Diferenciación de monocitos en macrófagos fenotípicamente distintos después del tratamiento con células madre de sangre de cordón humano (CB-SC)-Exosomas derivados

Resumen

La aplicación de exosoma es una herramienta emergente para el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Establecemos un protocolo de aislamiento exosoma con alta pureza para aislar exosomas de nuevas células madre identificadas llamadas CB-SC para estudios mecánicos. También coculuramos exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos, lo que lleva a su diferenciación en macrófagos fenotípicamente distintos.

Resumen

La terapia de educador de células madre (SCE) es un nuevo enfoque clínico para el tratamiento de la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes. La terapia SCE circula las células mononucleares de la sangre del paciente aislado (por ejemplo, linfocitos y monocitos) a través de una máquina de aféresis, co-cultiva las células mononucleares de sangre del paciente con células madre derivadas de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) en el dispositivo SCE, y luego devuelve estas células inmunitarias "educadas" a la sangre del paciente. Los exosomas son vesículas extracelulares de tamaño nanonúlgubre entre 30o u2012150 nm existentes en todos los medios de cultivo de biofluidos y células. Para explorar más a fondo los mecanismos moleculares subyacentes a la terapia SCE y determinar las acciones de los exosomas liberados de CB-SC, investigamos qué células fagocitan estos exosomas durante el tratamiento con CB-SC. Al co-cultivar exosomas derivados de CB-SC con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), descubrimos que los exosomas derivados de CB-SC eran tomados predominantemente por monocitos humanos CD14 positivos, lo que llevó a la diferenciación de los monocitos en macrófagos tipo 2 (M2), con morfología similar a un husillo y la expresión de marcadores de superficie moleculares asociados a M2. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y caracterización de exosomas derivados de CB-SC y el protocolo para la cocultura de exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos y el monitoreo de la diferenciación M2.

Introducción

Las células madre de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) son un tipo único de células madre identificadas a partir de la sangre del cordón umbilical humano y se distinguen de otros tipos conocidos de células madre como las células madre mesenquimales (MSC) y las células madre hematopoyéticas (HSC)¹. Basándonos en sus propiedades únicas de modulación inmune y su capacidad para adherirnos firmemente a la superficie de los platos petri, desarrollamos una nueva tecnología designada como terapia de educador de células madre (SCE) en ensayos clínicos^2,3. Durante el tratamiento con SCE, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente se recogen y distribuyen a través de un separador celular y se co-cultivan con CB-SC adherente in vitro. Estas células "educadas" (PBMC tratada con CB-SC) se devuelven a la circulación del paciente en un sistema de bucle cerrado. Los ensayos clínicos ya han demostrado la seguridad clínica y eficacia del tratamiento SCE para el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1 (T1D)^2,4 y la alopecia areata (AA)⁵.

Los exosomas son una familia de nanopartículas con diámetros que oscilan entre los 30o u2012150 nm y existen en todos los medios de cultivo de biofluidos y células⁶. Los exosomas están enriquecidos con muchas moléculas bioactivas, incluyendo lípidos, ARNm, proteínas y microRNAs (miRNA), y desempeñan un papel importante en las comunicaciones de célula a célula. En los últimos tiempos, los exosomas se han vuelto más atractivos para los investigadores y las compañías farmacéuticas debido a su potencial terapéutico en las clínicas^7,8,9. Recientemente, nuestros estudios mecánicos demostraron que los exosomas liberados por CB-SC contribuyen a la modulación inmune de la terapia SCE^10.

Aquí, describimos el protocolo para explorar el mecanismo de la terapia SCE dirigida a monocitos por exosomas liberados por CB-SC. En primer lugar, los exosomas liberados por CB-SC se aislaron de los medios condicionados derivados de CB-SC utilizando métodos de ultracentrifugación y se validaron mediante citometría de flujo, mancha occidental (WB) y dispersión dinámica de luz (DLS). En segundo lugar, los exosomas derivados de CB-SC fueron etiquetados con un tinte lipofílico fluorescente verde: Dio. En tercer lugar, se co-cultivaron con PBMC para examinar los porcentajes positivos de exosomas derivados de CB-SC con etiqueta dioda en las diferentes subpoblaciones de PBMC por citometría de flujo. Este protocolo proporciona orientación para estudiar la acción de los exosomas subyacentes a la modulación inmune de las células madre.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices del comité institucional de ética de la investigación humana en center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Las unidades de sangre de capa de buffy humana fueron compradas en el New York Blood Center (Nueva York, NY). Las unidades de sangre de cordón umbilical humano fueron recolectadas de donantes sanos y compradas en el banco de sangre Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Tanto el Centro de Sangre de Nueva York como Cryo-Cell han recibido todas las acreditaciones para la recolección y distribución de sangre, con la aprobación del IRB y han firmado Formularios de Consentimiento de donantes.

1. Cultivo celular y preparación de un medio condicionado derivado de CB-SC

1. Transfiera 25 ml de sangre de cordónumbilical (Tabla de materiales)a más de 20 ml de medio de gradiente de densidad (γ a 1.077) a un tubo cónico de 50 ml.
2. Centrifugar a 1.690 x g durante 20 min a 20oC en un rotor basculante sin freno.
3. Transfiera cuidadosamente la capa de celda mononuclear (capa de buffy) a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Llene el tubo cónico con solución salina tamponada de fosfato (PBS) a 40 ml. Mezclar y centrifugar a las células de pellet a 751 x g durante 10 min a 20 oC.
4. Deseche el sobrenadante y agregue 15 ml de tampón de lelisis ACK (Tabla de materiales) al pellet celular. Re-suspenda las células a través del pipeteo. Luego incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Este paso elimina los glóbulos rojos.
5. Llene el tubo cónico con 25 ml de PBS. Centrifugar a 751 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante para obtener células mononucleares peletificadas.
6. Lavar 2x con 40 ml de PBS para eliminar el tampón de lisis restante.
7. Centrifugar a 751 x g durante 5 min para peletizar las células.
8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células mononucleares de sangre del cordón umbilical con 10 ml de medio libre de suero definido por productos químicos(Tabla de materiales)por tubo.
9. Combine las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical con un tubo.
10. Tomar la suspensión de células de 20 l y mezclar con 20 l de solución azul tripano 0,4%(Tabla de materiales)en un tubo de 1,5 ml.
11. Cargue en el portaobjetos de la cámara y cuantifique el número de celda y la viabilidad de la célula con un contador de células automatizado.
    NOTA: La suspensión celular se diluye a 1:10 si la concentración celular está por encima de 1 x 10⁷ células/ml.
12. Células mononucleares de semillas en platos Petri de 150 mm x 15 mm a 1 x 10⁶ células/ml, 25 ml/plato en medio de cultivo celular libre de suero definido por productos químicos.
13. Incubar a 37oC bajo condiciones de 8% de CO₂ durante 10-u201214 días hasta que CB-SC alcance más del 80% de confluencia.
14. Deseche el sobrenadante y lávelo con 15 ml de PBS por plato De Petri; entonces, quite el PBS.
    NOTA: CB-SC se unen firmemente a los platos Petri.
15. Repita el paso 1.14 dos veces.
16. Añadir 25 ml de medio libre de suero definido por productos químicos por plato De Petri.
17. Incubar a 37oC en condiciones de 8% de_CO2 durante 3o3o20124 días.
18. Recoger el medio condicionado derivado de CB-SC en tubos cónicos de 50 ml.

2. Caracterización de CB-SC

1. Separe CB-SC pipeteando 10 ml del búfer de disociación celular basado en PBS hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 5 ml (Tabla de materiales).
2. Centrifugar a 1.690 x g durante 5 min a células de pellet y re-suspender en 200 l de PBS.
3. Fijar y permeabilizar las células para la tinción intracelular a través del kit de preparación de la tinción (Tabla de materiales).
4. Añadir 5 l de bloqueador Fc(Tabla de Materiales)por muestra e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
   NOTA: El bloqueador Fc inhibe la unión no específica al tintar con anticuerpos.
5. Añadir anticuerpos monoclonales antihumanos conjugados con fluorescencia conjugada con fluorescencia, incluidos CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 y Galectin 9 a 25 g/ml(Tabla de materiales)a un volumen de células de 100 oL. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con protección lumíña.
6. Después de la tinción, lavar las células con 1 ml de PBS y centrífuga a 751 x g durante 10 min a las células de pellet.
7. Re-suspenda las células con 200 l de PBS y transfiera a un tubo de 5 ml.
8. Realizar la citometría de flujo para validar la expresión de CB-SC asociado por encima de marcadores específicos.

3. Aislamiento de exosomas derivados de CB-SC

1. Centrifugar el medio acondicionado recogido del paso 1.18 a 300 x g durante 10 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
2. Centrifugar el sobrenadante recogido del paso 3.1 a 2.000 x g durante 20 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
3. Centrifugar el sobrenadante recogido del paso 3.2 a 10.000 x g durante 30 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
   NOTA: El rotor de ángulo fijo se utiliza para que los pellets celulares se precipiten hacia el lado del tubo. Marque el lado de la tapa y dibuje un círculo en el lado del tubo donde se espera el pellet.
4. Filtrar los sobrenadantes recogidos del paso 3.3 con un filtro de 0,22 m(Tabla de materiales).
5. Transferir 15 ml de soporte a cada unidad de filtro centrífugo de 10 kDa (Tabla de materiales).
6. Centrífuga a 4.000 x g durante 30 min para aislar los medios exosoma concentrados.
7. Transfiera los exosomas concentrados a un tubo de ultracentrífuga. A continuación, los exosomas de pellets a 100.000 x g durante 80 min a 4 oC.
8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los exosomas de pellets en 10 ml de PBS.
9. Centrifugar a 100.000 x g durante 80 min a 4 oC para recoger el pellet de exosomas.
10. Re-suspenda el pellet de exosomas en 200 l de PBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

4. Caracterización de exosomas derivados de CB-SC

1. Cuantificación de la concentración total de proteínas de la preparación de exosomas mediante el kit de ensayo de ácido bicinchonínico (BCA)
   1. Pipetear 10 l de cada muestra de exosoma aislado y estándar de albúmina preparada en el paso 3.10 en una placa de 96 pocillos por duplicado.
   2. Añadir 200 l del reactivo de trabajo del kit BCA a cada pocól. Mezcle bien el contenido de la placa en el agitador de placas durante 10 s.
      NOTA: Reactivo de trabajo (WR): Reactivo de 50 partes A con reactivo de 1 parte B.
   3. Cubrir las placas con papel de aluminio e incubarlas a 37oC durante 30 min.
   4. Enfríe las placas a temperatura ambiente (RT).
   5. Mida la absorbancia de la muestra a 562 nm a través de un lector de placas.
2. Preparación y tinción de exosomas para la citometría de flujo
   1. Capturar exosomas añadiendo 20 l de perlas magnéticas CD63 antihumanas (tamaño de 4,5 m)(Tabla de materiales)en 25 g de exosomas derivados de CB-SC preparados en el paso 3.10 en un volumen total de 100 l de PBS.
   2. Incubar el tubo durante la noche (18o u201222 h) a 4oC en la coctelera a 800 rpm.
   3. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 30 s para recoger la muestra en la parte inferior del tubo.
   4. Añadir 300 l de tampón de aislamiento (0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS) y mezclar suavemente por pipeteo.
      NOTA: Este paso lava los exosomas ligados a cuentas.
   5. Coloque el tubo sobre un soporte de imán durante 1 min (Tabla de Materiales) y deseche el sobrenadante.
   6. Repita los pasos 4.2.4-u20124.2.5.
   7. Vuelva a suspender los exosomas ligados al cordón con 400 ml de búfer de aislamiento.
   8. Aliquot 100 l de exosomas ligados a cuentas a cada tubo.
   9. Agregue anticuerpos conjugados con fluorescencia (CD9-FITC, CD81-PE y CD63-FITC a 25 g/ml, respectivamente) a cada tubo de flujo con exosomas cd63 capturados con perlas.
      NOTA: Los IgG que coinciden con los isotipos sirven como controles negativos.
   10. Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente con protección lumíña en el agitador a 800 rpm.
   11. Repita los pasos 4.2.4-u20124.2.5.
   12. Rea suspenda los exosomas ligados al cordón en 200 ml de tampón de aislamiento y transfiera a tubos de flujo de 5 ml.
   13. Coloque los tubos en el carrusel de muestra del citometro de flujo.
   14. Abra el protocolo para las pruebas de exosomas.
   15. Ejecute la muestra automáticamente por citometro de flujo.
3. Detección de exosomas por western blot
   NOTA: Western blot es un método bien establecido y no entraremos en detalles del método en sí.
   1. Lyse los pellets de exosomas derivados de CB-SC del paso 3.10 con 100 l de tampón RIPA, pipeta 20x, luego colóquelos en hielo durante 5 min.
   2. Cuantificar la concentración proteica de un matsato por kit de BCA y cargar 25 g de proteína por poc.
   3. Separe las proteínas por electroforesis de gel durante 40 min a 150 V.
   4. Transfiera la proteína a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando el método de transferencia semisequeo¹¹.
   5. Bloquear la membrana con 5% de leche sin grasa durante 30 min.
   6. Incubar con anticuerpos antihumanos de Calnexina de 2 g/ml(Tabla de materiales)y anticuerpos antihumanos de Calnexina(Tabla de Materiales).
   7. Detectar la proteína por quimiuminescencia con un sistema de imágenes digitales.
4. Validación de exosomas por dispersión de luz dinámica (DLS)
   1. Diluir 10 g de muestras de exosomas derivadas de CB-SC en 1 ml de PBS.
   2. Transfiera los 1 ml de muestra diluida a la semi-micro cubeta desechable (Tabla de materiales).
   3. Coloque la cubeta en el instrumento DLS. Establezca el índice de refracción (RI) como 1,39 para todo el monitor de muestra.
   4. Ejecuta muestras a 25oC y adquiere tres mediciones por fracción para obtener una distribución de tamaño promedio.
5. Validación de exosomas por microscopía electrónica de transmisión (TEM)
   1. Capa formvar en 300 rejillas de cobre de malla¹² (Tabla de materiales).
   2. Fortalecer el formvar con la capa adicional de carbono evaporado en las rejillas de cobre¹².
      NOTA: Este enfoque de recubrimiento es excelente para el soporte de muestras.
   3. Cargue 10 ml de muestras de exosomas en rejillas y déjelas secar al aire.
   4. Tiñe negativamente las muestras con acetato de uranilo durante 5 min.
   5. Lavar tres veces con agua DI y dejar secar al aire.
   6. Observar y fotografiar las muestras bajo TEM. Ajuste la tensión de aceleración a 200 kV y el tamaño del punto en 2.

5. Medir exosomas derivados de CB-SC con etiqueta diodo tomados por diferentes subpoblaciones de PBMC

1. Etiqueta CB-SC-derivado exosomas con colorante lipofílico fluorescente verde Dio
   1. Transfiera 100 g de exosomas derivados de CB-SC (preparados en el paso 3.10) a un tubo centrífugo de 15 ml.
   2. Diluir la muestra con PBS a 5 mL.
   3. Añadir colorante lipofílico fluorescente verde Dio (Tabla de Materiales) hasta que la concentración de trabajo alcance los 5 m.
   4. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz.
   5. Transfiera la muestra a un tubo ultracentrífugo.
   6. Centrífuga a 100.000 x g durante 80 min para peletizar exosomas derivados de CB-SC con etiqueta dio.
   7. Vuelva a suspender los exosomas etiquetados en 200 l de PBS.
2. Preparación de PBMC humano
   1. Transfiera 25 ml de capa de buffy humana (Tabla de Materiales) sobre 20 mL de medio de gradiente de densidad (γ a 1.077) en un tubo cónico de 50 ml.
   2. Repita los pasos 1.2 a 1.11.
   3. Transfiera 1 x 10⁶ PBMC a una placa hidrofóbica no tratada con tejido de 24 pozos (1 ml/pozo).
      NOTA: Se utilizó una placa no tratada con tejido para evitar la adhesión de monocitos.
3. Exosomas etiquetados por Dio con PBMC
   1. Transfiera exosomas de 40 l con etiqueta de diodo derivados de CB-SC preparados en el paso 5.1.7 a cada pozo que contenga PBMC en una placa de 24 pocillos utilizando una pipeta de 200 l. Agregue el mismo volumen de PBS para controlar pozos.
   2. Mezclar por pipeteo 10x. Incubar durante 4 h.
   3. Recoger PBMC tratado con exosoma de 200 l y etiquetar con Hoechst 33342 durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   4. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 100 l de PBS.
   5. Monte las células en las diapositivas del microscopio.
   6. Observar y fotografiar la interacción de exosomas derivados de CB-SC con PBMC con etiqueta Hoechst 33342 utilizando un microscopio.
   7. Transfiera las células restantes del paso 5.3.3 a un tubo de 1,5 ml.
   8. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 200 l de PBS.
   9. Añadir 5 l de bloqueador fc por muestra. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
   10. Agregue anticuerpos (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 y CD56 a 25 g/ml)(Tabla de materiales)para manchar PBMC.
       NOTA: Los IgG que coinciden con los isotipos sirven como controles negativos.
   11. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con protección lumíña.
   12. Añadir 1 ml de PBS y centrífuga a 300 x g durante 10 min a 4 oC para peletizar las células.
   13. Vuelva a suspender las células con 200 l de PBS. Añadir 5 l de yoduro de propidio.
   14. Utilice la citometría de flujo para evaluar el nivel de absorción de exosomas con etiqueta de dio en diferentes subpoblaciones de PBMC.

6. Examinar la acción de los exosomas derivados de CB-SC en monocitos

1. Aislamiento de monocitos humanos CD14 positivos
   1. Transfiera 3 x 10⁷ PBMC humano a un tubo de 15 ml.
   2. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4oC.
   3. Coloque la columna de separación (Tabla de materiales) en el separador de imán ( Tabla demateriales).
   4. Lavar las columnas de separación tres veces con 2 ml de búfer de funcionamiento en frío (Tabla de materiales).
   5. Vuelva a suspender las células en 300 l de PBS frío. Añadir 60 l de microperlas CD14. Mezclar bien e incubar sobre hielo durante 15 min.
   6. Añadir 6 ml de PBS frío. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4oC.
   7. Vuelva a suspender las células peletadas en 500 ml de búfer de funcionamiento en frío.
   8. Transfiera las celdas a la columna de separación (preparada en el paso 6.14) y déjelas pasar.
   9. Lave la columna de separación tres veces con 2 ml de tampón de funcionamiento por lavado. Levante la columna del separador de imanes y colóquela en un tubo centrífugo de 15 ml.
      NOTA: El tubo de 15 ml debe colocarse sobre hielo debido a la adherencia de monocitos CD14 positivos al tubo a temperatura ambiente.
   10. Transfiera 2 ml de búfer de funcionamiento en frío a la parte superior de la columna y aísle las celdas CD14 positivas en el tubo de 15 ml.
   11. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 oC para peletizar las células CD14 positivas.
   12. Re-suspender las células con 2 ml de medio libre de suero definido por productos químicos fríos (Tabla de materiales).
   13. Transfiera 50 l de células a un tubo de 1,5 ml.
   14. Mancha con 10 l de Krome Anom anomante conjugado anomante anhumano CD14 mAb(Tabla de Materiales)durante 20 min.
       NOTA: Los IgG que coinciden con los isotipos sirven como controles negativos.
   15. Agregue 1 ml de PBS a las celdas. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a células de pellet.
   16. Vuelva a suspender las células en 200 l de PBS y transfiéralas a un tubo de 5 ml. Determinar la pureza de los monocitos CD14 positivos por citometría de flujo.
2. Tratamiento de monocitos con exosomas derivados de CB-SC
   1. Semilla 1 x 10⁶ monocitos purificados con medio de cultivo libre de suero definido por productos químicos(Tabla de materiales)en placa de 6 pozos tratada con cultivo de tejido (2 ml/pozo).
   2. Incubar durante 2 h a 37oC por debajo del 5% de CO₂.
   3. Deseche el sobrenadante con pipeta de 1 ml. Añadir suavemente 2 ml de medio de cultivo libre de suero precalecido por productos químicos de 37oC(Tabla de materiales).
      NOTA: Los monocitos se adhirieron a la placa en 2 h. Las células flotantes fueron identificadas como contaminaciones muertas u otras contaminaciones celulares.
   4. Añadir exosomas derivados de CB-SC de 80 g aislados del paso 3.10 a cultivos monocitos en una placa de 6 pocillos con un volumen total de 2 ml.
      NOTA: Se agregó el mismo volumen de PBS para controlar pozos.
   5. Incubar a 37oC por debajo del 5% de_CO2 durante 3o3o20124 días.
   6. Fotografiar la morfología celular con un microscopio invertido a 200× aumento(Tabla de Materiales).
   7. Separe las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo en 1 ml de un búfer de disociación celular basado en PBS con punta de pipeta de 1 ml.
   8. Cosecha las células unidas restantes a través de un rascador de células.
      NOTA: Dado que los monocitos primarios o los macrófagos diferenciados se adhieren firmemente, algunas células permanecen adheridas a la parte inferior después del tratamiento con tampón de disociación. Por lo tanto, estas células se cosechan con un rascador celular.
   9. Recoger celdas a 1.690 x g durante 5 min. Re-suspenda las células en 200 l de PBS.
   10. Agregue 5 l de bloqueador de Fc (25 g/ml) para bloquear la unión no específica.
   11. Agregue anticuerpos (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 y CD209 a 25 g/ml, tabla de materiales)a las células. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
       NOTA: Los IgG coincidentes con isotipos sirven como control negativo
   12. Añadir 1 ml de PBS a las células y centrífuga a 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender con 200 l de PBS.
   13. Añadir 5 sl de yoduro de propidio por muestra (200 l) y transferir células a un nuevo tubo de flujo de 5 ml.
   14. Realice la citometría de flujo y evalúe los niveles de expresiones CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 y CD209.

Resultados

Inicialmente, el fenotipo y la pureza de CB-SC se examinaron mediante citometría de flujo con marcadores asociados a CB-SC como el antígeno común de leucocitos CD45, los factores de transcripción específicos de la célula ES OCT3/4 y SOX2. CB-SC muestra altos niveles de expresión CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 y galectina 9, pero ninguna expresión de CD34 (Figura 1A). El análisis de citometría de flujo confirmó la expresión de marcadores específicos de exosomas, incluidos CD9, CD81 y CD63, estaban...

Discusión

La aplicación de exosomas es un campo emergente para el diagnóstico clínico, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre la preparación de exosomas derivados de CB-SC y el estudio funcional de exosomas sobre la diferenciación de monocitos humanos. El protocolo actual demostró que los exosomas funcionales derivados de CB-SC están aislados por centrifugación secuencial y ultracentrifugación con alta pureza y que exhiben la modulación inmune en monocitos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Tubo cónico de 15 ml	Falcon	352196
placa de 24 pocillos	Falcon	351147	Placa de cultivo sin tejidos
3,3'-Diostadecyloxacarbocianina perclora(Dio)	Millipore sigma	D4292-20MG	Almacenar en 4 ° C
300 Rejillas de malla	Ted Pella	1GC300
Tubo cónico de 50 mL	Falcon	352070
	Falcon	353046	Placa de cultivo de tejidos
Placa de 96 pocillos	Falcon	353072	Placa de cultivo de tejidos
ACK Lysis Buffer	Lonza	10-548E	100 ml
Amicon-15 10kDa Unidad Centrífuga Fliter	Millipore sigma	UFC901024
Anti-Human Alix	Biolegend	634501	tienda en 4 ° C, RRID: AB_2268110
tienda de 699401 Anti-Human Calnexin	Biolegend		en 4 ° C, RRID: AB_2728519
Anticuerpo CD11c antihumano, Pe-Cy7	BD Bioscience	561356	almacenar a 4 & grados; C, RRID: AB_10611859
Anticuerpo CD14 antihumano, tienda Karma Orange	Beckman Coulter	B36294	a 4 & deg; C, RRID: AB_2728099
Anticuerpo CD163 antihumano, PE	BD Bioscience	556018	almacenar a 4 & deg; C, RRID: AB_396296
Anticuerpo CD19 antihumano, PC5	Beckman Coulter	IM2643U	tienda a 4 & grados; C, RRID: AB_131160
Anticuerpo CD206 antihumano, FITC	BD Bioscience	551135	almacenar a 4 & grados; C, RRID: AB_394065
Anti-Anti-Human CD209 anticuerpo, Brilliant Violet 421	BD Bioscience	564127	store en 4 ° C, RRID: AB_2738610
Anticuerpo CD270 antihumano, PE	Biolegend	318806	almacenar a 4 & grados; C, RRID: AB_2203703
Anticuerpo CD3 antihumano, Pacfic Blue	Biolegend	300431	tienda a 4 & grados; C, RRID: AB_1595437
Anticuerpo CD34 antihumano, APC	Beckman Coulter	IM2427U	almacén a 4 & grados; C, RRID: N/A
Anticuerpo CD4 antihumano, APC	BD Bioscience	555349	tienda a 4 & deg; C, RRID: AB_398593
Anticuerpo CD45 antihumano, Pe-Cy7	Beckman Coulter	IM3548U	almacén a 4 & grados; C, RRID: AB_1575969
Anticuerpo CD56 antihumano, PE	Beckman Coulter	IM2073U	almacenar a 4 & grados; C, RRID: AB_131195
anticuerpo CD63 antihumano, PE	BD Bioscience	561925	tienda a 4 & grados; C, RRID: AB_10896821
Anticuerpo CD8 antihumano, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	A94686	tienda a 4 & grados; C, RRID: N/A
Anticuerpo anti-humano CD80, tienda APC	Beckman Coulter	B30642	en 4 ° C, RRID: N/A
Anticuerpo anti-humano CD81, FITC	BD Bioscience	561956	tienda a 4 & grados; C, RRID: AB_394049
Anticuerpo CD86 antihumano, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	B30646	tienda a 4 & deg; C, RRID: N/A
Anticuerpo anti-humano CD9, FITC	ThermoScientic	MA5-16860	tienda en 4 & deg; C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 anticuerpo, Brilliant Violet 421	Biolegend	348919	tienda en 4 ° C, RRID: AB_2716134
anticuerpo OCT3/4 antihumano, eFluor660	ThermoScientic	50-5841-82	almacene a 4 & deg; C, RRID: AB_11218882
Anticuerpo SOX2 antihumano, Alexa Fluor 488	ThermoScientic	53-9811-82	tienda en 4 ° C, RRID: AB_2574479
Kit de ensayo de proteínas BCA	ThermoFisher Scientific	23227
Albúmina sérica bovina	Millipore Sigma	A1933
Buffy	coat New York Blood Center		40-60 ml/unidad
Raspador de células	Falcon	353085
Cubeta semimicro desechable	VWR	97000590
Tampón de disociación	Gibco	131510014	100 ml
Portaobjetos de recuento de células Dual-Chanber	Bio-Rad	1450015
Reactivo de detección de exosomas humanos CD63	ThermoFisher Scientific	10606D	almacenar a 4 & grados; C
Ficoll-Paque PLUS densidad grandient media	GE Health	17-1440-03	500 ml
Rotor de ángulo fijo (25°)	Thermo Scientifc	75003698	Maxium 24.700 x g
Citómetro de flujo Gallios	Beckman Coulter		3 láseres 10 Color Max
Sangre de cordón umbilical humano	Cryo-Cell International		40-100 ml/unidad
Bloque Fc Humano	BD Bioscience	564220	tienda a 4 & deg; C
Membrana de PVDF Immun-Blot	Bio-Rad	1620177
Millex-GP Unidad de filtro de jeringa, 0,22 y micro; m	Millipore Sigma	SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentrígugo	Beckman Coulter
Agitador Orbital MP4	BioExpress	S-3500-1
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	500 ml
Yoduro de propidio	BD Bioscience	56-66211E	tienda en 4 ° C
Microscopio Nikon Eclipse Ti2	Nikon instruments Inc	Eclipse Ti2	NIS-Elements versión de software 5.11.02
Hochest 33342	Thermo Scientifc	62249	5 ml
Microsopía Revert	Fisher scientific	12563518
Rotor 41 Ti	Beckman Coulter	331362	Maxium 41.000 rpm
Sorvall St 16R Centrífuga	Thermo Rotor	Scientifc 75004381
	Thermo Scientifc	75003655
TC-20 Contador de celdas	Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle Incubadora de CO2	ThermoFisher Scientific
Microscopía electrónica de transmisión	JEOL	JEM-2100 PLUS
Tubo de ultracentrífuga	Beckman Coulter	331372
X'VIVO 15 Medio sin suero	Lonza	BEBP04-744Q	1000 ml Medio de cultivo, almacenar a 4 & grados; C