Cuantificación del ADN específico de la porcino circulante en la sangre de un modelo de trasplante

Resumen

En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Utilizando imprimaciones específicas de especies, cpsDNA fue cuantificado por qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono.

Resumen

La xenotrasplante es un método factible para tratar la insuficiencia orgánica. Sin embargo, cómo controlar eficazmente el rechazo inmune del xenotrasplante es un problema para los médicos e investigadores. Este manuscrito describe un método simple y eficaz para monitorear el rechazo inmune en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono. El ADN circulante es un biomarcador potencialmente no invasivo para el daño a los órganos. En este estudio, el ADN específico del cerdo circulante (cpsDNA) fue monitoreado durante el rechazo del xenoinjerto por PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR). En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Las imprimaciones específicas de las especies se utilizaron entonces para cuantificar cpsDNA mediante qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono. El valor de este método sugiere que se puede utilizar como un método simple, conveniente, de bajo costo y menos invasivo para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante.

Introducción

La insuficiencia orgánica es una de las principales causas de muerte¹. El trasplante de células, tejidos y órganos es una forma eficaz de tratar la insuficiencia orgánica². Sin embargo, la escasez de órganos donantes limita la aplicación clínica de este método^3,4. Los estudios han demostrado que los cerdos pueden ser utilizados como una fuente potencial de órganos humanos para el trasplante clínico^5,6. Sin embargo, el trasplante de órganos entre especies se enfrenta a un rechazo inmune peligroso. Por lo t....

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la Junta de Revisión Institucional del Hospital del Segundo Pueblo de Shenzhen, Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Shenzhen.

1. Diseñar imprimaciones específicas porcinas

1. Realizar análisis BLAST del genoma completo para identificar genes específicos porcinos que eran diferentes de los de los seres humanos, monos o ratón, utilizando el software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2. Diseñar imprimaciones según 19 genes específicos del cerdo (Tabla 1) utilizando el software de Primer 5.

Resultados

En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos, y se establecieron curvas estándar para la cuantificación (Figura 4). Las especificidades de las especies de los 19 cebadores fueron confirmadas por la PCR. Las imprimaciones específicas de las especies (primer #4 y primer #11) se utilizaron entonces para cuantificar cpsDNA por qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ra.......

Discusión

La cuantificación del ADN circulante porcino representa un enfoque factible para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante. ²⁴ encontraron que el contenido de ADN circulante derivado de donantes (ddcfDNA) en la sangre de pacientes con rechazo agudo era significativamente mayor que el de los pacientes sin rechazo. Estos estudios sugieren que el ddcfDNA puede ser un biomarcador común para monitorear el daño del injerto de órganos. En los últimos años, qPCR se ha aplicado cada vez más al anális.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarose	Biowest, Barcelona, España	111860
BamHI-HF	New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EE. UU	R3136S Tubo de
1,5 mL	Axygen  Biosciences, Union City, CA, EE. UU.	MCT-150-C
tubo de PCR de 0,2 mL	Axygen  Biociencias, Union City, CA, EE. UU	PCR-02-C
C57BL / 6 Centro	Médico de Animales para Ratones de la provincia de Guangdong,  China		8 ~ 10 semanas
Centrífuga	Thermo  Pescador  Scientific, Walt- ham, MA, EE. UU.	Micro 21R
2-Log DNA Ladder	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	N3200S	0.1– 10.0 kb
Marcador I	Tiangen, Pekín, China	MD101-02	0.1– 0.6 kb
Mini columna de ADN (HiBind DNA Mini Columns)	Omega Bio-tek, Norcross, GA, EE. UU	Tampón de carga de ADN DNACOL-01
	Solarbio, Pekín, China	D1010
E.Z.N.A.Mini kit de ADN plasmídico I y E.Z.N.A. Mini kit de ADN plásmido II	Omega Bio-tek, Norcross, GA, EE. UU	D6942
D6943
EcoR I	Takara  Bio, Shiga, Japón	1040S
Hembra Bama mini cerdos	BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China		2 ~ 4 meses
Kit de extracción de ADN genómico ?	Tiangen, Pekín, China	DP304-02
SYBR Verde Tiempo Real PCR Master Mix	Toyobo, Osaka, Japón	QPK-201
Gel Doc XR	Bio-Rad, Hércules, EE. UU.
Monos cynomolgus machos	Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China		8 años
Tinte de ácido nucleico (Gelred)	Biotium, Fremont, EE. UU	42003
polimerasa (Premix Taq)	Takara  Bio, Shiga, Japón	RR901A
pMD19-T plásmido	Takara  Bio, Shiga, Japón	D102A
Máquina qPCR	QSDx de Applied Biosystems, Waltham, EE. UU.
Suero/Kit de extracción de ADN circulante	Tiangen, Pekín, China	DP339
TAE	sangon Biotech, Shanghai, China	B548101

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