Artículo de método

Cuantificación del ADN específico de la porcino circulante en la sangre de un modelo de trasplante

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DOI:

10.3791/61579

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22 de septiembre de 2020

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1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Utilizando imprimaciones específicas de especies, cpsDNA fue cuantificado por qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono.

Resumen

La xenotrasplante es un método factible para tratar la insuficiencia orgánica. Sin embargo, cómo controlar eficazmente el rechazo inmune del xenotrasplante es un problema para los médicos e investigadores. Este manuscrito describe un método simple y eficaz para monitorear el rechazo inmune en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono. El ADN circulante es un biomarcador potencialmente no invasivo para el daño a los órganos. En este estudio, el ADN específico del cerdo circulante (cpsDNA) fue monitoreado durante el rechazo del xenoinjerto por PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR). En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Las imprimaciones específicas de las especies se utilizaron entonces para cuantificar cpsDNA mediante qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono. El valor de este método sugiere que se puede utilizar como un método simple, conveniente, de bajo costo y menos invasivo para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante.

Introducción

La insuficiencia orgánica es una de las principales causas de muerte1. El trasplante de células, tejidos y órganos es una forma eficaz de tratar la insuficiencia orgánica2. Sin embargo, la escasez de órganos donantes limita la aplicación clínica de este método3,4. Los estudios han demostrado que los cerdos pueden ser utilizados como una fuente potencial de órganos humanos para el trasplante clínico5,6. Sin embargo, el trasplante de órganos entre especies se enfrenta a un rechazo inmune peligroso. Por lo tanto, es crucial controlar el rechazo inmune del xenotrasplante. Actualmente, el monitoreo clínico del rechazo inmune depende principalmente de los signos y síntomas del paciente, así como de las pruebas de laboratorio (por ejemplo, biopsia, análisis inmunobioquímico y ultrasonido)7,8,9. Sin embargo, estos métodos de supervisión tienen muchas desventajas. Los signos y síntomas del rechazo inmune en los pacientes suelen aparecer a finales de10,lo que no es propicio para la detección temprana y la intervención temprana; biopsia tiene la desventaja de ser invasivo11, lo que no es fácil de aceptar para los pacientes; el análisis inmunobioquímico carece de sensibilidad o especificidad, y el ultrasonido es auxiliar y costoso. Por lo tanto, es urgente encontrar un método eficaz y conveniente para monitorear el rechazo inmune.

El ADN circulante es un tipo extracelular de ADN que se encuentra en la sangre. Mandel y Metais12 informaron por primera vez de la presencia de ADN circulante en la sangre periférica en 1948. En condiciones fisiológicas normales, el ADN circulante en la sangre de personas sanas es relativamente bajo al inicio. Sin embargo, en algunas patologías, como tumores, infarto de miocardio, enfermedades autoinmunes y rechazo de trasplantes, el nivel de ADN circulante en la sangre puede aumentar significativamente13,14 debido a la liberación masiva de ADN circulante causado por apoptosis y necrosis. El origen del ADN circulante se asocia con la apoptosis y la necrosis15,que son características del rechazo del xenoinjerto16.

Se ha demostrado que el ADN circulante es un biomarcador mínimamente invasivo para detectar cánceres17,18,19. La alta secuenciación a través del ADN circulante derivado de donantes es fiable para la detección del rechazo después del trasplante deórganos 20,21. Sin embargo, este método requiere una alta concentración y calidad de ADN extraído. Los requisitos de ADN, además del alto costo y el consumo de tiempo, hacen que este método no sea elegible para el uso clínico de rutina. El ADN circulante derivado del donante puede cuantificarse con precisión mediante PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR), que es específico y sensible. Por lo tanto, cuantificar el ADN circulante porcino por qPCR es un método factible para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante. Esto es menos invasivo, altamente sensible y específico, de bajo costo y ahorro de tiempo. Los cerdos y los seres humanos están genéticamente separados con secuencias genómicas muy diferentes(Figura 1). Por lo tanto, el ADN porcino circulante puede ser liberado en la sangre del receptor después del trasplante de xenotrasplante debido al xeno-rechazo. CpsDNA podría ser cuantificado con precisión por qPCR con imprimaciones específicas de la especie en la sangre del receptor. Anteriormente, hemos demostrado la justificación y viabilidad de cpsDNA como biomarcador para el xenotrasplante22,23. Aquí, revelamos consejos y detalles más experimentales. El experimento consta de los pasos siguientes. En primer lugar, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas y se aisló el ADN genómico, que se utilizó para verificar la especificidad de las imprimaciones por PCR regular. En segundo lugar, construir la curva estándar de cpsDNA y aislar cpsDNA a partir de la sangre de la muestra. Por último, el ADN específico del cerdo circulante se cuantificó utilizando qPCR.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la Junta de Revisión Institucional del Hospital del Segundo Pueblo de Shenzhen, Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Shenzhen.

1. Diseñar imprimaciones específicas porcinas

  1. Realizar análisis BLAST del genoma completo para identificar genes específicos porcinos que eran diferentes de los de los seres humanos, monos o ratón, utilizando el software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  2. Diseñar imprimaciones según 19 genes específicos del cerdo (Tabla 1) utilizando el software de Primer 5.

2. Aislamiento del ADN genómico

NOTA: El ADN genómico (incluyendo sangre de cerdos, monos, humanos voluntarios, monos con injertos de cerdo y ratones con células porcinas) se extrajeron utilizando un kit comercial de extracción de ADN genómico (Tabla de materiales).

  1. Colocar 500 l de toda la sangre de las muestras superiores en diferentes tubos de microcentrífuga, respectivamente.
  2. Añadir 20 l de proteasa K y 500 l de tampón de lysis en los tubos de microcentrífuga anteriores, y luego agitar y mezclar a fondo.
  3. Colocar estos tubos de microcentrífuga en un baño de agua a 56 oC durante 10 minutos y agitar 2-3 veces durante este proceso hasta que la solución se aclare.
  4. Centrifugar brevemente para eliminar las perlas líquidas de la pared interna de las cubiertas del tubo. Añadir 500 l de alcohol etílico anhidro y agitar bien.
  5. Transfiera la mezcla a la columna de adsorción, centrífuga a 12.000 rpm (13.400 x g)durante 2 min.
  6. Añadir 800 l de solución de enjuague a cada columna de adsorción; centrífuga durante 1 min a 12.000 rpm ( 13.400 x g). Coloque las columnas a temperatura ambiente durante unos minutos para secar la solución de enjuague restante.
    NOTA: La solución de enjuague es proporcionada por el fabricante.
  7. Transfiera las columnas de adsorción a otro tubo centrífugo limpio, agregue 50 ml de búfer de elución a la mitad de las películas de adsorción y colóquelas a temperatura ambiente durante 2-5 minutos. Centrífuga 6.200 x g durante 1 min 12.000 rpm (13.400 x g).
    NOTA: El búfer de elución es proporcionado por el fabricante, pero el búfer TE, que contiene 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 0.1 mM EDTA, también puede eluir el ADN.
  8. Almacene la solución de ADN a -20 oC.

3. Verifique la especificidad de las imprimaciones

NOTA: Las especificidades de las especies de las 19 imprimaciones anteriores fueron confirmadas por PCR, que se realizó utilizando polimerasa(Tabla de materiales)e imprimaciones presentadas en la Tabla 1.

  1. Preparar la solución premezclada de 12,5 l de premezcla de PCR 2x(Tabla de materiales),1 l de imprimación de 5' (10 m), 1 l de imprimación de 3' (10 m) y 8,5 l de ddH2O. Preparar la mezcla incluyendo 2 muestras adicionales.
  2. Divida 23 ml de solución premezclada en tubos de microcentrífuga de 0,2 ml, añada 2 l de ADN genómico y tapone cuidadosamente los tubos. A continuación, mezcle y centrifugar ligeramente.
  3. Colocar los tubos de microcentrífuga de 0,2 ml en el ciclo DE PCR y realizar lo siguiente: Desnaturalización: 95 oC para 5 s; Recocido: 60 oC para 30 s; extensión:72 oC para 30 s.
  4. Realice la electroforesis de agarosa de la siguiente manera:
    1. Pesar 1,2 g de agarosa en un matraz que contenga 100 ml de 1x TAE y hervirlo durante 5 minutos en el microondas. Añadir 5 l de tinte de ácido nucleico(Tabla de materiales)en el matraz después de que se enfríe a unos 70 oC. Vierta en el plato a lo largo del borde lentamente, y colóquelo a temperatura ambiente hasta que se solidifique en un gel.
    2. Añadir 5 l de la muestra y la escalera de ADN de 2 registros (0,1–10,0 kb) o el marcador I (0,1–0,6 kb), que contienen 1 l de tampón de carga de ADN 6x, en el gel de agarosa. Luego electroforese a 120 mA hasta que las bandas se separan.
    3. Visualice el gel de agar que contiene fragmentos de ADN con un imágenes ultravioletas.
  5. Realizar electroforesis de agarosa para aislar fragmentos de ADN amplificados de las muestras anteriores, que se visualizaron en un imager ultravioleta. Utilizando el PCR, se identificaron por primera vez las imprimaciones específicas para el ADN genómico porcino amplificado(Figura 2A). Además, se confirmaron ciertas especificidades de las especies de estas imprimaciones que amplificaron específicamente el ADN del cerdo en la cohorte de mono/humano genómico o en la cohorte de ADN genómico de ratón (Figura 2B). Por último, se demostró que dos imprimaciones de especificidades de especies amplifican específicamente el ADN de cerdo en el parche de arteria de cerdo a mono y/o modelos de trasplante de células de cerdo a ratón, respectivamente (Figura 2C)

4. Curva estándar de cpsDNA

  1. Transformar el plásmido pMD19-T que contiene un fragmento de ADN porcino en DH5a, que podría amplificarse específicamente mediante imprimación #4 o imprimación #11 (Tabla 1). Anúlica de bacterias positivas utilizando ampicilina de 50 g/ml.
    Primer #4 en la cohorte humano/mono (adelante: 5-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3o, reverso: 5o-CTTCATTCCATCTCTATAATAAC CCTGT-3o)
    Primer #11 para el modelo de ratón (adelante: 5-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3o, inverso: 5o-TCACATTTGGTCGTCGTTGTC T-3o)
    NOTA: Los detalles de todas las imprimaciones se pueden encontrar en la Tabla 1.
  2. Cosecha los plásmidos anteriores siguiendo el protocolo de abajo.
    1. Aislar una sola colonia de una placa selectiva recién rayada e inocular un cultivo de 1-5 ml de medio LB que contenga el antibiótico selectivo adecuado. Incubar durante 12-16 horas a 37oC con agitación vigorosa (300 rpm).
    2. Centrifugar a 10.000 g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Decantar o aspirar y descartar los medios de cultivo.
    3. Añadir 250 l de solución I/RNase A. Vortex o pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar a fondo. La resuspensión completa del pellet celular es vital para obtener buenos rendimientos.
      NOTA: RNase A debe agregarse a la Solución I antes de su uso.
    4. Transfiera la suspensión a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Agregue 250 l de la solución II. Invierta y gire suavemente el tubo varias veces para obtener un licato claro. Puede ser necesaria una incubación de 2-3 minutos.
      NOTA: Evite la mezcla vigorosa, ya que esto cortará el ADN cromosómico y la pureza del plásmido inferior. No permita que la reacción de la lysis se realice más de 5 minutos.
    5. Agregue 350 l de la solución III. Invertir inmediatamente varias veces hasta que se forme un precipitado blanco floculante.
      NOTA: Es vital que la solución se mezcle a fondo e inmediatamente después de la adición de la Solución III para evitar precipitaciones localizadas.
    6. Centrifugar a velocidad máxima (≥13.000 x g) durante 10 minutos. Se formará un pellet blanco compacto. Continúe rápidamente con el siguiente paso.
    7. Inserte una mini columna de ADN en un tubo de recogida de 2 ml.
    8. Transfiera el sobrenadante despejado de 4.2.7 aspiró cuidadosamente en la mini columna DNA. Tenga cuidado de no molestar el pellet y que no se transfieran restos celulares a la mini columna de ADN.
    9. Centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recogida.
    10. Agregue 500 l de búfer de HBC. Centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto. Deseche el tubo de recogida de filtrado y reutilización.
      NOTA: El búfer HBC debe diluirse con 100% de isopropanol antes de su uso.
    11. Añadir 700 l de Tampón de lavado de ADN. Centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recogida.
      NOTA: DNA Wash Buffer debe diluirse con 100% de etanol antes de su uso.
      1. Opcional: Repita el proceso para un segundo paso de lavado del tampón de lavado de ADN.
    12. Centrifugar la minicolumna de ADN vacía durante 2 minutos a la velocidad máxima para secar la matriz de columna.
      NOTA: Es importante secar la matriz de minicolumna de ADN antes de la elución. El etanol residual puede interferir con las aplicaciones posteriores.
    13. Transfiera la minicolumna dna a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml.
    14. Añadir 30-100 l de tampón de elución o agua estéril desionizada directamente al centro de la membrana de la columna.
      NOTA: La eficiencia de elutar el ADN de la columna DNA Mini depende del pH. Si utiliza agua desionizada estéril, asegúrese de que el pH esté alrededor de 8.5.
    15. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
    16. Centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto.
      NOTA: Esto representa aproximadamente el 70% del ADN enlazado. Una segunda elución opcional producirá cualquier ADN residual, aunque a una concentración más baja.
  3. Verifique los plásmidos anteriores utilizando por doble restricción la digestión enzimática utilizando EcoR I (15 U/L) y Bam H1(15 U/L)22.
    1. Realice los pasos de maquillaje en el hielo. Preparar el sistema de reacción de 1 l de EcoR I (15 U), 1 l de Bam H1 (15 U), 2 l de tampón de 10x, 1 g de plásmido; añadir ddH2O a 20 ml del volumen total, mezclar a fondo. Incubar en un baño de agua a 37oC durante 2 horas.
    2. Separe los productos digeridos por una agarosa al 1% seguido de electroforesis y exponga a la luz UV como antes.
  4. Diluir el plásmido concentrado en 2 x 1011 copias/ml para la solución estándar de arranque utilizando ddH2O. Tomemos el plásmido (P2) que contiene un fragmento de ADN porcino, por ejemplo de copias que calculan:
    1. Calcular el número de plásmidos en 1 ml de la solución estándar de arranque: N á (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol.
    2. Calcular el peso molecular de P2: M a 2810 bp x 650 D/bp a 2810 x 650 D (g/mol).
    3. Calcular la masa de P2: m-N*M(2 x 1011)/ (6.02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
    4. Calcular el volumen de P2: V a m/C a [(2 x 1011)/(6.02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C es la concentración de P2 (ng/l), que se mide mediante un espectrofotómetro).
  5. Diluir la solución estándar de inicio en serie 10 veces en 2 x10 10 copias/ml, 2 x 109 copias/ml, 2 x 108 copias/ml, 2 x 107 copias/ml..., y 2 x 100 copias/ml para solución estándar utilizando ddH2O. Vortex a fondo durante la dilución.
  6. Establezca la curva estándar.
    1. Sistema de reacción de preparación de qPCR (todos los pasos están protegidos de la luz): Añadir la solución premezclada que contiene 325 ml de mezcla qPCR(Tabla de materiales),13 l de imprimación de 5', 13 l de imprimación de 3' y 169 l de ddH2O en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, que luego se mezcló a fondo y centrifó ligeramente.
    2. Divida los 40 ml de la solución premezclada en una tira de 8 tubos y añada 10 ml de ADN estándar de diferentes concentraciones. Tapa con cuidado, mezcle y centrifuga ligeramente.
    3. Coloque la tira de 8 tubos en la máquina qPCR siguiendo el procedimiento que se muestra en la Figura 3.

5. Aislar el ADN circulante de las muestras de sangre

  1. Usando tubos EDTA, recoja muestras de sangre en diferentes puntos de tiempo en los modelos de parches de arteria de cerdo a mono y en los modelos de trasplante de células de cerdo a ratón.
  2. Recoger muestras de sangre de aproximadamente 400 l (de los modelos de parches de arteria de cerdo a mono) o 100 l (de los modelos de trasplante de células de cerdo a ratón) y transferirlos a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Retirar las células sanguíneas de las muestras de sangre por centrifugación a baja temperatura y alta velocidad (3.000 x g,4 oC, 5 min).
  3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y retire los residuos celulares por centrifugación a 16.000 x g durante 10 min.
  4. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Extraiga el ADN circulante del sobrenadante anterior utilizando un kit comercial de extracción de ADN de suero/circulación siguiendo el protocolo 2 del protocolo de los fabricantes de ADN genómico aislante.
  5. Condensar el volumen del ADN circulante a 40 oL y almacenar a -20 oC.

6. Cantidad de ADN específico de cerdo circulante

  1. Preparar la solución premezclada de 25 l de mezcla qPCR(tabla de materiales),1 l de imprimación de 5', 1 l de imprimación de 3', 10 ml de ADN de muestra y 13 ml de ddH2O. Prepare la mezcla incluyendo 2 muestras adicionales.
  2. Divida la solución premezclada de 40 ml en una tira de 8 tubos y agregue 10 ml de ADN de muestra, seguido de un tapado cuidadoso. Prepare dos reacciones más de las necesarias.
  3. Coloque la tira de 8 tubos en la máquina qPCR siguiendo el mismo procedimiento que la curva estándar. Es mejor ejecutar un estándar primero para asegurarse de que la reacción es crítica para la cuantificación de antemano. El procedimiento del sistema de reacción de qPCR se mostró en la Figura 3.

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Resultados

En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos, y se establecieron curvas estándar para la cuantificación (Figura 4). Las especificidades de las especies de los 19 cebadores fueron confirmadas por la PCR. Las imprimaciones específicas de las especies (primer #4 y primer #11) se utilizaron entonces para cuantificar cpsDNA por qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ra...

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Discusión

La cuantificación del ADN circulante porcino representa un enfoque factible para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante. 24 encontraron que el contenido de ADN circulante derivado de donantes (ddcfDNA) en la sangre de pacientes con rechazo agudo era significativamente mayor que el de los pacientes sin rechazo. Estos estudios sugieren que el ddcfDNA puede ser un biomarcador común para monitorear el daño del injerto de órganos. En los últimos años, qPCR se ha aplicado cada vez más al anális...

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Divulgaciones

Los autores no reportan conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de I+D clave de China (2017YFC1103704), Fundación de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JCYJ20170817172116272), Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en Guang Provincia dedong (2019), Sanming Project of Medicine en Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgaroseBiowest, Barcelona, España111860
BamHI-HFNew England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EE. UUR3136S Tubo de
1,5 mLAxygen  Biosciences, Union City, CA, EE. UU.MCT-150-C
tubo de PCR de 0,2 mLAxygen  Biociencias, Union City, CA, EE. UUPCR-02-C
C57BL / 6 CentroMédico de Animales para Ratones de la provincia de Guangdong,  China8 ~ 10 semanas
CentrífugaThermo  Pescador  Scientific, Walt- ham, MA, EE. UU.Micro 21R
2-Log DNA LadderNew England Biolabs, Ipswich, Mass, USAN3200S0.1– 10.0 kb
Marcador I Tiangen, Pekín, ChinaMD101-020.1– 0.6 kb
Mini columna de ADN (HiBind DNA Mini Columns)Omega Bio-tek, Norcross, GA, EE. UUTampón de carga de ADN DNACOL-01
Solarbio, Pekín, ChinaD1010
E.Z.N.A.Mini kit de ADN plasmídico I y E.Z.N.A. Mini kit de ADN plásmido IIOmega Bio-tek, Norcross, GA, EE. UUD6942
D6943
EcoR ITakara  Bio, Shiga, Japón  1040S
Hembra Bama mini cerdosBGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China2 ~ 4 meses
Kit de extracción de ADN genómico ?Tiangen, Pekín, ChinaDP304-02
SYBR Verde Tiempo Real PCR Master MixToyobo, Osaka, JapónQPK-201
Gel Doc XRBio-Rad, Hércules, EE. UU.
Monos cynomolgus machosGuangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China8 años
Tinte de ácido nucleico (Gelred)Biotium, Fremont, EE. UU42003
polimerasa (Premix Taq)Takara  Bio, Shiga, JapónRR901A
pMD19-T plásmidoTakara  Bio, Shiga, JapónD102A
Máquina qPCRQSDx de Applied Biosystems, Waltham, EE. UU.
Suero/Kit de extracción de ADN circulanteTiangen, Pekín, ChinaDP339
TAEsangon Biotech, Shanghai, ChinaB548101
. microcentrífuga de . . . .

Referencias

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