FLIM-FRET Mediciones de interacciones proteína-proteína en bacterias vivas.
25 de agosto de 2020
Aquí describimos un protocolo para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas muy diferentes en Pseudomonas aeruginosa viva utilizando mediciones FLIM-FRET. El protocolo incluye construcciones de cepas de bacterias, inmovilización de bacterias, imágenes y rutinas de análisis de datos post-imágenes.
FILM-FRET es una potente técnica que permite confirmar sospechas o predichas interacciones proteína-proteína. En este protocolo, presentamos una forma de analizar datos en casos particulares de cantidades de donantes y aceptantes desequilibradas. FILM-FRET es capaz de proporcionar información sobre las interacciones proteína-proteína directamente en células vivas.
Es importante investigar las interacciones personales-proteínas en el entorno celular nativo, en particular cuando la proteína fluorescente se expresa en el nivel endógeno. Comience por el crecimiento de P.aeruginosa, E.coli TOP10, y E.coli bacterias auxiliares cada uno en cinco mililitros de LB sin antibióticos a 30 grados Celsius mientras se agita durante la noche. Al día siguiente, mida la densidad óptica de los cultivos y mezcle una cantidad igual de P.aeruginosa, E.coli TOP10 y E.coli ayudante en un microtubo de 1,5 mililitros.
Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 9,300 veces G para peletizar las bacterias, luego desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 microlitros de LB. Pída una mancha de la mezcla en el agar LB precalentado y incuba durante cinco horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, raspar el punto con un lazo de inoculación estéril y resuspenderlo en un mililitro de LB. Placa 100 microlitros de esta suspensión bacteriana en agar LB que contiene 10 microgramos por mililitrolitor cloramphenicol y 30 microgramos por mililitro gentamicina e incubar dos días a 37 grados Celsius para eliminar las bacterias auxiliares E.coli TOP10 y E.coli. Resuspender una colonia en un mililitro de LB e incubarlo a 37 grados Celsius con temblor orbital durante cuatro horas, luego centrifugar el tubo durante tres minutos a 9.300 veces G y desechar 950 microlitros de sobrenadante.
Resuspender el pellet en 50 microlitros de LB y aislar la mezcla en agar LB que contiene sacarosa y sin cloruro de sodio. Incubar la placa durante la noche a 30 grados centígrados. Detectar colonias aisladas en el agar LB y el agar LB que contiene 15 miligramos por mililitro gentamicina con el fin de comprobar la sensibilidad a la gentamicina.
Coloque un portaobjetos de vidrio de microscopio sobre una superficie horizontal plana y coloque dos diapositivas de vidrio rematadas con dos capas de cinta adhesiva a su alrededor. Pipetear una gota de 70 microlitros de 1% de agarosa fundida en el tobogán de vidrio y colocar una cuarta diapositiva en la parte superior para aplanar la gota de agarosa. Presione suavemente durante aproximadamente un minuto.
Quítese el portaobjetos superior y deje caer alrededor de tres microlitros de bacterias en tres a cuatro puntos en diferentes lugares de la almohadilla de agarosa. Cubra la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos de vidrio de microscopía y fíjela con parafina fundida para sellándola en el portaobjetos de vidrio comenzando con las cuatro esquinas. Coloque la diapositiva de la microscopía en el escenario con el cubreobjetos mirando hacia el objetivo.
Gire la torreta del cubo del filtro para seleccionar el cubo eGFP y abra el obturador de la lámpara de fluorescencia, luego envíe la luz de fluorescencia hacia el ocular del microscopio. Enfoque el objetivo en las bacterias utilizando la perilla del microscopio. Seleccione una región de interés en la muestra utilizando el joystick que controla la etapa motorizada.
Envíe la ruta de emisión de fluorescencia hacia el detector, luego gire la torreta del cubo del filtro para seleccionar el cubo dicroico para el láser de 930 nanómetros y establezca la potencia del láser en 20 milivatios. Establezca el tamaño de la región de interés en 30 micrómetros que ajuste la tensión que opera los espejos galvo y define el rango de sus movimientos. Encienda el detector y comience a escanear la muestra.
Elija el campo de visión de la imagen moviendo con firmez el escenario desde la interfaz del ordenador. Esto se puede hacer en la configuración moviendo la cruz en la imagen en el software de control del microscopio que definirá el nuevo centro de la imagen y presionando la etapa de movimiento. Un buen campo de visión para la adquisición debe contener de 10 a 30 bacterias inmóviles, todas enfocadas.
Si está interesado en extraer datos film-FRET de células individuales, asegúrese de que las bacterias estén bien individualizadas. Abra el software de imágenes y compruebe que la tasa de recuento de fotones no es demasiado alta para evitar un efecto de acumulación que puede influir en las mediciones de por vida. Si es necesario, reduzca la intensidad del láser para mantener la tasa de recuento de fotones baja.
Ajuste los parámetros de adquisición, incluido el tiempo de recogida de la adquisición. Pulse el botón de inicio y espere a que finalice la adquisición. Para analizar los datos, abra RStudio y cree un nuevo proyecto.
Cree una nueva carpeta en la carpeta principal del proyecto y asígnele el nombre data y, a continuación, mueva todos los archivos de solicitud de análisis a esta carpeta. Abra un nuevo archivo de script o el script complementario flim_analysis.r. Instale el paquete FlimDiagRam dedicado para el análisis de datos de película y llame al paquete en el área de trabajo.
Aquí se muestran las funciones de distribución acumulativa empírica de la vida útil de la fluorescencia medida para las diferentes cepas bacterianas. Si se produce FRET, las funciones se desplazan hacia las vidas más cortas. Es importante tener en cuenta que el FRET no puede ocurrir cuando la interacción de las dos proteínas resulta en una larga distancia entre los dos fluróforos, que no se pueden distinguir de la ausencia de interacción.
Por lo tanto, puede ser necesario etiquetar las proteínas en diferentes posiciones para maximizar las posibilidades de sondear la interacción. Debido a la gran diferencia en las expresiones proteicas entre PvdA y PvdL, el mismo complejo no da lugar a datos FILM-FRET similares. Las estequiometrías desequilibradas conducen a diferencias en la contribución de los libres en comparación con las proteínas etiquetadas por donantes en la distribución de por vida de fluorescencia registrada.
La gráfica de diagrama se puede utilizar para proporcionar información crítica sobre la estequiometría. En el mutante PvdA-eGFP mCherry-PvdL, la cantidad de PvdA con etiqueta de donante es mucho mayor que la cantidad de mCherry-PvdL. Entre todos los donantes presentes en la muestra, sólo unos pocos de ellos están interactuando con PvdL.
El único valor tau centrado en aproximadamente 2,3 nanosegundos sugiere que cada donante PvdA-eGFP solo puede transferirse con un aceptador mCherry-PvdL. Cuando se invierte el etiquetado, se espera que la mayoría de las proteínas eGFP-PvdL interactúen con PvdA-mCherry, lo que se confirma por los valores alfa uno más altos. Los valores tau uno se volvieron más distribuidos, lo que sugiere que múltiples proteínas JcdA pueden unirse a una sola proteína JcdL.
La configuración de FLIM está disponible en un número cada vez mayor de instalaciones de imágenes. Las muestras de imágenes en un FILM-FRET no son más complicadas que las imágenes en microscopía de vídeo.
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Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para caracterizar interacciones proteína-proteína en Pseudomonas aeruginosa vivo mediante mediciones de FLIM-FRET. El enfoque se centra en analizar las interacciones entre dos proteínas expresadas a niveles significativamente diferentes dentro del entorno celular nativo.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Interacciones proteína-proteína
- Imagen en células vivas
- Técnicas de biología molecular
Antecedentes
- La necesidad de estudiar las interacciones proteicas en contextos celulares nativos.
- FLIM-FRET como un método avanzado para investigar estas interacciones.
- Desafíos en el análisis de proporciones desiguales de proteínas donadoras y aceptoras.
Métodos Utilizados
- Mediciones de FLIM-FRET
- Pseudomonas aeruginosa como organismo modelo biológico
- Adquisición y análisis de datos mediante microscopía y RStudio
Resultados principales
- Se demostró la identificación exitosa de interacciones proteicas en células vivas.
- Se estableció que las diferencias en los niveles de expresión proteica pueden afectar la eficiencia de FRET.
- Se obtuvieron conocimientos sobre la estequiometría de las proteínas y sus interacciones.
Conclusiones
- El estudio valida el uso de FLIM-FRET para investigar interacciones proteicas en sistemas vivos.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de las interacciones moleculares cruciales para los procesos celulares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
FLIM-FRET permite la evaluación cuantitativa de interacciones proteína-proteína en sistemas bacterianos vivos, proporcionando información mecanicista esencial para la validación de objetivos en el descubrimiento de antimicrobianos. Al medir la descomposición del tiempo de vida de fluorescencia con resolución a nivel de célula individual, la técnica contribuye a reducir los riesgos de hipótesis terapéuticas que involucran interacciones proteína-proteína en modelos patógenos como Pseudomonas aeruginosa. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al revelar características espaciales y estequiométricas de las interacciones bajo condiciones nativas de expresión.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la confirmación de interacciones proteína-proteína sospechadas en células vivas con niveles de expresión proteica nativos.
- Valor operativo: Proporciona datos cuantitativos y resueltos espacialmente sobre la eficiencia de interacción, independientes de artefactos de concentración.
- Valor predictivo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la observación directa de la dinámica de interacciones en modelos de patógenos relevantes.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera distribuciones robustas de tiempos de vida de fluorescencia que distinguen interacciones específicas de colisiones aleatorias.
- Valor operativo: Permite la estandarización de ensayos de interacciones proteína-proteína mediante lecturas de microscopía de vida de fluorescencia (FLIM), menos susceptibles a artefactos basados en intensidad.
- Escalabilidad: Compatible con instalaciones de microscopía que adoptan cada vez más la FLIM, lo que favorece la implementación más amplia de ensayos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica al confirmar las interacciones proteína-proteína (PPI) en contextos bacterianos patógenos vivos.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Aclara si las interacciones proteína-proteína observadas ocurren a distancias biológicamente relevantes, evitando falsos positivos derivados de una mera co-localización.
- Conocimiento de la Estequiometría: Revela las proporciones de unión (por ejemplo, 1:1 o múltiples donadores por aceptor), fundamentales para modelar estrategias de inhibición.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
FLIM-FRET se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos iniciales, especialmente para programas antimicrobianos que requieren la validación de interacciones proteína-proteína (PPI) en entornos nativos de patógenos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación basada en hipótesis de interacciones proteína-proteína al proporcionar evidencia directa de la interacción en células vivas bajo expresión casi fisiológica.
- Preparación del Ensayo: Proporciona mediciones cuantitativas de tiempo de vida útil que permiten comparaciones entre mutantes, condiciones o perturbaciones terapéuticas.
- Resultados Analíticos: Genera funciones empíricas de distribución acumulativa y parámetros tau/alfa para una puntuación objetiva de la interacción.
- Relevancia Traducional: Mantiene la continuidad desde las predicciones de interacción in vitro hasta la confirmación en Pseudomonas aeruginosa vivo, un modelo para infecciones persistentes.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo transferible de imagen y análisis aplicable a diferentes cepas bacterianas y pares de proteínas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al distinguir interacciones verdaderas de proteínas (PPI) de artefactos por superposición espectral o sobreexpresión.
- Valor operativo: Promueve la reproducibilidad mediante métricas basadas en tiempos de vida, resistentes a variaciones en la intensidad de excitación o en la concentración del fluoróforo.
- Valor estratégico: Orienta decisiones de continuar o descartar al validar la interacción con el blanco en modelos patogénicos antes del cribado de compuestos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en interacciones proteína-proteína confirmadas y cuantificables en sistemas relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia, operación de hardware de FLIM y manejo de detectores de conteo de fotones.
- Depende del acceso a sistemas con capacidad de FLIM y fuentes láser estables (por ejemplo, 930 nm) para una excitación controlada.
- Necesita una preparación estandarizada de muestras para garantizar la inmovilización bacteriana y una calidad constante de las placas de agarosa.
- Implica la adaptación de estrategias de marcado para acomodar las grandes diferencias de expresión entre proteínas que interactúan.
- Exige una optimización cuidadosa de la potencia del láser y del tiempo de adquisición para evitar la acumulación de fotones, manteniendo al mismo tiempo una señal suficiente para el ajuste del tiempo de vida.
