El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).
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Artículo de método
Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo
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Resumen
Resumen
El protocolo describe cómo configurar y ejecutar un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo de Plasmodium falciparum-infezocitos infectados (IEs) opsonizados por anticuerpos IgG adquiridos naturalmente específicos para VAR2CSA. Var2CSA es el antígeno parásito que media el secuestro selectivo de IEs en la placenta que puede causar una forma grave de malaria en mujeres embarazadas, llamada malaria placentaria (PM). La protección contra la PM está mediada por anticuerpos específicos de VAR2CSA que se cree que funcionan mediante la inhibición del secuestro de placenta y/o por opsonización de IEs para la fagocitosis. El ensayo emplea IEs sincronizadas en etapas tardías que han sido seleccionadas in vitro para expresar VAR2CSA, anticuerpos plasmáticos/suero de mujeres con inmunidad específica de PM adquirida naturalmente, y la línea de células fagocíticas THP-1. Sin embargo, el protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la funcionalidad de los anticuerpos contra cualquier antígeno parásito presente en la superficie de IE, ya sea inducido por la exposición natural o por la vacunación. El ensayo ofrece una evaluación sencilla y de alto rendimiento, con buena reproducibilidad, de un aspecto funcional importante de la inmunidad mediada por anticuerpos en el paludismo. Por lo tanto, es útil cuando se evalúa la inmunidad clínica al paludismo por P. falciparum, una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los trópicos, particularmente en el Africa subsahariana.
Introducción
La malaria es una enfermedad transmitida por vectores causada en humanos tras la infección con cinco especies diferentes del género Plasmodium. La especie más frecuente es P. falciparum,que también es responsable de la mayor morbilidad y mortalidad1. La presentación clínica del paludismo varía de infecciones asintomáticas o benignas a enfermedades complicadas/graves, esta última ocurre principalmente en niños menores de cinco años. La exposición a P. falciparum no induce inmunidad estéril, pero las personas que viven en zonas endémicas desarrollan lentamente inmunidad contra la enfermedad clínica. La protección depend....
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Protocolo
Las muestras de suero humano utilizadas para los resultados presentados aquí se recogieron en un estudio separado19. La colección fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Memorial de Investigación Médica noguchi, Universidad de Ghana (estudio 038/10-11), y por los Comités Regionales de Etica de Investigación, Región Capital de Dinamarca (protocolo H-4-2013-083).
1. Cultivo de parásitos
NOTA: Siga las regulaciones locales para el manejo de patógenos humanos.
- Mantener los parásitos P. falciparum de acuerdo con el protocolo estándar descrito antes
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Resultados
Aquí presentamos en detalle un protocolo que previamente ha sido descrito31 y utilizado11,12,13,14,15,16,17,18 para medir la capacidad de los anticuerpos dirigidos a la superficie de P. falciparum IE para inducir opsonizació.......
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Discusión
El protocolo presentado aquí ha sido descrito previamente y utilizado12,15,17,31 para medir la capacidad de los anticuerpos dirigidos a la superficie de P. falciparum IEs para inducir opsonización y fagocitosis por las células THP-1. Los resultados presentados aquí se centran en anticuerpos específicos de VAR2CSA adquiridos naturalmente en el plasma/suero de mujeres que viven en una re.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Maiken Visti es agradecido por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por una subvención (MAVARECA II; 17-02-KU) del Ministerio de Relaciones Exteriores de Dinamarca y administrado por el Centro de Becas Danida. El financiador no tenía ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de cultivo celular de 96 pocillos, fondo redondo con tapa | Corning | 3799 | Se puede usar cualquier placa similar, asegúrese de que sea compatible con el instrumento de citómetro de flujo que pretende usar |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0,2 g/L de hipoxantina (Sigma, H9377) en RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Glóbulos rojos anticuerpo | Abcam | ab34858 | Prepare 2μ l alícuotas y congele a -20°C. Use una alícuota por experimento. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Solución de bromuro de etidio | Sigma | E1510 | Prepare una solución madre a 0,1 mg/ml en RPMI1640 (R5886). Almacene protegido de la luz |
| Citómetro de flujo FC500 | Beckman Coulter | Se puede utilizar cualquier citómetro de flujo que admita un formato de placa de 96 pocillos y que tenga los láseres/filtros adecuados para medir la fluorescencia de EtBr. | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10099-141 | Inactivar el calor antes de usar. |
| FITC ratón anti-humano CD16 | BD Biosciences | 555406 o 556618 | |
| FITC ratón anti-humano CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC ratón anti-humano CD64 | BD Biosciences | software 555527 | |
| FlowLogic tecnologías | Inivai | Se puede utilizar cualquier análisis de citometría de flujo, por ejemplo, FlowJo o Winlist | |
| Gentamicin (10 mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hipoxantina | Sigma | H9377 | |
| L-glutamina (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Solución de lisis | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-Columna y accesorios | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Medio de cultivo de parásitos | - | - | 2mM L-glutamina (Sigma, G7513), 50µ g/mL de gentamicina (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) en RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicilina/Estreptomicina (10000U y 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medio | Sigma | R5886 | |
| THP-1 medio de cultivo | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamina (Sigma, G7513), 100U/mL de penicilina, 0.1mg/mL de estreptomicina (Sigma, P0781) en RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Imán Vario MACS | Miltenyi Biotec |
Referencias
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5....
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Reimpresiones y permisos
