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Artículo de método

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

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DOI:

10.3791/61538

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6 de agosto de 2020

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1Centre for Medical Parasitology, Department of Immunology and Microbiology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens, Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, University of Ghana, 3Department of Immunology, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, 4Centre for Medical Parasitology, Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet

En este artículo

Resumen

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Resumen

El protocolo describe cómo configurar y ejecutar un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo de Plasmodium falciparum-infezocitos infectados (IEs) opsonizados por anticuerpos IgG adquiridos naturalmente específicos para VAR2CSA. Var2CSA es el antígeno parásito que media el secuestro selectivo de IEs en la placenta que puede causar una forma grave de malaria en mujeres embarazadas, llamada malaria placentaria (PM). La protección contra la PM está mediada por anticuerpos específicos de VAR2CSA que se cree que funcionan mediante la inhibición del secuestro de placenta y/o por opsonización de IEs para la fagocitosis. El ensayo emplea IEs sincronizadas en etapas tardías que han sido seleccionadas in vitro para expresar VAR2CSA, anticuerpos plasmáticos/suero de mujeres con inmunidad específica de PM adquirida naturalmente, y la línea de células fagocíticas THP-1. Sin embargo, el protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la funcionalidad de los anticuerpos contra cualquier antígeno parásito presente en la superficie de IE, ya sea inducido por la exposición natural o por la vacunación. El ensayo ofrece una evaluación sencilla y de alto rendimiento, con buena reproducibilidad, de un aspecto funcional importante de la inmunidad mediada por anticuerpos en el paludismo. Por lo tanto, es útil cuando se evalúa la inmunidad clínica al paludismo por P. falciparum, una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los trópicos, particularmente en el Africa subsahariana.

Introducción

La malaria es una enfermedad transmitida por vectores causada en humanos tras la infección con cinco especies diferentes del género Plasmodium. La especie más frecuente es P. falciparum,que también es responsable de la mayor morbilidad y mortalidad1. La presentación clínica del paludismo varía de infecciones asintomáticas o benignas a enfermedades complicadas/graves, esta última ocurre principalmente en niños menores de cinco años. La exposición a P. falciparum no induce inmunidad estéril, pero las personas que viven en zonas endémicas desarrollan lentamente inmunidad contra la enfermedad clínica. La protección depende de la edad/exposición y la inmunidad se adquiere normalmente durante los primeros 5-10 años de vida2. Las mujeres adultas son una excepción importante, ya que el paludismo grave puede ocurrir durante el embarazo en una presentación clínica conocida como malaria placentaria (PM). La PM es una causa importante de aborto, mortinato, parto prematuro, bajo peso al nacer, muerte fetal y anemia materna. La resistencia a la PM se desarrolla durante embarazos sucesivos3. La protección contra la PM se asocia con la adquisición de anticuerpos contra el sulfato de tipo VAR2CSA PfEMP14,5, un antígeno de superficie de eritrocitos infectados (IE) que se une al sulfato de condroitina A (CSA) que permite el secuestro de IE en la placenta. Los anticuerpos median la protección que realiza diversas actividades funcionales (revisadas en6,7) incluida la opsonización de las IE para inducir la fagocitosis. Los primeros estudios in vitro mostraron que los anticuerpos pueden limitar el crecimiento de P. falciparum en presencia de monocitos a través de la fagocitosis8,9. Estudios más recientes han demostrado que los niveles más altos de anticuerpos que inducen la fagocitosis se asocian con mejores resultados del embarazo (en el contexto de la coinfusión del VIH)10,11, lo que indica la relevancia de esta función efectora en la respuesta inmunitaria adquirida naturalmente.

Aquí presentamos un protocolo para medir esta función de los anticuerpos presentes en el plasma/suero humano, utilizando IE cultivado in vitro expresando VAR2CSA junto con la línea de monocitos THP-1. El ensayo se ha utilizado previamente11,12,13,14,15,16,17,18 y se considera un enfoque mejorado y más fácil en comparación con los protocolos basados en microscopio anterior8, ya que permite la prueba de un mayor número de muestras de anticuerpos en una sola ejecución utilizando volúmenes más pequeños de anticuerpos y evitando el recuento de microscopía tediosa y sesgada. A pesar de que el ensayo ha sido utilizado por múltiples laboratorios y su ejecución es lo suficientemente simple, requiere una planificación y preparación cuidadosas, por lo tanto, un protocolo detallado permitiría su aplicación por laboratorios e investigadores carentes de experiencia previa. Utilizamos, como ejemplo, las IE sincronizadas en etapas tardías que expresan VAR2CSA opsonizadas con anticuerpos presentes en suero recogidos de mujeres con inmunidad específica de PM adquirida naturalmente. Sin embargo, el protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la funcionalidad de los anticuerpos contra cualquier antígeno parásito presente en la superficie de IE, ya sea inducido por la exposición natural o por la vacunación.

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Protocolo

Las muestras de suero humano utilizadas para los resultados presentados aquí se recogieron en un estudio separado19. La colección fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Memorial de Investigación Médica noguchi, Universidad de Ghana (estudio 038/10-11), y por los Comités Regionales de Etica de Investigación, Región Capital de Dinamarca (protocolo H-4-2013-083).

1. Cultivo de parásitos

NOTA: Siga las regulaciones locales para el manejo de patógenos humanos.

  1. Mantener los parásitos P. falciparum de acuerdo con el protocolo estándar descrito antesde 20 en el medio de cultivo de parásitos (ver Tabla de Materiales).
  2. Mantenga los parásitos estrechamente sincronizados utilizando el tratamiento con sorbitol como se describió anteriormente21.
  3. Para asegurar la expresión de VAR2CSA en la superficie del IE, realice rondas repetidas de selección inmunomagnética utilizando un anticuerpo anti-VAR2CSA (por ejemplo, anticuerpo PAM1.4, un IgG22)monoclonal humano reactivo cruzado de 222 ) acoplado a las cuentas G-magnéticas de proteína23.
    1. En resumen, incubar trofozoíto-IEs en etapa tardía con cuentas magnéticas acopladas a un anticuerpo anti-VAR2CSA y seleccionar positivamente usando un imán.
    2. Expanda los parásitos seleccionados en cultivo durante unos pocos ciclos hasta que la parasitemia sea al menos del 5%.
    3. Alternativamente, seleccione parásitos que se unan a CSA inmovilizado en plástico (el receptor de VAR2CSA) como se describió anteriormente24.
  4. Para verificar la expresión VAR2CSA en los parásitos seleccionados, realice la citometría de flujo como se describió anteriormente25.
    1. En resumen, etiquete el trofozoíto-IE en etapa avanzada con el mismo anticuerpo utilizado para la selección magnética (paso 1.3) seguido de un anticuerpo secundario con etiqueta fluorescente.
    2. Mida la reactividad superficial IE por citometría de flujo. La selección exitosa de anticuerpos normalmente da como resultado una población de parásitos que expresa VAR2CSA en la mayoría de los parásitos (≈80%).
  5. Para el ensayo de fagocitosis, utilice trofozoíto-EE purificado de mediados a finales de etapa. Realizar la purificación utilizando la separación magnética como se describió anteriormente26.
    NOTA: Para determinar con precisión la etapa de los parásitos, realice la tinción de Giemsa en frotis de sangre seguido de la observación de la microscopía ligera. Siga los procedimientos estándar y las pautas morfológicas descritas anteriormente27. La purificación en etapa tardía también se puede realizar utilizando un medio de gradiente de densidad. El rendimiento de IE, sin embargo, en nuestra experiencia es menor y, por lo tanto, la purificación magnética es preferible.
    1. Para la separación magnética, gire el cultivo del parásito (5-10% parasitemia) a 500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml del medio de cultivo del parásito.
    2. Agregue la suspensión del parásito en una columna CS acoplada a un imán (consulte Tabla de materiales)y déjela pasar lentamente a través de la columna. Los trofozoítos-EE son paramagnéticos (debido a la presencia de hemozoína) y permanecerán en la malla de la columna.
    3. Lavar la columna con 50 ml de medio de cultivo de parásitos y eluir las IEs de la columna magnética utilizando 50 ml de medio de cultivo de parásitos.
  6. Girar el eluido de 1.5.3 a 500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en 1 ml del medio de cultivo de parásitos.
  7. Usando un hemocitometro, cuente el número de IE (fácilmente identificados por microscopía de luz como eritrocitos con pigmento de hemozoína oscura) y el número de célula total para calcular la parasitemia final (porcentaje de IEs).
    NOTA: Utilice solamente parásitos con al menos 80% de pureza (80% IE).
  8. Sobre la base del número de muestras de suero/anticuerpos planeadas para las pruebas, estime la cantidad total de EE necesarios y amplíe los cultivos de parásitos en consecuencia. Un matraz de cultivo de 75 cm2 con 25 ml de cultivo al 5% de hematocrito y 5-10% de parasitemia debe producir suficientes IE para ejecutar una placa completa de 96 pozos. Para una placa completa (42 muestras más 6 controles por duplicado), se necesita un mínimo de 1,5 ml de suspensión del parásito a 3,3 x10 7 IEs/ml.

2. Células THP-1

NOTA: La línea celular THP-1 se utiliza en este ensayo. Esta línea celular de monocitos se deriva de un paciente con leucemia monocítica28 y se puede comprar en ATCC. Mantener la línea celular de acuerdo con las instrucciones del proveedor en el medio de cultivo THP-1 (ver Tabla de materiales).

  1. Para el mantenimiento regular, inicie el cultivo celular THP-1 a 2-4 x 105 células/ml y subcultivo cuando la concentración celular alcance 8 x 105 células/ml.
    NOTA: No permita que la concentración de la célula supere 1 x 106 células/ml y realice un seguimiento del número de pasaje. Evite el uso de células que están más allá del pasaje 25. El tiempo medio de duplicación de la línea celular THP-1 varía entre 19-50 h. Determinar el tiempo de duplicación del lote celular antes de iniciar los experimentos de fagocitosis. Esto ayudará a estimar aproximadamente la cantidad necesaria de cultivo necesaria para un número determinado de muestras de suero a analizar (por ejemplo, para una placa completa de 96 pozos, se necesitan 10 ml de cultivo a 5 x 105 células/ml).
  2. Compruebe periódicamente las células THP-1 para la expresión superficial de los receptores Fc-I (CD64), II (CD32) y III (CD16) como se describió anteriormente15.
    1. En resumen, manchar las células THP-1 (por separado) con anticuerpos anti-CD64, anti-CD32 y anti-CD16 etiquetados fluorescentemente (Tabla de Materiales) durante 30 min a temperatura ambiente (1:100 dilución preparada en 2% FBS en PBS).
    2. Lavar tres veces con 2% de FBS en PBS y medir la tinción de la superficie por citometría de flujo.
      NOTA: Las células THP-1 son negativas para CD16 y positivas para CD32 y CD64 como se habían notificado anteriormente29,,30 (Figura 1).
  3. Para el ensayo de fagocitosis, configure un matraz de cultivo celular THP-1 con 2,5 x 105 células/ml el día anterior al experimento para producir alrededor de 5 x 105 células/ml el día del ensayo.
    NOTA: Asegúrese de que 4-6 x 105 celdas/ml estén presentes el día del ensayo.

3. Ensayo de fagocitosis (Figura S1)

  1. Antes de iniciar el ensayo, bloquee (>1 h) dos placas de pozo de fondo redondo 96 (una para la opsonización y otra para la fagocitosis) utilizando 150 s por pozo de FBS estéril al 2% en PBS.
    NOTA: Etiquete la placa 1 como placa de opsonización y utilízla tanto para la tinción de bromuro de etidio (EtBr) como para la opsonización. Etiquetar la placa 2 como placa de fagocitosis y utilizar tanto para el revestimiento de células THP-1 como para el paso de la fagocitosis.
  2. Tinción y opsonización de parásitos
    1. Tome la suspensión IE preparada en 1,6 y ajuste el recuento de células a 3,3 x 107 IEs/ml añadiendo un medio de cultivo de parásitos y EtBr para lograr una concentración final de 2,5 g/ml (1:40 dilución, a partir de un stock de 0,1 mg/ml).
      NOTA: EtBr mancha el ADN del parásito, permitiendo la detección por citometría de flujo.
      ADVERTENCIA: EtBr es un mutágeno y la piel, ojo e irritante respiratorio. Utilice la protección adecuada y deseche los residuos de acuerdo con la normativa local.
    2. Retire la solución de bloqueo de una de las 96 placas de pozo (placa de opsonización), moviendo la placa y eliminando el exceso de líquido sobre un pedazo de papel de toalla.
    3. Añadir 30 l por pocócil de la suspensión IE preparada arriba en la mitad superior de la placa. Deje un bien vacío y agregue 30 l de medio de cultivo de parásitos (sin IE para el control solo THP-1). (Figura S2A). Incubar durante 10 min a temperatura ambiente y protegerse de la luz.
    4. Añadir 170 l por pozo de medio de cultivo de parásitos. Gire la placa a 500 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante moviendo la placa sobre un contenedor de residuos apropiado.
    5. Lavar las IE etiquetadas con EtBr dos veces más utilizando 200 ml por pozo de medio de cultivo de parásitos girando la placa a 500 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante del primer lavado se puede quitar moviendo la placa. Retire cuidadosamente el sobrenadante del segundo lavado con una pipeta multicanal para asegurarse de que se elimina todo el volumen del medio de lavado. No moleste el pellet.
    6. Re-suspenda las IE etiquetadas por EtBr en 30 ml de solución de anticuerpos/plasma/suero preparadas a las concentraciones deseadas en un medio de cultivo de parásitos.
    7. Incluya siempre los siguientes controles (Figura S2B): un control sin control de células IEs/THP-1 (medio de cultivo de parásitos); un control sin ningún anticuerpo o plasma/suero (control no opsonizado); un control positivo utilizando el anticuerpo anti-eritrocitos antihumano de conejo disponible comercialmente a 1:100 dilución (ver Tabla de Materiales); dos controles negativos de plasma/suero a 1:5 dilución (una piscina ingenua por el paludismo y una piscina de varones expuestos al paludismo); y un control sérico positivo a 1:5 dilución (un grupo de mujeres expuestas al paludismo, que han estado embarazadas previamente (preferiblemente multigravidas)).
      NOTA: Una dilución de 1:100 para el control positivo parece funcionar consistentemente en diferentes lotes de anticuerpos comprados (datos no mostrados). Sin embargo, se recomienda descartar variaciones entre lotes probando varias diluciones cada vez que se utiliza un nuevo lote de anticuerpos.
    8. Incubar durante 45 min en la oscuridad a 37oC.
  3. Preparación de células THP-1 y fagocitosis
    1. Mientras que las IE están siendo opsonizadas (3.2.8), comiencen a preparar las células THP-1.
    2. Retire las células THP-1 del matraz de cultivo, centréelas hacia abajo (500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente), decante el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo celular THP-1.
    3. Girar de nuevo (500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente), decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 1 ml del medio de cultivo celular THP-1.
    4. Determinar el recuento de células en la solución preparada anteriormente y añadir más medio para obtener una concentración final de 5 x 105 células/ml.
    5. Retire la solución de bloqueo de la placa de 96 pozos restante (placa de fagocitosis) moviendo la placa y eliminando el exceso de líquido sobre un pedazo de papel de toalla.
    6. Añadir 100 l por poc y de la suspensión de células THP-1 preparada en 3.3.4 y volver a colocarla en la incubadora de cultivo celular (Figura S2C).
    7. Una vez finalizado el tiempo de incubación de anticuerpos/plasma/suero, añada 170 l por pozo de medio de cultivo de parásitos. Gire la placa a 500 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante moviendo la placa sobre un contenedor de residuos apropiado.
    8. Lavar las IE opsonizadas dos veces más usando 200 l por pozo de medio de cultivo de parásitos, girando la placa a 500 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante del primer lavado se puede quitar moviendo la placa. Retire cuidadosamente el sobrenadante del segundo lavado, utilizando una pipeta multicanal para asegurarse de que se elimina todo el volumen del medio de lavado. No moleste el pellet.
    9. Finalmente re-suspenda las IE opsonizadas en 100 l de medio de cultivo celular THP-1 precalejado. Transfiera 50 l de suspensión opsonizada de IE a cada pocómo en la placa de fagocitosis. Dado que hay un total de 100 l de IE, cada dilución de anticuerpos/suero se puede ejecutar en duplicados en la placa de fagocitosis (Figura S2D)
      NOTA: La cantidad de celdas IE y THP-1 utilizadas en el ensayo corresponde a una proporción de 10:1.
    10. Incubar durante 40 min en la oscuridad a 37oC, 5% CO2.
      NOTA: No permita que la fagocitosis continúe durante más de 40 min.
    11. Detener la fagocitosis mediante centrifugación a 4 oC (500 x g,5 min) y desechar el sobrenadante moviendo la placa. Añadir 150 l de solución de suaveción de cloruro de amonio a temperatura ambiente(Tabla de materiales)y mezclar por pipeteo, incubar durante exactamente 3 min.
      NOTA: Este paso anerá a los eritrocitos que no han sido fagocitosos por las células THP-1.
    12. Detenga la lelisis añadiendo 100 l de fbS frío en frío 2% en PBS. Gire la placa a 4 oC (500 x g durante 3 minutos) y retire el sobrenadante moviendo la placa sobre un contenedor de residuos apropiado.
    13. Lavar tres veces con 200 l por pocócil de FBS frío en frío 2% en PBS girando la placa a 4oC (500 x g durante 3 min). Después del lavado final, vuelva a suspender en 200 ml de FBS frío en frío 2% en PBS y analice inmediatamente por citometría de flujo.
      NOTA: Publicaciones anteriores han utilizado la fijación celular en un 2% de paraformaldehído antes de la citometría de flujo31,pero los resultados presentados aquí se adquirieron inmediatamente después de la finalización del ensayo. No se recomienda posponer la adquisición de datos de citometría de flujo almacenando la placa a 4oC, ya que el porcentaje de células EtBr+ THP-1 se descompone rápidamente (Figura S3).
  4. Adquisición y análisis de citometría de flujo
    NOTA: Se puede utilizar cualquier citometro de flujo que admita el formato de placa de 96 pozos y tenga los láseres/filtros adecuados para medir la fluorescencia EtBr.
    1. Para la adquisición, la puerta en las células THP-1 utilizando una gráfica lineal de dispersión directa (FSC) frente a la dispersión lateral lineal (SSC) utilizando los pozos no se añadieron IE(Figura 2A) y adquirieron 10.000 eventos en esta puerta.
    2. Mida la intensidad de fluorescencia para EtBr (FL3-Log) en la puerta THP-1 utilizando una gráfica de histograma.
    3. Para el gating, la primera puerta en las células THP-1 en una gráfica de densidad FSC contra SSC, utilizando los pozos no se añadieron IE(Figura 2A). A continuación, configure una puerta positiva en un histograma FL3 (EtBr), utilizando las celdas THP-1 (sin IEs agregadas) y el control no opsonizado (Figura 2B).
    4. Copie estas puertas en todas las otras muestras analizadas en la misma placa y determine el porcentaje de células EtBr-positivas THP-1 (células THP-1 que han fagocitotizado al menos un IE). Para cada una de las muestras analizadas, la fagocitosis puede notificarse como los valores absolutos (porcentaje de células EtBr+ THP-1) o como fagocitosis relativa calculada como porcentaje utilizando el control positivo como máximo.

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Resultados

Aquí presentamos en detalle un protocolo que previamente ha sido descrito31 y utilizado11,12,13,14,15,16,17,18 para medir la capacidad de los anticuerpos dirigidos a la superficie de P. falciparum IE para inducir opsonizació...

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Discusión

El protocolo presentado aquí ha sido descrito previamente y utilizado12,15,17,31 para medir la capacidad de los anticuerpos dirigidos a la superficie de P. falciparum IEs para inducir opsonización y fagocitosis por las células THP-1. Los resultados presentados aquí se centran en anticuerpos específicos de VAR2CSA adquiridos naturalmente en el plasma/suero de mujeres que viven en una re...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Maiken Visti es agradecido por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por una subvención (MAVARECA II; 17-02-KU) del Ministerio de Relaciones Exteriores de Dinamarca y administrado por el Centro de Becas Danida. El financiador no tenía ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo celular de 96 pocillos, fondo redondo con tapaCorning3799Se puede usar cualquier placa similar, asegúrese de que sea compatible con el instrumento de citómetro de flujo que pretende usar
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0,2 g/L de hipoxantina (Sigma, H9377) en RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Glóbulos rojos anticuerpoAbcamab34858Prepare 2μ l alícuotas y congele a -20°C. Use una alícuota por experimento.
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
Solución de bromuro de etidioSigmaE1510Prepare una solución madre a 0,1 mg/ml en RPMI1640 (R5886). Almacene protegido de la luz
Citómetro de flujo FC500Beckman CoulterSe puede utilizar cualquier citómetro de flujo que admita un formato de placa de 96 pocillos y que tenga los láseres/filtros adecuados para medir la fluorescencia de EtBr.
Suero fetal bovino (FBS)Gibco10099-141Inactivar el calor antes de usar.
FITC ratón anti-humano CD16BD Biosciences555406 o 556618
FITC ratón anti-humano CD32BD Biosciences552883
FITC ratón anti-humano CD64BD Biosciencessoftware 555527
FlowLogic tecnologíasInivaiSe puede utilizar cualquier análisis de citometría de flujo, por ejemplo, FlowJo o Winlist
Gentamicin (10 mg/mL)SigmaG1272
HipoxantinaSigmaH9377
L-glutamina (200mM)SigmaG7513
Solución de lisis--15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-Columna y accesoriosMiltenyi Biotec130-041-305
Medio de cultivo de parásitos--2mM L-glutamina (Sigma, G7513), 50µ g/mL de gentamicina (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) en RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicilina/Estreptomicina (10000U y 10mg/mL)SigmaP0781
RPMI-1640 medioSigmaR5886
THP-1 medio de cultivo--10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamina (Sigma, G7513), 100U/mL de penicilina, 0.1mg/mL de estreptomicina (Sigma, P0781) en RPMI1640 (Sigma, R5886)
Imán Vario MACSMiltenyi Biotec

Referencias

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