Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Resumen

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Resumen

Extensos estudios han caracterizado el desarrollo y la diferenciación de las células B murinas en los órganos linfoides secundarios. Los anticuerpos secretados por las células B han sido aislados y desarrollados en terapias bien establecidas. La validación del desarrollo de células B murinas, en el contexto de ratones propensos a la autoinmunidad, o en ratones con sistemas inmunes modificados, es un componente crucial del desarrollo o prueba de agentes terapéuticos en ratones y es un uso apropiado de la citometría de flujo. Se pueden utilizar parámetros citométricos de flujo de células B bien establecidos para evaluar el desarrollo de células B en el peritoneo murino, la médula ósea y el bazo, pero se deben seguir una serie de mejores prácticas. Además, el análisis citométrico de flujo de los compartimentos de células B también debe complementar las lecturas adicionales del desarrollo de células B. Los datos generados utilizando esta técnica pueden ampliar nuestra comprensión de los modelos de ratón propensos autoinmunes de tipo salvaje, así como de los ratones humanizados que se pueden usar para generar anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos como terapéuticos.

Introducción

Los anticuerpos monoclonales se han convertido cada vez más en la terapia de elección para muchas enfermedades humanas a medida que se convierten en parte de la medicina ^{convencional1,2}. Hemos descrito previamente ratones genéticamente modificados que producen eficientemente anticuerpos que albergan regiones variables completamente humanas con constantes de IgH de ^ratón3,4. Más recientemente, hemos descrito ratones genéticamente modificados que producen moléculas similares a anticuerpos que tienen una unión a antígenos ^distinta5....

Protocolo

Todos los estudios con ratones fueron supervisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Regeneron. El experimento se llevó a cabo en tejidos de tres ratones hembra C57BL / 6J (17 semanas de edad) de Jackson Laboratories. Valore todos los anticuerpos antes de comenzar el experimento para determinar la concentración ideal. Cuando use perlas de compensación para la compensación de un solo color, asegúrese de que se manchen tan brillantes o más brillantes que sus muestras. Mantenga todos los tampones, anticuerpos y células en hielo o a 4 °C. Después de la adición de tinte de viabilidad, realice todos los pasos e incubaciones a 4....

Resultados

Aquí presentamos la estrategia de gating para caracterizar el desarrollo de células B en peritoneo de ratón, BM y bazo. La base del análisis se forma en torno al concepto de tinción con tinte de viabilidad, luego se eliminan los dobletes basados en el Área de Dispersión Hacia Adelante (FSC-A) y la Altura de Dispersión Hacia Adelante (FSC-H), y finalmente se eliminan los desechos seleccionando las células de acuerdo con sus características FSC-A y Área de Dispersión Lateral (SSC-A), conoci.......

Discusión

El análisis citométrico de flujo de tejidos linfoides y no linfoides ha permitido la identificación y enumeración simultánea de subpoblaciones de células B en ratones y humanos desde la década de 1980. Se ha utilizado como una medida de la inmunidad humoral y se puede aplicar aún más para evaluar la funcionalidad de las células B. Este método aprovecha la disponibilidad de reactivos para evaluar diferentes etapas de maduración de células B en ratones y humanos, mediante el análisis simultáneo de múltiples parámetros que .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 mL de tubos Eppendorf con cierre de seguridad	Eppendorf	22363611	tubo de microcentrífuga de 0,5 mL
tubos Eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf	22364111	tubo de microcentrífuga de 1,5 mL
Falcon de 15 mL	Corning	352097	tubo cónico de 15 mL
aguja de calibre 18	BD	305196
aguja de calibre 25	BD
jeringa de 3 mL	BD 309657
70 mM MACS SmartStrainer	Miltenyi Biotec	130-110-916	Filtro de celdas de 70 mM
Placa inferior en U de 96 pocillos	VWR	10861-564
Tampón de lisis ACK	GIBCO	A1049201	tampón de lisis de glóbulos rojos
Acroprep Advance 96 Placa de filtro de pocillos	Pall Corporation	8027	placa de filtro
B220	eBiosciences	17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ	Cuentas de compensación	BD
552843 BD CompBead Anti-Rat Ig/κ	BD	552844	perlas de compensación
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A8577	BSA
BP-1	BD	740882
Tampón de tinción brillante	BD 566349		tampón de tinción brillante
C-Kit	BD	564011
CD11b	BD	563168
CD11b	BioLegend	101222
CD19	BD	560143
CD21/35	BD
CD23	BD	740216
CD24 (HSA)	BioLegend	138504
CD3	BD	561388
CD3	BioLegend	100214
CD43	BD	553270
CD43	BioLegend	121206
CD5	BD	563194
CD93	BD	740750
CD93	BioLegend	136504
DPBS (1x)	ThermoFisher	14190-144	DPBS
eBioscience Tinte de viabilidad fijable eFluor 506	ThermoFisher	65-0866-14	colorante de viabilidad
Pipeta de transferencia de punta fina extendida	Samco	233	pipeta de transferencia desechable
FACSymphony A3 citómetro de flujo	BD	pedido personalizado	citómetro de flujo
Fc block, CD16/CD32 (2.4G2)	BD	553142	Fc block
FlowJo	Flowjo		software de análisis de citómetros de flujo
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-096-334 tubo de	disociación automatizado
gentleMACS Octo Disociador con Calentadores	Miltenyi Biotec	130-095-937	instrumento disociador de tejidos
GR1 (Ly6C/6G)	BioLegend	108422
IgD	BioLegend	405710
IgM	eBiosciences	25-5790-82
Kappa	BD	550003
Lambda	BioLegend	407308
paraformaldehído, solución al 32%	Electrón Ciencias de la Microscopía	15714
Ter119 BioLegend		116220
Bloqueador de monocitos de tinción	verdadera BioLegend	426103	bloqueador de monocitos
UltraPure EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575038	EDTA
Vi-CELL XR	Beckman Coulter	731050	instrumento de contador de células

tubos 305124562756