Después de la infección viral, el riñón alberga un número relativamente grande de células CD8+ T y ofrece la oportunidad de estudiar las células TRM no mucosas. Aquí, describimos un protocolo para aislar linfocitos renales de ratón para el análisis de citometría de flujo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de células CD8 + T residentes en el riñón delratón para el análisis de citometría de flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
La célula T de memoria residente en el tejido (TRM)es un campo de investigación inmunológica en rápida expansión. Aislar las células T de varios tejidos no linfoides es uno de los pasos clave para investigar TRM. Hay ligeras variaciones en los protocolos de aislamiento de linfocitos para diferentes órganos. El riñón es un órgano no linfoide esencial con numerosas infiltraciones de células inmunitarias, especialmente después de la exposición al patógeno o la activación autoinmune. En los últimos años, múltiples laboratorios incluyendo el nuestro han comenzado a caracterizar células CD8+ T residentes en riñón en varios entornos fisiológicos y patológicos tanto en ratones como en humanos. Debido a la abundancia de linfocitos T, el riñón representa un órgano modelo atractivo para estudiar TRMen tejidos no-mucosas o no barreras. Aquí, describiremos un protocolo comúnmente utilizado en laboratorios centrados en TRMpara aislar células CD8+ T de los riñones del ratón después de una infección viral sistémica. Brevemente, utilizando un modelo de infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica aguda (LCMV) en ratones C57BL/6, demostramos el etiquetado intravascular de células CD8+ T, la digestión enzimática y la centrifugación de gradiente de densidad para aislar y enriquecer linfocitos de los riñones de ratón para hacer muestras listas para el análisis posterior de citometría de flujo.
Introducción
Los células T de memoria residente en tejidos (TRM)representan una de las poblaciones de células T más abundantes en ratones humanos e infectados adultos. Las células TRM proporcionan la primera línea de defensa inmune y están implicadas críticamente en diversos procesos fisiológicos y patológicos1,2,3,4,5. En comparación con las células T circulantes, las células TRM llevan marcadores de superficie distintos con programas de transcripción únicos6
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos con animales realizados siguiendo este protocolo deben ser aprobados por el respectivo Comité institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC). Todos los procedimientos descritos aquí han sido aprobados por IACUC UT Health San Antonio.
1. Transferencia adoptiva de células T P14 a receptores C57BL/6 e infección por LCMV
- Utilice ratones P14 a las 6-12 semanas de edad. Asegúrese de que el sexo del ratón transgénico TCR P14 de donante debe coincidir con el sexo de los ratones receptores C57BL/6. De lo contrario, las células como las células T masculinas que se transfieren a ratones hembra darán lugar a un rechazo i....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El protocolo descrito aquí se resume en un diagrama de flujo(Figura 1A). En el día 30 después de la infección de LCMV, realizamos el etiquetado intravascular de células CD8+ T. 5 minutos más tarde, ambos riñones del animal fueron diseccionados, picados y sometidos a la digestión de la colagenasa. Los linfocitos se purificaron aún más a partir de las muestras digeridas a través de la centrifugación de Percoll y se analizaron mediante citometría de flujo. Como se muestra en
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Como la inmunidad específica del tejido es un área de investigación en rápida expansión, la acumulación de evidencia sugiere que las células inmunitarias, especialmente la población de linfocitos, se pueden identificar en casi todos los órganos en ratones humanos adultos o infectados o inmunizados. LcMV modelo de infección de ratón es un modelo bien establecido para estudiar la respuesta de células T específicas del antígeno, efector y la diferenciación de células T de memoria incluyendo la biología TRM a trav.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen divulgaciones financieras relevantes.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por las subvenciones de LOS NIH AI125701 y AI139721, el programa CLIP del Instituto de Investigación del Cáncer y la Sociedad Americana del Cáncer otorgan RSG-18-222-01-LIB a N.Z. Agradecemos a Karla Gorena y Sebastian Montagnino de Flow Cytometry Facility. Los datos generados en el Centro de Recursos Compartidos de Citometría de Flujo fueron apoyados por el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio (UTHSCSA), la subvención NIH/NCI P30 CA054174-20 (Centro de Investigación Clínica y Traslacional [CTRC] en UTHSCSA), y UL1 TR001120 (Premio de Ciencias Clínicas y Traslacionales).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| Tubos cónicos de 15 ml | Corning | 431470 | |
| Jeringa de 3 ml | BD | 309657 | |
| 37C incubadora | VWR | ||
| Biotina a-CD8a anticuerpo(Clon 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Suero de ternera | GE Healthcare Life Ciencias | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Pipetas de transferencia graduadas desechables | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Jeringa de insulina | BD 329424 | ||
| Micro Tijeras de resorte de disección | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naï Kit de aislamiento de células T | Biolegend | 480043 | |
| lámpara de calor de techo | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | ||
| balancín | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Ratón de latón macizo Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Centrífuga de cubo oscilante con refrigerador | Thermofisher | ||
| Tissue Culture Placa de 6 pocillos | Corning | 3516 |
Referencias
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialis....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
