Artículo de método

Mitigación de la fijación de células de flujo sanguíneo a implantes metálicos a través de la inmovilización de péptidos derivados de CD47

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DOI:

10.3791/61545

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3 de diciembre de 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para añadir péptido CD47 (pepCD47) a stents metálicos utilizando la química de polibisfosfonato. La funcionalización de los stents metálicos mediante pepCD47 evita la unión y activación de las células inflamatorias mejorando así su biocompatibilidad.

Resumen

Las complicaciones clave asociadas con los stents de metal desnudo y los stents eluyentes de fármacos son la restenosis en stent y la trombosis tardía del stent, respectivamente. Por lo tanto, la mejora de la biocompatibilidad de los stents metálicos sigue siendo un desafío importante. El objetivo de este protocolo es describir una técnica robusta de modificación de la superficie metálica mediante péptidos biológicamente activos para aumentar la biocompatibilidad de los implantes médicos que contactan con la sangre, incluidos los stents endovasculares. CD47 es un marcador inmunológico específico de especies de sí mismo y tiene propiedades antiinflamatorias. Los estudios han demostrado que un péptido de 22 aminoácidos correspondiente al dominio Ig de CD47 en la región extracelular (pepCD47), tiene propiedades antiinflamatorias como la proteína de longitud completa. Estudios in vivo en ratas, y estudios ex vivo en sistemas experimentales de sangre humana y conejo de nuestro laboratorio han demostrado que la inmovilización pepCD47 en metales mejora su biocompatibilidad al prevenir la unión y activación de células inflamatorias. Este artículo describe el protocolo paso a paso para la funcionalización de superficies metálicas y fijación de péptidos. Las superficies metálicas se modifican utilizando bisfosfato de poliallamina con grupos de tiol latentes (PABT) seguidos de desprotección de tioles y amplificación de sitios tiol-reactivos a través de la reacción con polietilenimina instalada con grupos de piridildithio (PEI-PDT). Por último, pepCD47, que incorpora residuos terminales de cisteína conectados a la secuencia de péptidos del núcleo a través de un espaciador dual 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl, se unen a la superficie metálica a través de enlaces de disulfuro. Esta metodología de fijación de péptidos a la superficie metálica es eficiente y relativamente económica y, por lo tanto, se puede aplicar para mejorar la biocompatibilidad de varios biomateriales metálicos.

Introducción

La intervención coronaria percutánea es la primera línea de terapia para tratar las enfermedades de las arterias coronarias (CAD) y consiste principalmente en stentar las arterias enfermas. Sin embargo, la restenosis in-stent (ISR) y la trombosis de stent son complicaciones comunes asociadas con el despliegue de stent1. La interacción sanguínea en la interfaz de la sangre-stent se caracteriza por una adsorción casi inmediata de proteínas plasmáticas en la superficie metálica, seguida de la unión plaquetaria y celular inflamatoria y la activación2. La liberación de las citoquinas inflamatorias y quimioquinas de las células inflamatorias activadas conduce a la modificación fenotípica de las células musculares lisas vasculares (VSMC) en los medios de la túnica y desencadena su migración centrípeta al compartimento intimal. La proliferación de VSMC activado en la intima da como resultado un engrosamiento de la capa intimal, estrechamiento de lúmenes y restenosis in-stent3. Se desarrollaron stents de elución de fármacos (DES) para prevenir la proliferación de VSMC; sin embargo, estos medicamentos tienen un efecto citotóxico fuera de la diana en las células endoteliales4,5. Por lo tanto, la trombosis tardía del stent es una complicación común asociada con DES6,,7. Los stents hechos de polímeros biodegradables, como el poli-L-lactide han demostrado mucha promesa en los experimentos con animales y los ensayos clínicos iniciales, pero finalmente fueron recordados cuando el uso clínico "de la vida real" demostró su inferioridad a la3a generación DES8. Por lo tanto, es necesario mejorar la biocompatibilidad de los stents de metal desnudo para obtener mejores resultados para los pacientes.

CD47 es una proteína transmembrana expresada omnipresentemente que inhibe la respuesta inmune innata cuando se une a su receptor cognado Signal Regulatory Protein alpha (SIRP)9. El receptor SIRP tiene un dominio de motivo inhibitorio de tirosina de células inmunitarias (ITIM) y los eventos de señalización en la interacción SIRP - CD47 resultan en última instancia en la regulación descendente de la activación celular inflamatoria10,11,12,13. La investigación en nuestro laboratorio ha demostrado que el CD47 recombinante o su derivado del péptido, correspondiente al dominio Ig de 22 aminoácidos de la región extracelular de CD47 (pepCD47), puede reducir la respuesta inmune del huésped a una gama de biomateriales clínicamente relevantes14,,15,,16. Recientemente, hemos demostrado que el pepCD47 puede ser inmovilizado a superficies de acero inoxidable y reducir significativamente la respuesta fisiopatológica asociada con la restenosis. Cabe destacar que las superficies modificadas pepCD47 son susceptibles a las condiciones de uso pertinentes, como el almacenamiento a largo plazo y la esterilización con óxido de etileno17. Con ese fin, pepCD47 puede ser una diana terapéutica útil para abordar las limitaciones clínicas de los stents endovasculares.

La estrategia para la fijación covalente de pepCD47 a una superficie metálica implica una serie de modificaciones químicas novedosas de la superficie metálica. Las superficies metálicas se recubren primero con bisfosfonato de poliallamina con grupos de tiol latentes (PABT) seguidos de la desprotección de los tioles y la unión de polietilenoimina (PEI) con grupos de piridilditioo instalados (PDT). Los grupos PDT de PEI no especificados en la reacción con tioles PABT desprotegidos reaccionan con pepCD47 incorporando tioles en los residuos terminales de cisteína, lo que resulta en la unión de pepCD47 a la superficie metálica a través de un enlace de disulfuro14,17,18. Utilizamos un fluoróforo conjugado pepCD47 (TAMRA-pepCD47) para determinar la concentración de entrada de péptido que resulta en la máxima inmovilización superficial del péptido. Finalmente, evaluamos la capacidad antiinflamatoria aguda y crónica de las superficies metálicas recubiertas de pepCD47, ex vivo, utilizando el aparato de bucle Chandler, y el ensayo de expansión de apego/macrofago de monocitos, respectivamente.

Este documento proporciona un protocolo sistemático para la fijación de péptidos tiolados a la superficie metálica; determinar la densidad máxima de inmovilización del péptido; y evaluar las propiedades antiinflamatorias de las superficies metálicas recubiertas de pepCD47 expuestas a sangre entera y monocitos aislados.

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Protocolo

Todas las muestras humanas para este experimento se obtuvieron de acuerdo con el IRB del Hospital de Niños de Filadelfia. Todos los experimentos con animales se realizaron previa aprobación de la IACUC del Hospital Infantil de Filadelfia.

1. Recubrimiento de superficies metálicas desnudas con PEI-PDT

  1. Lavar los cupones de papel de aluminio de acero inoxidable (1 cm x 1 cm o 0,65 cm x 1 cm) o discos de malla de acero inoxidable con 2-isopropanol en una coctelera (60 oC, velocidad de 200 rpm) durante 5 min. Realice este paso 2x. A continuación, lavar 2x con cloroformo (60 oC, velocidad de 200 rpm) durante 10 min cada uno.
  2. Colocar las muestras de acero inoxidable limpiadas en un horno a 220 oC durante 30 min.
  3. Preparar 5 ml de 0,5% de solución PABT disolviendo 25 mg de bifosfonato de poliallamina con grupos de tiol latentes (PABT) y 5 mg de bicarbonato de potasio (KHCO3) en 5 ml de DDW e incubar a 72 oC en una coctelera a 200 rpm durante 30 min.
    NOTA: Para la síntesis PABT consulte la literatura publicada anteriormente18.
  4. Sumergir las láminas horneadas o discos de malla en una solución acuosa al 0,5% de PABT e incubar en una coctelera (72oC, velocidad de 200 rpm) durante 1 h.
  5. Lave las muestras modificadas por PABT con agua destilada desionizada (DDW) durante 5x, transfiera las muestras en un vial nuevo y lave de nuevo con DDW durante 5x.
  6. Preparar un total de 5 ml de solución de TCEP (12 mg/ml) disolviendo 60 mg de clorhidrato de fosfina Tris (2-carboxyethyl) (TCEP) en 5 ml de tampón acético de 0,1 M (0,57 ml de ácido acético glacial, 820 mg de acetato de sodio en 100 ml de Tampón acético de DDW).
  7. Tratar las muestras modificadas por PABT con TCEP durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) en una coctelera.
    NOTA: TCEP se utiliza para desproteger los grupos tiol.
  8. Degas DDW en un matraz de fondo redondo mediante el uso de un dispositivo de generación de vacío, como un liofilizador y lavar las láminas tratadas TCEP o discos de malla con DDW desgasificada para 5x. Transfiera las muestras en un vial nuevo y, además, lave 5 veces con DDW desgasificación.
    NOTA: Es primordial trabajar rápido para evitar la oxidación de tioles en la superficie metálica por oxígeno atmosférico.
  9. Preparar 5 ml de solución de PEI-PDT al 1% diluyendo 212,5 l de pei-PDT y 125 l de acetato de sodio de 0,4 M en DDW desgasalado. Lleve a cabo el paso 1.9 simultáneamente con el paso 1.8 para minimizar la exposición de las muestras al aire atmosférico.
    NOTA: La síntesis de PEI-PDT se describe en la literatura publicada anteriormente18.
  10. Incubar las muestras de acero inoxidable lavadas con 1% PEI-PDT. Reemplace el aire con gas de argón, selle los viales herméticamente y mezcle en una coctelera a RT durante 1 h. Proceda inmediatamente con la conjugación del péptido o guárdelo a 4 oC hasta 1 semana.

2. Acoplamiento y evaluación cualitativa/cuantitativa de la retención de pepCD47 conjugada con fluoróforo en superficie metálica utilizando microscopía de fluorescencia y fluorimetría

  1. Lave los cupones de papel de aluminio o los discos de malla preparados como se describe en la sección 1, pasos 1.1-1.10 anteriores con DDW 5x. Transfiera las muestras a un vial nuevo y lave con DDW durante 5x adicionales. Finalmente lavar 2x con etanol desgasedado y 2x con dimetil formamida desgasificación (DMF).
  2. Preparar la solución en stock conjugada con tetrametilrhodamina (TAMRA) pepCD47 disolviendo el polvo de pepCD47 conjugado con TAMRA en dimetilformamida desgasaltada (DMF) a una concentración final de 1 mg/ml. Aliquot la solución de stock en asignaciones de 1 ml. Conservar en tubos bien sellados bajo la atmósfera de argón a -20 oC.
  3. Diluir 1 mg/ml de la solución en stock de PEPCD47 conjugado con TAMRA utilizando DMF desgasificación para preparar las siguientes concentraciones de fluoróforo conjugado pepCD47 - 10, 30, 100 y 200 g/ml.
    NOTA: Si el pepCD47 conjugado con TAMRA parece precipitarse, reduzca la solución pepCD47 conjugada con TAMRA en 20 min. Tenga en cuenta que antes de agregar el pepCD47 conjugado con TAMRA a las cuentas TCEP, gire la solución de cuentas TCEP, retire el sobrenadante y luego proceda con la adición del pepCD47 conjugado con TAMRA.
  4. Incubar los cupones de lámina modificados PEI-PDT con 10, 30, 100 o 200 g/ml de pepCD47 conjugado con TAMRA en triplicados para cada condición en una coctelera en RT bajo atmósfera de argón durante 1 hora. Incubar discos de malla modificados PEI-PDT, así como disco de malla no modificado más allá del paso 1.2 (controles de metal desnudo) con 100 g/ml de pepCD47 conjugado con TAMRA en triplicados en RT bajo atmósfera de argón en una coctelera durante 1 h.
    NOTA: A partir de este paso, los viales se envuelven en papel de aluminio para proteger el contenido de la luz.
  5. Lavar las superficies conjugadas con fluoróforo con recubrimiento pepCD47 para eliminar el péptido no covalentemente unido en el siguiente orden: DMF (3x), DMF/DDW a 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS en 20 mM Tris pH 7,4 (3x, 5 min cada uno a 70 oC en una coctelera), DDW (3x), viales de cambio y un lavado DDW final.
  6. Coloque el control y los discos de malla conjugados covalentemente en un vidrio del microscopio, agregue 50 l de PBS y coloque un cubreobjetos. Discos de malla de imagen utilizando un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un conjunto de filtros de rodamina. Tome imágenes representativas con un aumento de 100x.
  7. Preparar 15 ml de solución TCEP de 12 mg/ml disolviendo 180 mg de TCEP en 1:1 v/v mezcla de metanol y 0,1 M tampón acético.
  8. Incubar cada lámina lavada con 1 ml de solución de TCEP en una coctelera a RT durante 15 min.
  9. Preparar las siguientes normas diluyendo en serie el caldo de pepCD47 conjugado con TAMRA (1 mg/ml) – 100 g/ml, 10 g/ml, 1 g/ml, 1 g/ml, 0,1 g/ml y 0,01 g/ml. Utilice la solución TCEP como diluyente.
  10. Analizar el pepCD47 conjugado con TAMRA liberado de la superficie metálica contra la curva de calibración generada utilizando las normas por fluorimetría a 544/590 nm de excitación y longitudes de onda de emisión.

3. Fijación de la pepCD47 humana a superficies modificadas PEI-PDT

  1. Lave las muestras recubiertas con PEI-PDT formuladas como se describe en la sección 1, pasos 1.1-1.10 anteriores, con DDW 5x desgasificación, cambie el vial y lave con DDW 5x desgasificación.
  2. Preparar la solución humana de pepCD47 (1 mg/ml) disolviendo el polvo humano pepCD47 en ácido acético desgastado al 50% para lograr una concentración de 1 mg/ml.
  3. Preparar la concentración de trabajo de pepCD47 humano (100 g/ml) disolviendo 500 l de la población de pepCD47 humano en 4.500 l de solución salina tamponada 1x fosfato desgasificación (PBS).
  4. Incubar las muestras lavadas con PEI-PDT con 100 g/ml de pepCD47 en RT con agitación durante 1 h.
  5. Lave las muestras recubiertas de pepCD47 para eliminar el exceso de péptido en el siguiente orden PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min cada uno), DDW (3x), cambiar los viales y el lavado final de DDW.
    NOTA: Las superficies recubiertas de pepCD47 en humanos se pueden almacenar en seco a 4 oC durante un máximo de 6 meses.

4. Recubrimiento de las superficies modificadas PEI-PDT con secuencia revuelta (Scr)

  1. Disolver el polvo de secuencia revuelta en ácido acético desgasalado 0,1% para preparar una solución de stock de 1 mg/ml.
  2. Preparar una solución de 100 g/ml de péptido revuelto disolviendo 500 l de la en 4.500 l de ácido acético desgastado al 0,1%.
  3. Recubrir los especímenes de PEI-PDT lavados con 100 g/ml de péptido revuelto en RT con agitación durante 1 h.
  4. Para eliminar el péptido revuelto sin conectar, lave las superficies en el siguiente orden 0,01% ácido acético (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), cambio de viales y un lavado DDW.

5. Bucle Chandler para analizar la fijación celular a superficies metálicas

  1. Recubrir las láminas metálicas (0,65 cm x 1 cm) con pepCD47 humano o péptido revuelto según la descripción de la sección 1 seguida de 3 o 4.
  2. Corte tubos de PVC de 1/4" en tres trozos de 38 cm de largo.
  3. Inserte hasta 8 láminas metálicas modificadas de hasta 8 péptidos revueltos o pepCD47 en tres tubos diferentes.
  4. Recoger 30 ml de sangre de donantes humanos sanos libres de cualquier medicamento antiplaquetario según el protocolo institucional IRB. Precargue jeringa con 1 ml de citrato sódico al 4% para evitar la coagulación de la sangre recogida.
  5. Coloque 10 ml de sangre en cada tubo con una jeringa de 10 ml y conecte los extremos con adaptadores metálicos. Coloque los tubos llenos de sangre en las ruedas del aparato de bucle Chandler.
  6. Pasar la sangre a lo largo de las láminas metálicas por rotación de la rueda a 37 oC a la velocidad calculada para producir la cizalladura de 25 dyns/cm2 durante 4 h.
  7. Escurra la sangre de los tubos y deseche la sangre de acuerdo con los requisitos del IRB.
  8. Corte los tubos usando el bisturí para recuperar las láminas de cada tubo.
  9. Preparar una solución de glutaraldehído al 2% diluyendo los 10 ml de solución de glutaraldehído al 4% utilizando 10 ml de tampón de cacodilato sódico con cloruro de sodio de 0,1 M.
  10. Incubar las láminas en solución de glutaraldehído al 2% durante 15 min y conservar a 4oC durante la noche. Antes de analizar, lave las láminas metálicas 3x con PBS.

6. Análisis de la fijación celular a superficies metálicas utilizando tinte CFDA

  1. Caliente 8 ml de PBS en tubo de 15 ml en un baño de agua ajustado a 37 oC.
  2. Preparar la solución de colorante CFDA (diacetato de carboxy-fluorescein, éster de succinimidilo) de la siguiente manera - añadir 90 l de DMSO a un vial de tinte CFDA para lograr una concentración de stock de 10 mM. A continuación, preparar la concentración de trabajo de 93,75 m añadiendo 75 l de la acción CFDA a 8 ml de PBS caliente. Mezclar invirtiendo los tubos unas cuantas veces y cubrir el tubo con papel de aluminio.
    NOTA: Es aconsejable preparar recién el tinte CFDA antes de cada uso.
  3. Incubar cada lámina con 1 ml de tinte CFDA en una placa de 24 pozos. Cubra la placa con papel de aluminio e incubar la placa a 37oC durante 15 min.
  4. Lave las láminas metálicas 3x con PBS para eliminar el exceso de colorante. Imagen con el microscopio de fluorescencia invertida.

7. Fijación de monocitos y expansión de macrófagos en las superficies metálicas de metal desnudo y modificados por pepCD47

  1. Recoger 10 ml de sangre periférica a través del acceso de la vena cava durante el sacrificio de una rata macho Sprague-Dawley de 400-450 g. Mezclar inmediatamente con 1.000 UI de heparina sódica para prevenir la coagulación.
  2. Pipeta 10 mL de gradiente de densidad medio en un tubo cónico de 50 ml. Mezclar la sangre con 5 ml de PBS, y caparazón cuidadosamente la sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad utilizando una pipeta Pasteur. Centrifugar en un rotor de cucharón oscilante a 800 x g y 18-25 oC durante 20 minutos con ajustes mínimos de aceleración y desaceleración.
  3. Con una pipeta Pasteur, recoja una capa opaca de capa de buffy en la interfaz entre plasma y Ficoll. Diluir la capa buffy 1:3 con PBS y centrífuga a 550 x g y 4 oC durante 10 min a las células de la capa buffy.
  4. Re-suspenda las células de la capa buffy en 3 ml de tampón de lysis ACK para la lese contaminante eritrocitos. Incubar sobre hielo durante 4 min. Añadir 12 ml de búfer de separación de células (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
  5. Centrifugar a 550 x g y 4 oC durante 10 min. Vuelva a suspender el pellet en 10 ml de CSB.
  6. Centrifugar a 200 x g y 4 oC durante 10 min para eliminar las plaquetas. Repita dos veces.
  7. Vuelva a suspender el pellet en 500 ml de CSB. Agregue 10 g de cada uno de los siguientes anticuerpos anti-rata de ratón: CD8a (clon OX-8), anti-CD5 (clon OX-19), anti-CD45RA (clon OX-33) y anti-CD6 (clon OX-52).
  8. Incubar a 4oC en un rotador de tubo vertical durante 1 h. Añadir 9,5 ml de CSB. Centrifugar a 300 x g y 4 oC durante 10 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 ml de CSB y repita la centrifugación.
  9. Vuelva a suspender el pellet en 500 ml de CSB. Añadir 150 l de microperlas IgG anti-ratón de cabra. Incubar a 4oC en un rotador de tubo vertical durante 20 min. Añadir 9,5 ml de CSB. Centrifugar a 300 x g y 4 oC durante 10 min.
  10. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 1 ml de CSB.
  11. Coloque una columna LS en un separador magnético.  Primer primer y medio la columna LS con 3 mL de CSB. Deseche el rendimiento de la columna. Añadir 1 ml de pellet celular re-suspendido del paso 7.10. Comience a recopilar el rendimiento. Después de que el flujo se detenga, agregue 5 mL de CSB y siga recopilando el rendimiento de la columna hasta que el flujo se detenga.
  12. Centrifugar el rendimiento de la columna (6 mL) que contiene monocitos seleccionados negativamente a 300 x g y 4 oC durante 10 min. Re-suspender el pellet pequeño resultante en 2 ml de RPMI-1640 medio complementado con 10% FCS, 1% pluma / estreptococo y 100 ng / ml de factor estimulante de colonia de macrófagos de rata (M-CSF).
  13. Cuente los monocitos usando hemocicómetro. Ajuste la concentración de monocitos a 5 x 105 células/ml.
  14. Añadir 1 ml de volúmenes de suspensión monocito a los pozos individuales de una placa de 12 pozos con las muestras de papel de aluminio inoxidable desnudas (N-3) o muestras de acero inoxidable modificadas con pepCD47 de rata (N-3) según 1.1-1.10 y 3.1-3.6.
  15. Cambie el medio en los días 3 y 5 después de la siembra. El día 6 después de la siembra lavar las células con PBS y fijar con 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 15 min. Lavar dos veces con PBS durante 5 min.
  16. Retire las láminas de acero inoxidable y colóquelas individualmente en una nueva placa de 12 pozos. No voltee las láminas.
  17. Incubar en 0.5% Tween-20/PBS durante 15 min para permeabilizar las células. Lavar dos veces con PBS durante 5 min.
  18. Bloquear en 10% suero de cabra/PBS durante 20 min. Aspirar el suero. No lavar. Añadir anticuerpos CD68 anti-ratas de ratón (diluido 1:100 en 1%BSA/PBS). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar 3x en PBS durante 5 minutos cada uno.
  19. Añadir cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 546 (diluido 1:200 en 1% BSA/PBS). Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 45 min. Lavar en PBS durante 5 min. Contramancha con un tinte Hoechst 33342 de 1 g/ml en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min. Lavar 3x en PBS durante 5 minutos cada uno.
  20. Voltee las láminas y la imagen usando un microscopio fluorescente con la óptica invertida. Captura imágenes con aumento de 200x con ajustes de filtro azul y rojo.
  21. Cuente los monocitos adjuntos en las imágenes individuales y calculó los promedios de grupo y las desviaciones estándar.

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Resultados

Las superficies metálicas se vuelven tiol-reactivas para la fijación de péptidos a través de una serie de modificaciones químicas, como se ilustra en la Figura 1. La incubación PABT seguida del tratamiento PEI-PDT hace que la superficie metálica sea susceptible de fijación de péptidos. El péptido CD47 (pepCD47) que contiene residuos de cisteína en C-terminus unidos a la secuencia pepCD47 del núcleo a través de un puente AEEAc dual flexible se une covalentemente a las superficies tiol-reactiv...

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Discusión

Demostramos y describimos una estrategia química relativamente novedosa para anexar mitades de péptidos terapéuticos a una superficie de acero inoxidable con el objetivo general de reducir la reactividad de la superficie con las células inflamatorias que se encuentran en la sangre. La química del bisfosfonato descrita en el presente documento implica la formación coordinada de unión entre los óxidos metálicos y los grupos de bisfosfonato de PABT. El espesor de la monocapa de polibisfosfonato formado en la superficie metá...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El desarrollo de protocolos y los estudios presentados en este documento fueron apoyados por la financiación de NIH (NBIB) R01 (EB023921) a IF y SJS, y la financiación NIH (NHLBI) R01 (HL137762) a IF y RJL.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 M Tris-HCLInvitrogen15567-027pH - 7.5
4% GlutaraldehídoMicroscopía Electrónica Ciencias16539-07
Citrato de Sodio al 4%SigmaS5770
ACK tampón de lisadoQuality Biologicals118-156-721
anti-CD45RA Ab (ratón anti-rata; clon OX-19)Biolegend202301
anti-CD5 Ab (ratón anti-rata; clon OX-19)Biolegend203501
anti-CD6 Ab (ratón anti-rata; clon OX-52)BD Biosciences550979
anti-CD68 Ab (ratón anti-rata; clon ED-1)BioRadMCA341
Ab (ratón anti-rata; clon OX-8)Biolegend201701
Cloroformo Certificado ACSFisher ChemicalC298-500
Dimetilformammida (DMF)Alfa Aesar39117
Rejilla de acero inoxidable EmbraCiencias de la Microscopía ElectrónicaE200-SSDiscos de malla de acero inoxidable
Ficoll HypaqueGE Healthcare17-1440-02
Ácido acético glacialACROS Cabra
anti-ratón IgG Alexa FluorThermoFisherA11030
Heparina sódicaSagent Pharmaceuticals402-01
Human pepCD47Bachem4099101
IsopropanolFisher ChemicalA426P-4
Adaptadores metálicosLeur Fitting6515INDAdaptador de 1 vía 316 ss 1/4"-5/16" extremo de azada
MetanolRICCA empresa química4829-32
MicroscopioNikon EclipseTE300
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco14190-136
Bicarbonato de potasio (KHCO3)Fisher ChemicalP184-500
Tubos de PVCTerumo-CVS600501/4" X 1/16
Tampón de cacodilato de sodio de 8' con cloruro de sodio 0.1MElectron Ciencias de la Microscopía11653
Sulfato de dodecilo sódico (SDS)Laboratorios Bio-Rad161-0302
Actetato de sodio (C2H3NaO2)Alfa AesarA13184
Péptido SrcBachem4092599
Muestras cilíndricas de acero inoxidable (AISI 304) con un microgrupo de lúmenes, Medway, MA200973281 cm X 6 mm OD
Láminas de acero inoxidable (AISI 316L)Goodfellow, Coraopolis, PA100 mm X 100 mm X 0,05 mm
PepCD47 conjugado con tetrametilrodamina (TAMRA-pepCD47)Bachem4100277
Sustrato TMB (3,3' ,5,5' -tetrametilbencidina) y clorhidrato de fosfina tris (2-carboxietil) (TCEP)Laboratorios Thermo ScientificPG82089
Tween-20Bio-Rad170-6531
Vybrant CFDA SE Kit de trazador de célulasInvitrogenV12883
anti-CD8a orgánica 148930025

Referencias

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