Exploración planarian como una lectura cuantitativa del comportamiento para la detección de estímulos nocivos

Resumen

Los planarios de agua dulce exhiben tres marchas (deslizamiento, peristalsis y esquivar) que se distinguen por el análisis cuantitativo del comportamiento. Describimos un método para inducir la ejecución utilizando diversos estímulos nocivos, la cuantificación de los mismos y la distinción de la peristalsis y el deslizamiento. Usando el derribo genético, demostramos la especificidad de la escorrida como una lectura fenotípica cuantitativa.

Resumen

Los planarios de agua dulce normalmente se deslizan suavemente a través de la propulsión ciliar en su lado ventral. Ciertas condiciones ambientales, sin embargo, pueden inducir formas de locomoción impulsadas por la musculatura: peristalsis o scrunching. Mientras que la peristalsis es el resultado de un defecto ciliar, el scrunching es independiente de la función de los cilios y es una respuesta específica a ciertos estímulos, incluyendo la amputación, la temperatura nociva, el pH extremo y el etanol. Por lo tanto, estas dos marchas impulsadas por la musculatura son mecánicamente distintas. Sin embargo, pueden ser difíciles de distinguir cualitativamente. Aquí, proporcionamos un protocolo para inducir scrunching usando diversos estímulos físicos y químicos. Detallamos la caracterización cuantitativa del scrunching, que se puede utilizar para distinguirla de la peristalsis y el deslizamiento, utilizando software de libre disposición. Dado que el scrunching es una marcha planaria universal, aunque con diferencias específicas de especies características, este protocolo se puede aplicar ampliamente a todas las especies de planarios, cuando se utilizan consideraciones apropiadas. Para demostrarlo, comparamos la respuesta de las dos especies planarias más populares utilizadas en la investigación conductual, Dugesia japonica y Schmidtea mediterranea,con el mismo conjunto de estímulos físicos y químicos. Además, la especificidad de la scrunching permite que este protocolo se utilice junto con la interferencia del ARN y/o la exposición farmacológica para diseccionar las dianas moleculares y los circuitos neuronales implicados, proporcionando potencialmente una visión mecanicista de aspectos importantes de la nocisión y la comunicación neuromuscular.

Introducción

Además de su popularidad para la investigación de células madre y regeneración^1,2,3, planarios de agua dulce se han utilizado durante mucho tiempo en estudios de comportamiento^4,5, aprovechando su tamaño comparativamente grande (unos pocos milímetros de longitud), facilidad y bajo costo de mantenimiento de laboratorio, y amplio espectro de comportamientos observables. La introducción de la visión computarizada y el seguimiento automatizado de los estudios de comportamiento plano^6,,

Protocolo

1. Ensayos de comportamiento plano cuantitativo

1. Configuración experimental
   1. Coloque un panel LED regulable sobre una superficie plana. El panel LED sirve para dos propósitos: (1) proporcionar un fondo blanco uniforme y (2) para ser utilizado como una fuente de luz ajustable para obtener el contraste adecuado. Coloque una arena de 100 mm sobre la placa Petri sobre el panel LED.
      NOTA: Para aumentar el rendimiento, una placa de varios pozos se puede utilizar como una arena^23,24, pero las arenas más grandes facilitan el análisis automatizado de imágenes.
   2. Monte una cámara en un soporte....

Resultados

La percepción extraocular cercana a los rayos UV en S. mediterranea planarians depende de TRPA1 y se ha propuesto vincularse a H₂O₂ release¹⁷. Debido a que la exposición H₂O₂ induce a la aceptación dependiente de TRPA1 en S. mediterranea y D. japonica planarios²⁸, los pasos de la Sección 2.1.4 se pueden utilizar para probar si la exposición a la luz cercana a los rayos UV induce un escote en ambas especi.......

Discusión

Usando este protocolo, se pueden estudiar cuantitativamente los efectos de los estímulos físicos y químicos^7,28,29 o la manipulación genética (RNAi)^28,29 en la locomoción plana. Para maximizar la resolución espacial, lo mejor es mover la cámara lo más cerca posible de la arena mientras se asegura de que toda la arena esté en el campo de visión. Para aumentar el rendimien.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Isotiocianato de alilo, 95% (AITC)	Sigma-Aldrich	377430-5G	PRECAUCIÓN:  Inflamable y agudamente tóxico; en una campana extractora con el EPI adecuado.
Lente de la cámara, 2/3 25 mm f/1.4	Tamron	23FM25SP
Placas de cultivo celular, 6 pocillos, tratamiento con cultivo de tejidos	Genesee Scientific	25-105
Tubos de centrífuga, 50 mL de polipropileno, estériles	MedSupply Partners	62-1019-2
Cinamaldehído, >95%	Sigma-Aldrich	W228613-100G-K
Caja de luz trazadora LED A4 regulable	Cámara
Flea3 USB3	FLIR	FL3-U3-13E4M
Guantes resistentes al calor	Fisher Scientific	11-394-298
Plato caliente	Fisher Scientific	HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, preparado en agua desionizada	Instant Ocean	SS15-10	Preparado en agua desionizada a 0,5 g/L.
Montjü Preparar			en agua mili-Q a 1,6 mM NaCl, 1,0 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM KCl, 1,2 mM NaHCO3; ajustar el pH a 7,0 con HCl.
Placas de Petri, 100 mm x 20 mm, poliestireno estéril	Pipeta Simport	D210-7
, 20-200 μ Gama L	Rainin	17008652
PYREX 150 mL Vaso de precipitados	Sigma-Aldrich	CLS1000150
Hoja de afeitar, 0,22 mm	VWR	55411-050
Filtro de color Roscolux:  Ámbar dorado	Rosco	R21	Alternativamente, compre el Selector de color de diseño de Roscolux (producto Musson Theatrical #SBLUX0306) que incluye los 3 filtros de color juntos.
Filtro de color Roscolux:  Filtro	Roscolux Rosco	R27
:  Pipeta de transferencia Storaro Red	Rosco	R2001
Samco, 62 µ L gran apertura	Thermo Fisher	691TS
Soporte de soporte	Termómetro Fisher Scientific	12-947-976
VWR		89095-600
Puntero láser UV	Amazon B082DGS86R		Este es un láser de Clase II (405nm ± 10nm) con potencia de salida < 5 mW.

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