La heterogeneidad intramoral es una característica inherente de los tumores, incluidos los gliomas. Desarrollamos un protocolo simple y eficiente que utiliza una combinación de tampones y centrifugación por gradiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados para estudios de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC.
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Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq
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Resumen
Resumen
Los gliomas difusos adultos exhiben heterogeneidad inter e intratitumoral. Hasta hace poco, la mayoría de los esfuerzos de perfiles moleculares a gran escala se han centrado en enfoques masivos que condujeron a la clasificación molecular de los tumores cerebrales. En los últimos cinco años, los enfoques de secuenciación de células individuales han destacado varias características importantes de los gliomas. La mayoría de estos estudios han utilizado muestras de tumores cerebrales frescos para aislar células individuales utilizando citometría de flujo o métodos de separación basados en anticuerpos. En el futuro, el uso de muestras de tejido fresco congelado de biobancos proporcionará una mayor flexibilidad a las aplicaciones de una sola célula. Además, a medida que avance el campo unicelular, el próximo desafío será generar datos multiómicos a partir de una sola célula o de la misma preparación de muestras para desentrañar mejor la complejidad del tumor. Por lo tanto, los protocolos simples y flexibles que permiten la generación de datos para diversos métodos, como la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a la transposasa con secuenciación de alto rendimiento (snATAC-seq) serán importantes para el campo.
Los avances recientes en el campo de una sola célula, junto con instrumentos microfluídicos accesibles, como la plataforma genómica 10x, han facilitado las aplicaciones de células individuales en laboratorios de investigación. Para estudiar la heterogeneidad de los tumores cerebrales, desarrollamos un protocolo mejorado para el aislamiento de núcleos individuales de gliomas frescos congelados. Este protocolo combina los protocolos existentes de una sola célula y combina un paso de homogeneización seguido de filtración y centrifugación de gradiente mediado por tampón. Las muestras resultantes son suspensiones puras de núcleos individuales que se pueden utilizar para generar datos de expresión génica de un solo núcleo y accesibilidad a la cromatina a partir de la misma preparación de núcleos.
Introducción
Los gliomas difusos de grado inferior (LGG), el tumor cerebral primario más común en adultos, son neoplasias infiltrativas que a menudo surgen en el hemisferio cerebral. Los LGG exhiben heterogeneidad inter e intratitumoral, que no solo es impulsada por la población tumoral sino también por las células no malignas intrincadamente involucradas en el desarrollo y la progresión del tumor1,2,3,4,5.
Durante la última década, ha habido una avalancha de datos genómicos recopilados en el campo de los gliomas. Estos datos provienen principalmente de estudios de secuenciación tumoral a granel y han contribuido enormemente a la caracterización molecular, y a la clasificación actual de los tumores cerebrales5,6,7,8,9,10,11. Sin embargo, a pesar de que estos estudios revelaron el amplio panorama molecular asociado con los gliomas, todavía hay una decepcionante falta de progreso con respecto a la intervención terapéutica. Uno de los obstáculos para la resistencia al tratamiento en los tumores cerebrales es la heterogeneidad intratitumoral. Para abordar este problema, diversos estudios se han centrado en la heterogeneidad genómica, transcriptómica, proteómica y epigenética presente dentro de un tumor a nivel de una sola célula12,13,14,15,16,17.
Aunque ha habido avances tecnológicos notables en el campo de una sola célula en los últimos años, uno de los principales factores limitantes es la disponibilidad de especímenes frescos necesarios para aislar las células y realizar estos experimentos. Para superar esta limitación, ha habido varios intentos exitosos de realizar ensayos, como snRNA-seq y snATAC-seq de tejidos congelados, utilizando núcleos en lugar de células18,19. La mayoría de estos métodos se basan en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o en estrategias de filtración. Tanto los enfoques de células individuales como de núcleos individuales tienen sus fortalezas e inconvenientes. Los enfoques de una sola célula mantienen las transcripciones mitocondriales, que aunque pueden ser informativas, también pueden reducir la cobertura del transcriptoma debido a su alta abundancia. Los enfoques de aislamiento de núcleos individuales eliminan un alto porcentaje de la fracción mitocondrial, lo que permite una cobertura más profunda de las transcripciones nucleares20.
Hay varias plataformas disponibles comercialmente que se han utilizado en los últimos años para analizar datos genómicos de células individuales, incluidos RNA-seq y ATAC-seq. Una de las plataformas más destacadas es la plataforma 10x Genomics Chromium para la expresión génica de una sola célula y el perfil ATAC de una sola célula. Como la plataforma funciona con la ayuda de cámaras microfluídicas, cualquier residuo o agregado puede obstruir el sistema, lo que lleva a la pérdida de datos, reactivos y muestras clínicas valiosas. Por lo tanto, el éxito de los estudios de células individuales depende en gran medida del aislamiento preciso de células / núcleos individuales.
El protocolo que demostraremos aquí es una combinación ligeramente modificada de los protocolos DroNc-seq y Omni-ATAC-seq, y utiliza un enfoque similar a estudios recientes que utilizan snRNA-seq para comprender los trastornos neurológicos y los tipos de células neuronales en el cerebro humano18,19,21,22,23,24. El protocolo utiliza una combinación de disociación enzimática/mecánica de muestras congeladas seguida de filtración y centrifugación por gradiente y permite un aislamiento rápido y preciso de núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados. Hemos utilizado con éxito este protocolo para generar datos de snRNA-seq y snATAC-seq a partir de la misma preparación de núcleos a partir de muestras de tumores cerebrales.
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Protocolo
Se obtuvieron muestras frescas de glioma congeladas del banco de tejidos del Centro Nacional de Enfermedades Tumorales (NCT) en Heidelberg, Alemania. El uso de material para pacientes fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Heidelberg, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes incluidos en el estudio.
1. Preparación experimental
- Realice todos los pasos sobre hielo o a 4 °C.
- Tubos pre-fríos, platos, cuchillas de afeitar, Douncers y morteros a 4 °C.
- Prepare todos los búferes con anticipación. Estos tampones son estables a temperatura ambiente. Se recomienda la filtración estéril, especialmente para la sacarosa. Las preparaciones de stock se modifican a partir de Corces et al.19. Véanse los cuadros 1 a 7.
- Retire las muestras del almacenamiento en el congelador de nitrógeno líquido o -80 °C y manténgalo en hielo seco hasta el Paso 2.1.
2. Disección y disociación tisular
- Transfiera una muestra de tejido fresco congelado (10-60 mg) a una placa de Petri preenfriada. Picar / picar tejido fresco congelado con una cuchilla de afeitar a trozos pequeños en hielo.
- Añadir 500 μL de tampón de lisis de núcleos refrigerados a un tubo de 1,5 ml pre-refrigerado. Coloque las piezas de tejido en el tubo de 1,5 ml que contiene el tampón de lisis de núcleos y transfiéralos a un Douncer(Tabla de Materiales).
NOTA: Hay dos morteros homogeneizadores Dounce: mortero "suelto" o "A" para la reducción inicial de la muestra y mortero "apretado" o "B" para la homogeneización completa de la muestra. - Dobla las piezas de tejido con el mortero "suelto" durante unos 20 golpes, hasta que se reduzca la fricción. Si hay escombros, la muestra puede ser pre-limpiada por filtración con un colador de 100 mm.
- Donce con el mortero "apretado" durante 20 golpes para lograr la homogeneización completa del tejido.
- Transfiera el homogeneizado (aproximadamente 500 μL) a un tubo pre-enfriado de 2 ml. Añadir 1 ml de tampón de lisis refrigerado. Mezclar suavemente e incubar sobre hielo durante 5 min. Mezcle suavemente con una punta de pipeta de orificio ancho y repita 1-2 veces durante la incubación.
- Filtre todo el homogeneizado utilizando una malla de colador de 30 μm, recójalo en un tubo Falcon de 15 ml y transfiéralo de nuevo a un nuevo tubo preenfriado de 2 ml. Un solo colador suele ser suficiente para todo el homogeneizado.
- Verifique bajo un microscopio de luz para verificar la eliminación de escombros grandes y la integridad de la membrana nuclear. Los núcleos deben ser redondos y la membrana nuclear no debe distorsionarse. Si hay escombros, los núcleos se pueden volver a filtrar.
- Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga de sobremesa. Retire el sobrenadante, dejando atrás ~ 50 μL con un gránulo que contenga los núcleos. Resuspenda suavemente el pellet en otro 1 ml de tampón de lisis de núcleos e incube durante 5 minutos en hielo.
- Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4°C. Retire el sobrenadante sin molestar el pellet, agregue 500 ml de tampón de homogeneización (HB) 1x(Tabla 4)e incube durante 5 min sin resusptar. Luego, resuspenda los núcleos en otros 1.0 mL de 1x HB.
- Centrifugar los núcleos a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y resuspante suavemente los núcleos en 200 μL de 1x HB en un nuevo tubo de 2.0 mL.
3. Centrifugación por gradiente
- Añadir 200 μL de solución de iodixanol al 50% (Tabla 5) para dar una concentración final de iodixanol al 25%. Mezclar bien 10 veces con juego de pipetas a 300 ml.
- Añadir 300 μL de solución de iodixanol al 29% (Tabla 6) bajo la mezcla al 25%. Use una punta fina P1000 para evitar la mezcla de las capas.
- Añadir 300 μl de solución de iodixanol al 35% (Tabla 7) debajo de la mezcla al 29%. Use una punta fina P1000 para evitar la mezcla de las capas.
Precaución: Este paso requiere la extracción gradual de la punta de la pipeta durante el pipeteo para evitar el desplazamiento excesivo del volumen. - Coloque las muestras en una centrífuga de cucharón oscilante, gire durante 20 min a 3.500 x g a 4 ° C con el freno apagado.
- Retire suavemente las muestras sin agitar y observe bajo la luz. Una banda blanca clara de 95% de núcleos puros debe ser visible entre la segunda y tercera capa(Figura 1).
4. Aislamiento de núcleos
- Aspirar las capas superiores hasta la banda de núcleos blancos en la interfase de 29%-35%.
- Recoger la banda de núcleos en un volumen de 200 ml, transferir a un tubo fresco y filtrar con un filtro de 20 μm (Tabla de materiales).
NOTA: Los núcleos no necesitan ser resuspendidos antes de la filtración. - Verifique bajo un microscopio de luz para verificar la eliminación de escombros grandes y la integridad de la membrana nuclear. Los núcleos deben ser redondos y la membrana nuclear no debe distorsionarse.
- Cuente los núcleos utilizando la tinción azul de Tripano en un hemocitómetro y los núcleos alícuotas para snRNA-seq/snATAC-seq.
5. ARN de núcleos individuales y ATAC seq
- Procese inmediatamente los núcleos utilizando los kits de expresión génica unicelular y reactivo ATACunicelular (Tabla de Materiales).
NOTA: Las concentraciones de muestra de núcleos para el sistema 10x Genomics son 1500-3000 núcleos por μL para snRNA-seq, y 3500-7000 nucleis por m μL para snATAC-seq. Los núcleos se pueden diluir usando 1x PBS. - Secuenciar las bibliotecas resultantes en el Genomics Core Facility.
- Realizar análisis de control de calidad de los datos. Los núcleos se incluyen para un análisis posterior si contienen Identificador Molecular Único (UMI) >1000, número de genes >500 y porcentaje de genes mitocondriales <5%, y están dentro de la media + tres desviaciones estándar de las UMI y los genes.
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Resultados
La genómica de núcleo único es un campo en evolución con datos y protocolos limitados. Un factor crítico que influye en el resultado de los ensayos de núcleos individuales es el aislamiento de núcleos puros e intactos. Combinamos dos protocolos publicados (protocolos DroNc-seq y Omni-ATAC-seq) para aislar núcleos puros y de alta calidad de bloques de tejido de glioma frescos congelados en un tiempo relativamente corto, manteniendo así la estabilidad de las transcripciones(Figura 1).
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Discusión
El campo de la heterogeneidad intramoral se encuentra en una etapa emocionante, con nuevos ensayos y plataformas que se están desarrollando para desafiar y expandir el conocimiento existente. La heterogeneidad intramoral es un factor crucial que contribuye a la progresión de la enfermedad y a la resistencia a las modalidades de tratamiento actuales en los gliomas28. Estudios recientes sobre tumores cerebrales se han centrado en este importante aspecto mediante el uso de ensayos transcriptómicos y ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Single Cell Open Lab (scOpenLab) en el Centro Alemán del Cáncer (DKFZ) por sus útiles discusiones. Esta investigación fue apoyada por la subvención número 70111964 (S.T.) de la Ayuda Alemana contra el Cáncer, Programa Max-Eder.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma 21115-100ML | ||
| Homogeneizador de onzas | Motivo activo | 40401 | |
| EDTA (0,5 m) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos | Fisher Scientific | ||
| Iodixanol (también conocido como Optiprep) | Tecnologías de células madre | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma 63052-100ML | ||
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Kit de aislamiento de núcleos: Núcleos EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Filtros de preseparación (20 y micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Tubos de bloqueo seguro 1,5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Tubos de bloqueo seguro 2,0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Expresión génica de una sola célula | 10x Genomics | ||
| Sacarosa | Sigma | S0389 | |
| Puntas de pipeta de diámetro ancho (1000 y micro; L) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Puntas de pipeta de diámetro ancho (200 y micro; L) | Themo Fisher Científico | 2069GPK |
Referencias
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