba de normalidad Shapiro-Wilk (α=0.05).
  3. Para probar el efecto de las señales, lleve a cabo las comparaciones en pares utilizando la prueba paramétrica (t-test emparejada) o no paramétrica (prueba de rango firmado de Wilcoxon).
  4. Para evaluar la interacción bidireccional de los factores (ensayo cue X), realice un ANOVA bidireccional seguido de pruebas post-hoc (por ejemplo, la prueba de comparación múltiple de Bonferroni/prueba de Tukey).

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Resultados

Como se describe en el diagrama (Figura 1A), la sesión comienza con preexposición (Día 1), seguido por el acondicionamiento del miedo (Días 2 y 3), y luego la extinción o recuperación (Día 4).

Las presentaciones del SCS en la sesión previa a la exposición (día 1) no provocaron respuesta de vuelo o congelación en los ratones (Figura 2A-2B). El análisis conductual durante el acondicionamiento (días 2 y 3) reveló que el ...

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Discusión

Los parámetros de sonido y choque descritos son elementos importantes de este protocolo. Por lo tanto, es fundamental probar la amplitud de choque y el nivel de presión sonora antes de iniciar los experimentos. Los estudios de acondicionamiento del miedo suelen utilizar niveles de presión acústica de 70-80 dB y 0,1-1 mA intensidad de choque18; por lo tanto, los parámetros descritos están dentro de los límites de los paradigmas tradicionales de acondicionamiento del miedo. En un experimento de cont...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Junta de Regentes de Luisiana a través del fondo de apoyo de la Junta de Regentes (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) y el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R01MH122561. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
de contexto30 X 30 cm 
Caja de condicionamiento del miedoMed Associates, Inc.VFC-00825 X 30 X 35 cm
dimensiones Generador de audio Med Associates, Inc.ANL-926 y nbsp;
ShockerMed Associates Inc.ENV-414SAltavoz de rejilla de acero inoxidable
Med Associates, Inc.ENV-224AMAdecuado para tonos puros y ruido blanco 
Ratones C57/BL6JLaboratorio Jackson, EE. UU.664De 3 a 5 meses
de edad Software Cineplex (Editor/estudio)PlexonCinePlex Studio v3.8.0Para seguimiento de vídeo y análisis de puntuación conductual
Software MedPC VMed Associates, Inc.SOF-736
NeuroexplorerPlexonSe utiliza para extraer los datos de congelación puntuados en PlexonEditor
GraphPad Prism 8GraphPad Software, Inc.Versión 8Software de análisis estadístico
Cilindro de plexiglás neutro

Referencias

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