FLIM-FRET Mediciones de interacciones proteína-proteína en bacterias vivas.

Resumen

Aquí describimos un protocolo para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas muy diferentes en Pseudomonas aeruginosa viva utilizando mediciones FLIM-FRET. El protocolo incluye construcciones de cepas de bacterias, inmovilización de bacterias, imágenes y rutinas de análisis de datos post-imágenes.

Resumen

Las interacciones proteína-proteína (IPP) controlan varios procesos clave en las células. La microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) combinada con la transferencia de energía por resonancia de F.R. (FRET) proporciona información precisa sobre los IBP en células vivas. FLIM-FRET se basa en la medición de la descomposición de por vida de la fluorescencia de un donante FRET en cada píxel de la imagen FLIM, proporcionando información cuantitativa y precisa sobre los IBP y sus organizaciones celulares espaciales. Proponemos aquí un protocolo detallado para las mediciones FLIM-FRET que aplicamos para monitorear los IBP en Pseudomonas aeruginosa en vivo en el caso particular de dos proteínas que interactúan expresadas con números de copia muy diferentes para demostrar la calidad y robustez de la técnica para revelar características críticas de los IBP. Este protocolo describe en detalle todos los pasos necesarios para la caracterización de PPI, desde construcciones mutantes bacterianas hasta el análisis final utilizando herramientas desarrolladas recientemente que proporcionan posibilidades de visualización avanzadas para una interpretación directa de datos complejos de FLIM-FRET.

Introducción

Las interacciones proteína-proteína (IPP) controlan varios procesos clave en las células¹. Las funciones de los IBP difieren en función de la composición de proteínas, las funciones de afinidades y las ubicaciones en las células^2. Los IBP se pueden investigar a través de diferentes técnicas^3. Por ejemplo, la co-inmunoprecipitación es una herramienta relativamente simple, robusta y económica de uso común para identificar o confirmar los IBP. Sin embargo, estudiar los IBP puede ser difícil cuando las proteínas que interactúan tienen niveles de expresión bajos o cuando las interacciones son transitor....

Protocolo

1. Construcción de Plásmido

1. Amplificar por dos PCR (PCR1 y 3) las secuencias de ADN (utilizar ADN genómico de P. aeruginosa PAO1) de los 700 pares base aguas arriba y aguas abajo de las regiones correspondientes al sitio de inserción en el genoma de P. aeruginosa con polimerasa de ADN de alta fidelidad. Agregue sitios de restricción a los imprimadores en azul y verde y agregue una secuencia superpuesta con mCherry a los imprimadores en rojo (Figura 2).
   1. Para PvdA etiquetado en el C-terminus con eGFP, amplificar la región de 700 bp aguas arriba en relación con el codón de parada por los imprimadores en az....

Resultados

Las funciones de distribución acumulativa empírica (ecdf) de la vida útil de la fluorescencia medidas para las diferentes cepas bacterianas se muestran en la Figura 8. Si se produce FRET, los ecdfs se desplazan hacia la vida útil más corta(Figura 8A,8B). Tenga en cuenta que cuando la interacción de las dos proteínas da como resultado una larga distancia entre los dos fluoróforos, no puede ocurrir fret (Figura 8C). E.......

Discusión

FLIM-FRET ofrece algunas ventajas clave sobre las imágenes FRET basadas en la intensidad. La vida útil de la fluorescencia es un parámetro intrínseco del fluoróforo. Como consecuencia, no depende de las concentraciones locales de fluoróforos ni de la intensidad de la excitación de la luz. La vida útil de la fluorescencia también se ve mal afectada por el foto-blanqueo. Es particularmente interesante evidenciar IBP en células donde las concentraciones de proteínas locales pueden ser altamente heterogéneas en todos los com.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de paso de banda de 525/50 nm	F37-516, AHF, Alemania
Filtro de paso corto de 680 nm	F75-680, AHF, Alemania
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539
Sulfato de amonio (NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418
ADN polimerasa DreamTaq 5U/μ L	ThermoFisher Scientific	EP0714
E. coli TOP10	Invitrogen	C404010
Fotodiodo de avalancha acoplado a fibra	SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Cubreobjetos de vidrio (Espesor No. 1.5, 20×	Vidrio Knitel	MS0011
polimerasa de alta fidelidad Phusion 2U/μ L	ThermoFisher Scientific	F530S
Caldo de lisogén (LB)	Millipore	1.10285
Sulfato de magnesio Heptahidratado (MgSO4 . 7H2O)	Sigma-Aldrich	10034-99-8
Portaobjetos de microscopio (25 veces; 75mm)	Vidrio Knitel	MS0057
NucleoSpin Gel y PCR Limpieza	Macherey-Nagel	740609.50
NucleoSpin Plásmido	Macherey-Nagel	740588.10
Fosfato de Potasio Dibásico (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	RES20765
Fosfato de Potasio Monobásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Sodio Succinato (disodio)	Sigma-Aldrich	14160
SPCImage, software SPCM	Becker & Hickl
Asa de inoculación estéril	Nunc	7648-1PAK
T4 ADN ligasa 1U/μ L ThermoFisher	Scientific	15224017
módulo TCSPC	SPC830, Becker & Hickl, Alemania
Ti:Láser de zafiro	Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubos 50mL	Falcon	352070

de 20 mm ADN