Artículo de método

Diferenciación de monocitos en macrófagos fenotípicamente distintos después del tratamiento con células madre de sangre de cordón humano (CB-SC)-Exosomas derivados

DOI:

10.3791/61562

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12 de noviembre de 2020

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1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

En este artículo

Resumen

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La aplicación de exosoma es una herramienta emergente para el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Establecemos un protocolo de aislamiento exosoma con alta pureza para aislar exosomas de nuevas células madre identificadas llamadas CB-SC para estudios mecánicos. También coculuramos exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos, lo que lleva a su diferenciación en macrófagos fenotípicamente distintos.

Resumen

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La terapia de educador de células madre (SCE) es un nuevo enfoque clínico para el tratamiento de la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes. La terapia SCE circula las células mononucleares de la sangre del paciente aislado (por ejemplo, linfocitos y monocitos) a través de una máquina de aféresis, co-cultiva las células mononucleares de sangre del paciente con células madre derivadas de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) en el dispositivo SCE, y luego devuelve estas células inmunitarias "educadas" a la sangre del paciente. Los exosomas son vesículas extracelulares de tamaño nanonúlgubre entre 30o u2012150 nm existentes en todos los medios de cultivo de biofluidos y células. Para explorar más a fondo los mecanismos moleculares subyacentes a la terapia SCE y determinar las acciones de los exosomas liberados de CB-SC, investigamos qué células fagocitan estos exosomas durante el tratamiento con CB-SC. Al co-cultivar exosomas derivados de CB-SC con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), descubrimos que los exosomas derivados de CB-SC eran tomados predominantemente por monocitos humanos CD14 positivos, lo que llevó a la diferenciación de los monocitos en macrófagos tipo 2 (M2), con morfología similar a un husillo y la expresión de marcadores de superficie moleculares asociados a M2. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y caracterización de exosomas derivados de CB-SC y el protocolo para la cocultura de exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos y el monitoreo de la diferenciación M2.

Introducción

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Las células madre de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) son un tipo único de células madre identificadas a partir de la sangre del cordón umbilical humano y se distinguen de otros tipos conocidos de células madre como las células madre mesenquimales (MSC) y las células madre hematopoyéticas (HSC)1. Basándonos en sus propiedades únicas de modulación inmune y su capacidad para adherirnos firmemente a la superficie de los platos petri, desarrollamos una nueva tecnología designada como terapia de educador de células madre (SCE) en ensayos clínicos2,3. Durante el tratamiento con SCE, las....

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Protocolo

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El protocolo sigue las directrices del comité institucional de ética de la investigación humana en center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Las unidades de sangre de capa de buffy humana fueron compradas en el New York Blood Center (Nueva York, NY). Las unidades de sangre de cordón umbilical humano fueron recolectadas de donantes sanos y compradas en el banco de sangre Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Tanto el Centro de Sangre de Nueva York como Cryo-Cell han recibido todas las acreditaciones para la recolección y distribución de sangre, con la aprobación del IRB y han firmado Formularios de Consentimiento de donantes.

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Resultados

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Inicialmente, el fenotipo y la pureza de CB-SC se examinaron mediante citometría de flujo con marcadores asociados a CB-SC como el antígeno común de leucocitos CD45, los factores de transcripción específicos de la célula ES OCT3/4 y SOX2. CB-SC muestra altos niveles de expresión CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 y galectina 9, pero ninguna expresión de CD34 (Figura 1A). El análisis de citometría de flujo confirmó la expresión de marcadores específicos de exosomas, incluidos CD9, CD81 y CD63, estaban.......

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Discusión

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La aplicación de exosomas es un campo emergente para el diagnóstico clínico, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre la preparación de exosomas derivados de CB-SC y el estudio funcional de exosomas sobre la diferenciación de monocitos humanos. El protocolo actual demostró que los exosomas funcionales derivados de CB-SC están aislados por centrifugación secuencial y ultracentrifugación con alta pureza y que exhiben la modulación inmune en monocitos.

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Divulgaciones

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El Dr. Zhao es uno de los fundadores de Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. Dr. Zhao es un inventor de la tecnología Stem Cell Educator. Todos los demás autores no tienen intereses financieros que puedan ser relevantes para la obra presentada.

Agradecimientos

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Agradecemos al Sr. Poddar y al Sr. Ludwig por el generoso apoyo de fondos a través de la Fundación Hackensack UMC. Agradecemos a Laura Zhao por la edición en inglés.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Tubo cónico de 15 mlFalcon352196
placa de 24 pocillosFalcon351147Placa de cultivo sin tejidos
3,3'-Diostadecyloxacarbocianina perclora(Dio)Millipore sigmaD4292-20MGAlmacenar en 4 ° C
300 Rejillas de mallaTed Pella1GC300
Tubo cónico de 50 mLFalcon352070
Falcon353046Placa de cultivo de tejidos
Placa de 96 pocillosFalcon353072Placa de cultivo de tejidos
ACK Lysis BufferLonza10-548E100 ml
Amicon-15 10kDa Unidad Centrífuga FliterMillipore sigmaUFC901024
Anti-Human AlixBiolegend634501tienda en 4 ° C, RRID: AB_2268110
tienda de 699401 Anti-Human CalnexinBiolegenden 4 ° C, RRID: AB_2728519
Anticuerpo CD11c antihumano, Pe-Cy7BD Bioscience561356almacenar a 4 & grados; C, RRID: AB_10611859
Anticuerpo CD14 antihumano, tienda Karma OrangeBeckman CoulterB36294a 4 & deg; C, RRID: AB_2728099
Anticuerpo CD163 antihumano, PEBD Bioscience556018almacenar a 4 & deg; C, RRID: AB_396296
Anticuerpo CD19 antihumano, PC5Beckman CoulterIM2643Utienda a 4 & grados; C, RRID: AB_131160
Anticuerpo CD206 antihumano, FITCBD Bioscience551135almacenar a 4 & grados; C, RRID: AB_394065
Anti-Anti-Human CD209 anticuerpo, Brilliant Violet 421BD Bioscience564127store en 4 ° C, RRID: AB_2738610
Anticuerpo CD270 antihumano, PEBiolegend318806almacenar a 4 & grados; C, RRID: AB_2203703
Anticuerpo CD3 antihumano, Pacfic BlueBiolegend300431tienda a 4 & grados; C, RRID: AB_1595437
Anticuerpo CD34 antihumano, APCBeckman CoulterIM2427Ualmacén a 4 & grados; C, RRID: N/A
Anticuerpo CD4 antihumano, APCBD Bioscience555349tienda a 4 & deg; C, RRID: AB_398593
Anticuerpo CD45 antihumano, Pe-Cy7Beckman CoulterIM3548Ualmacén a 4 & grados; C, RRID: AB_1575969
Anticuerpo CD56 antihumano, PEBeckman CoulterIM2073Ualmacenar a 4 & grados; C, RRID: AB_131195
anticuerpo CD63 antihumano, PEBD Bioscience561925tienda a 4 & grados; C, RRID: AB_10896821
Anticuerpo CD8 antihumano, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterA94686tienda a 4 & grados; C, RRID: N/A
Anticuerpo anti-humano CD80, tienda APCBeckman CoulterB30642en 4 ° C, RRID: N/A
Anticuerpo anti-humano CD81, FITCBD Bioscience561956tienda a 4 & grados; C, RRID: AB_394049
Anticuerpo CD86 antihumano, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterB30646tienda a 4 & deg; C, RRID: N/A
Anticuerpo anti-humano CD9, FITCThermoScienticMA5-16860tienda en 4 & deg; C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 anticuerpo, Brilliant Violet 421Biolegend348919tienda en 4 ° C, RRID: AB_2716134
anticuerpo OCT3/4 antihumano, eFluor660ThermoScientic50-5841-82almacene a 4 & deg; C, RRID: AB_11218882
Anticuerpo SOX2 antihumano, Alexa Fluor 488ThermoScientic53-9811-82tienda en 4 ° C, RRID: AB_2574479
Kit de ensayo de proteínas BCAThermoFisher Scientific23227
Albúmina sérica bovinaMillipore SigmaA1933
Buffycoat New York Blood Center40-60 ml/unidad
Raspador de célulasFalcon353085
Cubeta semimicro desechableVWR97000590
Tampón de disociaciónGibco131510014100 ml
Portaobjetos de recuento de células Dual-ChanberBio-Rad1450015
Reactivo de detección de exosomas humanos CD63ThermoFisher Scientific10606Dalmacenar a 4 & grados; C
Ficoll-Paque PLUS densidad grandient mediaGE Health17-1440-03500 ml
Rotor de ángulo fijo (25°)Thermo Scientifc75003698Maxium 24.700 x g
Citómetro de flujo GalliosBeckman Coulter3 láseres
10 Color Max
Sangre de cordón umbilical humanoCryo-Cell International40-100 ml/unidad
Bloque Fc HumanoBD Bioscience564220tienda a 4 & deg; C
Membrana de PVDF Immun-BlotBio-Rad1620177
Millex-GP Unidad de filtro de jeringa, 0,22 y micro; mMillipore SigmaSLGP033RS
Optima XE-90 UltracentrígugoBeckman Coulter
Agitador Orbital MP4BioExpressS-3500-1
PBSThermoFisher Scientific10010049500 ml
Yoduro de propidioBD Bioscience56-66211Etienda en 4 ° C
Microscopio Nikon Eclipse Ti2Nikon instruments IncEclipse Ti2NIS-Elements versión de software 5.11.02
Hochest 33342Thermo Scientifc622495 ml
Microsopía RevertFisher scientific12563518
Rotor 41 TiBeckman Coulter331362Maxium 41.000 rpm
Sorvall St 16R CentrífugaThermo RotorScientifc 75004381
Thermo Scientifc75003655
TC-20 Contador de celdasBio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle Incubadora de CO2ThermoFisher Scientific
Microscopía electrónica de transmisiónJEOLJEM-2100 PLUS
Tubo de ultracentrífugaBeckman Coulter331372
X'VIVO 15 Medio sin sueroLonzaBEBP04-744Q1000 ml Medio de cultivo, almacenar a 4 & grados; C
Placa de 6 pocillos de cangilón oscilante

Referencias

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  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration followin....

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