Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Resumen

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Resumen

La secuenciación de Transposon (Tn-seq) es un método potente que combina la mutagénesis transposon y la secuenciación paralela masiva para identificar genes y vías que contribuyen a la aptitud bacteriana bajo una amplia gama de condiciones ambientales. Las aplicaciones de Tn-seq son extensas y no sólo han permitido examinar las relaciones genotipo-fenotipo a nivel de organismo, sino también a nivel de población, comunidad y sistemas. Las bacterias gramnegativas están altamente asociadas con fenotipos de resistencia a los antimicrobianos, lo que ha aumentado los incidentes de fracaso del tratamiento con antibióticos. La resistencia a los antimicrobianos se define como crecimiento bacteriano en presencia de antibióticos letales. La colistina antimicrobiana de "última línea" se utiliza para tratar las infecciones bacterianas Gram-negativas. Sin embargo, varios patógenos Gram-negativos, incluyendo Acinetobacter baumannii pueden desarrollar resistencia a la colistina a través de una gama de mecanismos moleculares, algunos de los cuales se caracterizaron usando Tn-seq. Además, las vías de transducción de señales que regulan la resistencia a la colistina varían dentro de las bacterias Gram-negativas. Aquí proponemos un método eficiente de mutagénesis transposon en A. baumannii que agiliza la generación de una biblioteca de inserción de transposon saturante y la construcción de la biblioteca de amplicon eliminando la necesidad de enzimas de restricción, ligadura de adaptador y purificación de gel. Los métodos descritos en este documento permitirán un análisis en profundidad de los determinantes moleculares que contribuyen a la aptitud de A. baumannii cuando se enfrentan al desafío con colistina. El protocolo también es aplicable a otros patógenos GRAM-negativos ESKAPE, que se asocian principalmente con infecciones adquiridas en hospitales resistentes a losmedicamentos.

Introducción

El descubrimiento de antibióticos es sin duda uno de los eventos más impactantes relacionados con la salud^del siglo XX. Los antibióticos no solo resuelven rápidamente las infecciones bacterianas graves, sino que también desempeñan un papel fundamental en la medicina moderna. Las cirugías mayores, los trasplantes y los avances en la medicina neonatal y la quimioterapia dejan a los pacientes susceptibles a infecciones potencialmente mortales y estas terapias no serían posibles sin antibióticos^1,2. Sin embargo, el rápido desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos entre los patógen....

Protocolo

1. Preparación de tensión bacteriana

1. Rayar la cepa "donante" (E. coli MFD DAP^-/pJNW684, Tabla de materiales) para colonias aisladas en agar Luria-Bertani complementado con 600 M de ácido diaminopélico (DAP), 100 mg/L de ampicilina y 25 mg/L de kanamicina. Incubar durante la noche a 37oC. Utilizando una sola colonia aislada, inocular 50 ml de caldo de Luria (LB) complementado con DAP de 600 m, 100 mg/L de ampicilina y 25 mg/L de kanamicina en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y etiquetarlo como "donante".
2. Rayar la cepa "receptora" (A. baumannii cepa ATCC 17978, Tabla de materiales) para co....

Resultados

Los métodos descritos describen la generación de una biblioteca transposon de alta densidad en la cepa A. baumannii ATCC 17978 a través de la conjugación bacteriana utilizando E. coli MFD DAP^-, que replica el plásmido pJNW684 (Figura 4B). El protocolo detallado utiliza la conjugación bacteriana bi-parental para la transferencia de pJNW684 de la cepa de donante E. coli ápir+ a la cepa receptora de A. baumannii. Este es un método eficie.......

Discusión

A. baumannii es una amenaza emergente para la salud pública mundial debido a la rápida adquisición de AMR contra las terapias de "última línea", como la colistina^{10,,11,12,23,24,30,31}. En las últimas décadas, Tn-seq ha desempeñado un papel fundamental en el esclarecer las interaccio.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 mM ddCTP, 2',3'-Didesoxicitidina-5'-Trifosfato	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2'-Desoxicitidina-5'-Trifosfato	Invitrogen	10217-016
100bp Escalera de ADN Marcador de Peso Molecular	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Placas	de Petri Corning	351029
Placas de Petri de 150 mm x 15 mm	Corning	351058
1X B& W	N/A	N/A	Diluido 2X B& W a la mitad para obtener 1X B&N.
El ácido 2,6-diaminopimélico	Alfa Aesar	B2239103	utiliza en 600 y micro; M
2X B& W	N/A	N/A	Agregue 2 M de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7.5) en agua. Se utiliza con perlas de estreptavidina. Las soluciones se mantienen a temperatura ambiente.
Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 50 ml	Fisher Scientific	12-565-271
9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP	N/A	N/A	9,5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85,5 ml de agua. Almacene a -20 ° C.
AccuPrimeTM Pfx ADN polimerasa	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicilina (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	utilizado a 100 mg/L
Sistema de purificación de PCR AMPure XP	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer Análisis de ADN de alta sensibilidad	Agilent	5067-4626
Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Rack magnético	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-N	/A	N/A	DAP Auxotroph, requiere 600 mM de DAP añadidos exógenamente para crecer. Contiene maquinaria RP4 para la transferencia de plásmidos. Portador para JNW68 (36).
Etanol	Fisher Scientific	A4094
Viales criogénicos roscados externamente	Corning	09-761-71
Perlas de vidrio	Corning	72684
Glicerol	Fisher Scientific	G33
Asas de inoculación	Fisher Scientific	22-363-602	Herramienta de raspado
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	utilizado a 25 mg/L
de agar LB,	Fisher Scientific	BP1425
LB, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Añadir 3 mM de Tris-HCl, 0,2 mM de EDTA (pH 7,5) en agua. Se utiliza con perlas de estreptavidina. Las soluciones se mantienen a temperatura ambiente.
Tampón de lisis	N/A	N/A	9,34 mL Tampón TE; 600 ml de SDS al 10%; 60 ml de proteinasa K (20 mg/mL)
Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (mezcla 25:24:1, pH 6,7/8,0, Liq.)	Solución	con BP1752I
fosfato de Fisher Scientific, solución 10X	Fisher Scientific	BP39920	diluida a 1X
Qubit 4 Fluorímetro	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Thermo	Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Kit de ensayo	Thermo Fisher	Q32851
con refrigeración baño de agua	Qsonica Sonicators Q2000FCE
Estreptavidina Perlas	magnéticas New England Biolabs (NEB)	S1420S
Tampón TE	/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Desoxinucleotidil transferasa terminal (rTdt)	Promega	PR-M1875

caldo Miller salina tamponada N