Modelo de cicatrización de heridas excisionales de Murine y análisis de heridas morfométricas histológicas

Resumen

Este protocolo describe cómo generar heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones y cómo monitorear, cosechar y preparar las heridas para el análisis morfométrico. Se incluye una descripción detallada de cómo utilizar secciones histológicas seriales para definir, cuantificar y detectar defectos morfométricos con precisión.

Resumen

El modelo de heridas escisionales murinas se ha utilizado ampliamente para estudiar cada una de las fases secuencialmente superpuestas de la cicatrización de heridas: inflamación, proliferación y remodelación. Las heridas murinas tienen un lecho de heridas histológicamente bien definido y fácilmente reconocible sobre el cual estas diferentes fases del proceso de curación son medibles. Dentro del campo, es común utilizar un "medio" definido arbitrariamente de la herida para análisis histológicos. Sin embargo, las heridas son una entidad tridimensional y a menudo no es histológicamente simétricas, lo que apoya la necesidad de un método de cuantificación bien definido y robusto para detectar defectos morfométricos con un tamaño de efecto pequeño. En este protocolo, describimos el procedimiento para crear heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones, así como una instrucción detallada sobre cómo medir parámetros morfométricos utilizando un programa de procesamiento de imágenes en secciones seriales selectas. Las mediciones de dos dimensiones de la longitud de la herida, la longitud epidérmica, el área epidérmica y el área de la herida se utilizan en combinación con la distancia conocida entre las secciones para extrapolar el área epidérmica de tres dimensiones que cubre la herida, el área general de la herida, el volumen epidérmico y el volumen de la herida. Aunque este análisis histológico detallado consume más tiempo y recursos que los análisis convencionales, su rigor aumenta la probabilidad de detectar nuevos fenotipos en un proceso de cicatrización de heridas inherentemente complejo.

Introducción

La cicatrización de heridas cutáneas es un proceso biológico complejo con fases que se superponen secuencialmente. Requiere la coordinación de procesos celulares y moleculares que están regulados temporal y espacialmente para restaurar la función de barrera del epitelio dañado. En la primera fase, la inflamación, los neutrófilos y los macrófagos migran a la herida, movilizando las defensas locales y sistémicas^1. Seguir y superponer la fase inflamatoria es la etapa de proliferación. Los fibroblastos comienzan a proliferar y migrar rápidamente al tejido de granulación. Los queratinocitos alejados del borde delantero proliferan direccionalmente ha....

Protocolo

Todos los experimentos se completaron de acuerdo con las regulaciones federales y la política y los procedimientos de la Universidad de Iowa han sido aprobados por la Universidad de Iowa IACUC.

1. Animales y cría

1. Utilice ratones adultos de la línea de ratón deseada a las 8-10 semanas de edad cuando la etapa del folículo piloso esté en telógeno.
2. El día de la cirugía, separe los ratones en jaulas limpias y haga una casa individual para minimizar la interrupción de la herida.

2. Cirugía

NOTA: No es necesario mantener condiciones quirúrgicas estériles. Si bien se de....

Resultados

La Figura 5 representa el rango en valores medidos y calculados obtenidos mediante la realización de análisis morfométricos en heridas de tipo salvaje generadas en diferentes cepas de ratón por múltiples cirujanos y analizadas por diferentes individuos. Los ratones de tipo salvaje de diferentes cepas pueden mostrar diferencias estadísticas como se describe tanto en nuestros estudios como en la literatura^9,10. Sobre la base de estos r.......

Discusión

El modelo bilateral de heridas por escisión es un procedimiento altamente personalizable que se puede utilizar para estudiar muchos aspectos diferentes de la cicatrización de heridas. Antes de comenzar un proyecto de cicatrización de heridas, los investigadores deben realizar un análisis de potencia para determinar el número de heridas necesarias para detectar un defecto de un tamaño de efecto particular. Existen incoherencias en la literatura sobre si los ratones individuales o las heridas deben utilizarse como réplicas.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100% etanol
70% etanol
80% etanol
95% etanol
Preparación de alcohol	NOVAPLUS	V9100	70% Alcohol isopropílico, estéril
Hidróxido
Almohadillas de biopsia	Cellpath	22-222-012
Lámina			Algo firme pero manipulable del tamaño de una hoja de papel
Microscopio			Con capacidad de adquisición digital y un objetivo 4X
Aplicadores
Cubreobjetos			22 x 60 #1
Hojas
de cera dentalCámara			Incluya una regla para la escala, si corresponde
Aguja de disección (recta)
Moldes de			22 x 22 x 12
Anillos de inclusión	Simport Scientific Inc.	M460
Eosina Y
Ácido
Cortapete
de pelo Almohadilla térmica	Conair		Almohadilla térmica seca
y húmeda Hematoxilina
Microtomo
Cuchillas de micrótomo
Pinceles Parafina
Tipo 6
Paraformaldehído
fosfato (PBS)
Povidona-yodo	Aplicare	82-255
		M490-2
Hojas de afeitar	ASR.009
Hojas de bisturí de servicio regular #10
Mango
Tijeras quirúrgicas afiladas estériles			para cirugía
Punzones de biopsia			Tamaño determinado por el investigador
Cajas
Calentadores de
Portaobjetos de microscopio superesmerilados	Fisher Scientific	22 037 246
			agua con control de temperatura
Estación			de inclusión de tejidos Mínimo de un dispensador de parafina y una placa fría
Procesador			de tejidos Mínimo de un horno con bomba de vacío
Triple antibiótico pinzas de ungüento
, de punta			estéril para cirugía
pinzas, de punta			estéril para cirugía
WypAll X60	Kimberly-Clark	34865

de amonio de plástico negro de campo claro con punta de algodón digital inclusión acético glacial Permount Solución tampón de Casete de procesamiento Simport Scientific Inc.de bisturí de piel de diapositivasportaobjetosBaño deoftálmico curvada cónica