Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.
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Artículo de método
Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer
En este artículo
Resumen
Resumen
Los linfocitos ingenuos recirculan de la sangre a los tejidos linfoides bajo condición fisiológica y comúnmente se reconoce como un fenómeno importante en la inmunidad intestinal. El estroma de órganos linfoides secundarios, como los parches de Peyer (PPs) o los ganglios linfáticos mesentericos, es donde los linfocitos ingenuos detectan antígenos. Los linfocitos ingenuos circulan a través del torrente sanguíneo para llegar a ventules endoteliales altos, el portal de entrada en PPs. Se estima que algunos inmunomoduladores influyen en la migración de linfocitos, pero la evaluación precisa de la dinámica de microcirculación es muy difícil, y establecer un método para observar la migración de linfocitos in vivo puede contribuir a la clarificación de los mecanismos precisos. Refinamos el método de recolección de linfocitos del conducto linfático y observando la dinámica detallada de los linfocitos trópicos intestinales en los PPs de rata. Elegimos la microscopía de escaneo láser confocal para observar los PPs de rata in vivo y la grabamos usando fotografía de lapso de tiempo. Ahora podemos obtener imágenes claras que puedan contribuir al análisis de la dinámica de los linfocitos.
Introducción
Los parches de Peyer consisten en cientos de folículos linfoides en la propria lamina del intestino delgado. Los PPs se dividen en folículos, la región interfollicular y los centros germinales ubicados en la parte inferior de los folículos, donde los linfocitos son estimulados por la presentación de antígenos. No hay vasos linfáticos aferentes, y los antígenos invaden la propria lamina del lúmenes intestinales a través de la capa celular epitelial. La región epitelial que cubre folículos linfoides se llama epitelio asociado al folículo, dentro del cual las células M intercaladas especializadas captan antígenos mucosos. Las células M toman antígenos del lado luminal y ....
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Protocolo
El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Colegio Médico de Defensa Nacional (nº 16058). Los animales se mantuvieron en la comida de laboratorio estándar (CLEA Japan Inc, Tokio, Japón). Los animales de laboratorio fueron tratados de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Recolección y separación de linfocitos
NOTA: Dado que los linfocitos deben estar frescos y no pueden almacenarse, deben ser recogidos de ratas para cada experimento. Además, los linfocitos trópicos intestinales deben recogerse directamente del conducto torácico donde circulan. Se....
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Resultados
Recolección de linfocitos de la linfa
Para preparar la rata para la canulación del conducto torácico, haga una incisión en el tenso conducto torácico como se muestra en la Figura 1 y luego mantenga a la rata en la jaula de un Bollman como se muestra en la Figura 2.
Cuando los linfocitos están bien recogidos, podemos obtener alrededor de 20 ml/6 h de líquido linfático que contiene aproximadamente 107~ 10<.......
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Discusión
Aquí describimos un protocolo para recolectar linfocitos ingenuas de intestino y trópicos y observar su migración en PPs de ratas. Estos procedimientos pueden revelar cómo los linfocitos se mueven en la microvasculatura de los PPs y permiten comparar visualmente su dinámica bajo una condición normal o medicada. La observación directa de estas dinámicas tiene mucho mérito para obtener una pista de modificación inmunológica por parte de algunos fármacos, aunque el período observacional se limita a sólo unas pocas horas.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por subvenciones del National Defense Medical College y por una beca de investigación de Salud y Ciencias del Trabajo para la investigación sobre enfermedades intratables del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| A1R + | Nikon | Microscopía de escaneo láser Comfocal | |
| Carboxifluoresceína diacetato éster succinimidílico | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurano | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medio | GIBCO | 11875093 | |
| Rojo de Texas – dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
Referencias
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-....
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Reimpresiones y permisos
