Artículo de método

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

DOI:

10.3791/61563

⸱

13 de enero de 2021

 , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University

En este artículo

Resumen

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Se presenta aquí un protocolo para la proyección de imagen de la vivir-célula de la super-resolución en tejido intacto. Hemos estandarizado las condiciones para la obtención de imágenes de una población de células madre adultas altamente sensibles en su entorno de tejido nativo. Esta técnica consiste en equilibrar la resolución temporal y espacial para permitir la observación directa de fenómenos biológicos en tejidos vivos.

Resumen

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Durante mucho tiempo ha habido un equilibrio crucial entre la resolución espacial y temporal en las imágenes. Las imágenes más allá del límite de difracción de la luz se han restringido tradicionalmente para ser utilizadas solo en muestras fijas o células vivas fuera del tejido etiquetado con señal fluorescente fuerte. Las técnicas actuales de imagen de células vivas de súper resolución requieren el uso de sondas especiales de fluorescencia, alta iluminación, múltiples adquisiciones de imágenes con procesamiento posterior a la adquisición o, a menudo, una combinación de estos procesos. Estos requisitos previos limitan significativamente las muestras biológicas y los contextos a los que se puede aplicar esta técnica.

Aquí describimos un método para realizar super-resolución (~ 140 nm XY-resolución) tiempo de fluorescencia imágenes de células vivas in situ. Esta técnica también es compatible con baja intensidad fluorescente, por ejemplo, EGFP o mCherry endógenamente etiquetados en genes expresados humildemente. Como prueba de principio, hemos utilizado este método para visualizar múltiples estructuras subcelulares en el testículo de Drosophila. Durante la preparación del tejido, tanto la estructura celular como la morfología tisular se mantienen dentro del testículo diseccionado. Aquí, utilizamos esta técnica para obtener imágenes de la dinámica de los microtúbulos, las interacciones entre los microtúbulos y la membrana nuclear, así como la unión de los microtúbulos a los centrómeros.

Esta técnica requiere procedimientos especiales en la preparación de muestras, montaje de muestras e inmovilización de muestras. Además, los especímenes se deben mantener por varias horas después de la disección sin comprometer la función y la actividad celulares. Si bien hemos optimizado las condiciones para la obtención de imágenes de súper resolución en vivo específicamente en las células madre de la línea germinal masculina de Drosophila (GSCs) y las células germinales progenitoras en el tejido de testículo diseccionado, esta técnica es ampliamente aplicable a una variedad de diferentes tipos de células. La capacidad de observar las células bajo sus condiciones fisiológicas sin sacrificar la resolución espacial o temporal servirá como una herramienta invaluable para los investigadores que buscan abordar preguntas cruciales en biología celular.

Introducción

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Visualizar las estructuras subcelulares y la dinámica de proteínas en células vivas con resolución más allá del límite de difracción de la luz es típicamente muy difícil1-3. Mientras que se han desarrollado múltiples técnicas de súper resolución como microscopía estocástica-óptica-reconstrucción-microscopía (STORM), foto-activada-localización-microscopía (PALM) y estimulada-emisión-agotamiento (STED)4,5,6 microscopía, las complicaciones en la preparación de muestras, así como la necesidad de mantener la viabilidad y la actividad ex vivo, lim....

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Protocolo

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1. Preparación de cóctel de imágenes de células vivas (medios celulares vivos)

  1. Complemente el medio Drosophila de Schneider con suero fetal bovino al 15% (FBS) y 0,6 veces penicilina/estreptomicina. Ajuste el pH a aproximadamente 7.0.
  2. Justo antes de usar el medio, agregue insulina a una concentración final de 200 μg/mL.
    NOTA: Este medio es crítico para mantener la división celular normal y el desarrollo del testículo de Drosophila durante las imágenes de lapso de tiempo10,14.

2. Preparación del plato de cultivo celular con fondo de vidrio....

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Resultados

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La proyección de imagen viva de la célula más allá del límite de la difracción en tejido de Drosophila, especialmente para GSCs, proporciona una oportunidad de investigar la dinámica de eventos subcelulares en el contexto de la progresión del ciclo celular. Recientemente, un estudio que utiliza este protocolo ha mostrado que las actividades de los microtúbulos en el centrosoma de la madre contra el centrosoma de la hija son temporal asimétricas en GSCs10. El centrosoma de la madre emana m.......

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Discusión

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Los métodos de microscopía de súper resolución proporcionan una resolución espacial tan alta como 10s de nanómetros4,5,6. Los métodos de microscopía STORM y PALM permiten una resolución de hasta 20 a 50 nm (resolución XY), mientras que la microscopía STED ofrece una resolución de 20 a 100 nm (resolución XY). La resolución espacial de la microscopía SIM está limitada a 100 a 130 nm15. Sin embargo, debido a su alta dens.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Agradecimientos

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A los autores les gustaría agradecer a las instalaciones de Integrated Imaging Core de la Universidad Johns Hopkins por los microscopios y el software de análisis de datos. Agradecemos a J. Snedeker y Q. E. Yu por la corrección de pruebas y sugerencias, y a los miembros del laboratorio X.C. por sus útiles discusiones y sugerencias. Con el apoyo de NIGMS/NIH R35GM127075, el Instituto Médico Howard Hughes, la Fundación David y Lucile Packard y los fondos de inicio de la Universidad Johns Hopkins (X.C.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adobe Illustrator CS6 (software de creación de figuras)AdobeN/A
Membrana de diálisisSpectra/Por 1-4 Membrana de diálisis RC estándarNº de cat. 08-67121
FBSThermo Fisher ScientificN.º de cat. 2614007915% (V/V)
Fiji (software de análisis)NIHN/ACuantificación de la intensidad de fluorescencia de la imagen
Placas de cultivo celular con fondo de vidrio (FluroDish)World Precision Instrument, Inc.FD35PDL-100
Imaris (software de reconstrucción de imágenes)BitplaneN/AReconstrucción de imágenes 3D
Aceite de inmersiónZeissImmersol 518F/30 ° C
InsulinaSigma Cat. Nº 15550200 y micro; g/ml
Penicilina/estreptomicinaInvitrogenNº de cat - 15140-1220,6x
Schneider Drosophila mediaInvitrogenNº de gato - 11720-034
Microscopio confocal de disco giratorioZeissN/Aequipado con una cámara evolve (fotometría), utilizando un objetivo Zeiss de 63x (1,4 NA).
Papel de sedaKimwipeN/A
Microscopio confocal LSM 800 con cámara húmeda con módulo de superresolución AiryScanZeissN/Aequipado con detectores de GaAsP (fosfuro de arseniuro de galio) de alta sensibilidad con un objetivo Zeiss 63x (1,4 NA)
ZEN (software de imagen)ZeissN/A

Referencias

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  1. Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312(2020).
  2. Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymolo....

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