Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Modelo de cicatrización de heridas excisionales de Murine y análisis de heridas morfométricas histológicas

13.8K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/61616

⸱

21 de agosto de 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo generar heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones y cómo monitorear, cosechar y preparar las heridas para el análisis morfométrico. Se incluye una descripción detallada de cómo utilizar secciones histológicas seriales para definir, cuantificar y detectar defectos morfométricos con precisión.

Resumen

El modelo de heridas escisionales murinas se ha utilizado ampliamente para estudiar cada una de las fases secuencialmente superpuestas de la cicatrización de heridas: inflamación, proliferación y remodelación. Las heridas murinas tienen un lecho de heridas histológicamente bien definido y fácilmente reconocible sobre el cual estas diferentes fases del proceso de curación son medibles. Dentro del campo, es común utilizar un "medio" definido arbitrariamente de la herida para análisis histológicos. Sin embargo, las heridas son una entidad tridimensional y a menudo no es histológicamente simétricas, lo que apoya la necesidad de un método de cuantificación bien definido y robusto para detectar defectos morfométricos con un tamaño de efecto pequeño. En este protocolo, describimos el procedimiento para crear heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones, así como una instrucción detallada sobre cómo medir parámetros morfométricos utilizando un programa de procesamiento de imágenes en secciones seriales selectas. Las mediciones de dos dimensiones de la longitud de la herida, la longitud epidérmica, el área epidérmica y el área de la herida se utilizan en combinación con la distancia conocida entre las secciones para extrapolar el área epidérmica de tres dimensiones que cubre la herida, el área general de la herida, el volumen epidérmico y el volumen de la herida. Aunque este análisis histológico detallado consume más tiempo y recursos que los análisis convencionales, su rigor aumenta la probabilidad de detectar nuevos fenotipos en un proceso de cicatrización de heridas inherentemente complejo.

Introducción

La cicatrización de heridas cutáneas es un proceso biológico complejo con fases que se superponen secuencialmente. Requiere la coordinación de procesos celulares y moleculares que están regulados temporal y espacialmente para restaurar la función de barrera del epitelio dañado. En la primera fase, la inflamación, los neutrófilos y los macrófagos migran a la herida, movilizando las defensas locales y sistémicas1. Seguir y superponer la fase inflamatoria es la etapa de proliferación. Los fibroblastos comienzan a proliferar y migrar rápidamente al tejido de granulación. Los queratinocitos alejados del borde delantero proliferan direccionalmente hacia la herida a medida que los queratinocitos diferenciados en el borde delantero migran para volver a epitelizar la herida2. Finalmente, comienza la fase de remodelación y maduración, durante la cual los fibroblastos en el tejido de granulación comienzan a sintetizar y depositar colágeno. La remodelación y organización de la nueva matriz puede durar hasta 1 año después de la lesión3. Debido a la complejidad de los eventos superpuestos que implican conversaciones cruzadas entre múltiples tipos de células, y a pesar de años de investigación, muchos de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la cicatrización de heridas siguen siendo poco entendidos.

El modelo de ratón es el modelo predominante de mamíferos para investigar los mecanismos de cicatrización de heridas debido a su facilidad de uso, relativamente bajo costo y manipulabilidad genética1,4,5. Aunque se han descrito diferentes tipos de heridas en el modelo murino, la más común es una herida escisional (ya sea perforación bilateral o biopsia por punción directa), seguida de los modelos de heridas incisionales4. El modelo de herida escisión tiene una clara ventaja sobre el modelo de incisión, ya que genera intrínsecamente tejido de control que no ha sido sometido al proceso de curación. El tejido de biopsia por punción que se extirpa como parte del protocolo quirúrgico se puede procesar de la misma manera que el tejido herido y se utiliza para establecer las condiciones homeostáticas para un criterio deseado. El tejido de control extirpado también puede ser útil si se evalúan los efectos de un pretratamiento cutáneo o se confirma una alteración genética exitosa en el momento de la lesión4.

Los parámetros de curación se pueden evaluar mediante muchas técnicas diferentes, como la planimetría o la histología. Sin embargo, la planimetría sólo puede evaluar las características visibles de la herida, y debido a la presencia de una costra, a menudo no se correlaciona con las mediciones de curación que se visualizan por histología, haciendo de la histología el "estándar de oro" del análisis4. A pesar de que el análisis histológico es el estándar de oro, se realiza con mayor frecuencia en un subconjunto arbitrario de la herida6,7. Por ejemplo, cortar la herida en "la mitad" antes de incrustar y secciones de la herida es actualmente una práctica común para reducir el tiempo y los recursos invertidos en la sección de materiales y análisis de datos. El método de análisis morfométrico descrito en este protocolo fue desarrollado para abarcar todo el tejido de la herida, para reflejar con precisión las características morfológicas de la herida, y para aumentar la probabilidad de detectar defectos de cicatrización de heridas con un tamaño de efecto pequeño. En este protocolo, detallamos un método quirúrgico para generar la herida murina más comúnmente estudiada, la herida excisional bilateral de espesor completo, así como un método detallado y riguroso para el análisis histológico tal se utiliza raramente en el campo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los experimentos se completaron de acuerdo con las regulaciones federales y la política y los procedimientos de la Universidad de Iowa han sido aprobados por la Universidad de Iowa IACUC.

1. Animales y cría

  1. Utilice ratones adultos de la línea de ratón deseada a las 8-10 semanas de edad cuando la etapa del folículo piloso esté en telógeno.
  2. El día de la cirugía, separe los ratones en jaulas limpias y haga una casa individual para minimizar la interrupción de la herida.

2. Cirugía

NOTA: No es necesario mantener condiciones quirúrgicas estériles. Si bien se debe tener cuidado de mantener la esterilidad entre los animales, la biopsia por punción en sí se realiza en una superficie limpia, pero no estéril. La duración de la cirugía por animal es de entre 10 y 15 minutos.

  1. Anesthetización
    1. Anestesar al animal durante 1-2 min en una cámara de inducción con el vaporizador de isoflurano establecido en un caudal de 4-5% y el medidor de flujo de oxígeno establecido en 1 litro por minuto. Consulte Discusión para ver las opciones alternativas de anestesia.
    2. Confirme la anestesia adecuada antes de comenzar el procedimiento. La profundidad de la anestesia puede ser confirmada por un pellizco firme del dedo del de la dedo del fondo.
    3. Transfiera el ratón del recipiente de inducción a un cono nasal y reduzca el caudal de isoflurano al 1,5% y el medidor de flujo de oxígeno a 0,5 L/min.
    4. Aplicar pomada oftálmica en ambos ojos ya que el procedimiento supera los 5 min.
    5. Mantenga la temperatura corporal normal con una almohadilla térmica.
  2. Preparación del sitio de la herida
    1. Utilice un cortacay de afeitar eléctrico en un movimiento rostral caudal para quitar el pelaje en la parte posterior del ratón a nivel del hombro. Retire el vello más bajo de la espalda según sea necesario si realiza más de dos heridas.
    2. Retire el cabello restante utilizando una cuchilla de afeitar en un movimiento caudal rostral sostenido a 20o desde la parte posterior del ratón para afeitar de cerca la zona recortada (Figura 1A).
    3. Limpie la zona afeitada con un hisopo de yodo povidona.
    4. Limpie la piel con una almohadilla de preparación de alcohol isopropílico estéril al 70% para reducir la posible irritación cutánea del hisopo de yodo.
  3. Herir
    1. Pinche la piel entre los omóplatos a lo largo de la línea media dorsal y tire del pliegue de piel empareda lejos del cuerpo (Figura 1B).
    2. Coloque el ratón de lado con el pliegue de piel sobre una superficie plana cubierta con una toalla limpia a base de papel o equivalente. Utilice una lámina de cera dental debajo de la toalla para proteger la superficie subyacente de daños(Figura 1C).
    3. Coloque el punzón de biopsia del tamaño deseado lo más cerca posible del cuerpo y permita que la piel se relaje. No estire la piel, o el tamaño de la herida será mayor que el tamaño de punzonado designado (Figura 1D).
    4. Golpear la piel presionando hacia abajo, un movimiento de balanceo se puede utilizar para asegurar que todas las capas de la piel en ambos lados han sido penetradas (Figura 1E). Usa un nuevo punzón de biopsia para cada animal.
    5. Retire las biopsias de punzonado de las heridas(Figura 1F). Si todavía hay sitios de fijación utilizar tijeras estériles y pinzas para liberar el punzón de la piel circundante. Procesar el tejido de control de la biopsia por punción según sea necesario en función de los planes posteriores para los análisis de cicatrización de heridas (ver Discusión para sugerencias).
    6. Tome fotografías macroscópicas desde la misma distancia que los sitios de la herida o con una regla en el marco con el fin de medir el área inicial de la herida y eliminar los valores atípicos del análisis.
    7. Administrar analgesia durante un mínimo de 24 h de acuerdo con un protocolo animal aprobado. Por ejemplo: Buprenorfina SR-LAB, inyectada como dosis única por vía subcutánea a 0,5-2 mg/kg para 48 h de alivio del dolor (ver Discusión para sugerencias alternativas y consideraciones).
    8. Monitoree el ratón ya que sale de la anestesia hasta que mantiene una postura erguida y está caminando normalmente alrededor de la jaula.

3. Monitoreo posterior de heridas

  1. Supervise a los ratones diariamente para determinar los puntos finales experimentales según lo determine el investigador y de acuerdo con los protocolos institucionales. Algunos ejemplos son: infección, pérdida de peso visible o postura encorvada.
  2. Tome fotografías macroscópicas diarias de manera controlada como se hizo después de la cirugía inicial.

4. Cosecha de heridas

  1. Eutanasiar los ratones en el momento deseado después de la herida de acuerdo con un protocolo animal aprobado.
  2. Tomar fotografías macroscópicas de los sitios de la herida de manera controlada de manera consistente con la adquisición de fotografías anteriores (Figura 2A,C).
  3. Cortar un rectángulo ancho alrededor de los sitios de la herida usando un bisturí (Figura 2D,E).
  4. Libere la pieza rectangular de tejido usando tijeras y pinzas para pelar y cortar la piel lejos del tejido subyacente(Figura 2F). Colocar en un plato de Petri (Figura 2G).
  5. Cosecha las heridas. Recortar hasta 2 mm de tejido sin rebobinar que rodea todos los lados de la herida en forma rectangular(Figura 2H,I). Consulte Discusión para ver opciones alternativas para cosechar la herida.
  6. Procesar las heridas según sea necesario para estudios posteriores. Reserve al menos una herida por ratón para la incrustación de parafina y el análisis histológico.

5. Fijación e incrustación de heridas

  1. Arreglar la herida
    1. Fijar el tejido de la herida en una solución de paraformaldehído 4% recién preparada8 durante 3 h a temperatura ambiente y luego transferir a 4 oC durante la noche. No se requiere paraformaldehído de grado de microscopía electrónica (EM) y filtración de solución.
    2. Lave las heridas dos veces durante 30 minutos en 1x PBS.
    3. Sustituya PBS por 70% ETOH y guárdelo a 4oC hasta que se la incruste. Procesar tejidos dentro de 24-48 h para evitar la pérdida de antígenos o dentro de 1-2 semanas si sólo evalúa las características histológicas.
  2. Procesar e incrustar la herida
    1. Transfiera cada herida a un casete incrustado. Etiqueta de los casetes de incrustación en lápiz como el proceso eliminará las tintas.
    2. Procesar el tejido manualmente o utilizando un procesador automatizado deshidratando el tejido con porcentajes de etanol crecientes, limpiando con xileno, y luego infiltrando el tejido con cera de parafina (Tabla 1).
    3. Incrustar la herida 90o ("de pie") de la superficie horizontal del molde de incrustación (Figura 3A,B).

6. Análisis del área de la herida del día 0

  1. Descargar niH-Image J o NIH-Fiji software libre (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. Abra un archivo con una fotografía de las heridas del día 0.
  3. Marque la casilla"Area"en Analizar | Establecer medidas.
  4. Seleccione "Establecer escala" en Analizar. Introduzca la distancia en píxeles, la distancia correspondiente conocida y la unidad de la distancia (unidad de longitud) si las mediciones macroscópicas forman parte del estudio u omita este paso si solo se requieren mediciones relativas.
  5. Seleccione "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas de Fiji.
  6. Delinea el perímetro de la herida.
  7. Haga clic en Medir en Analizar.
  8. Cree una hoja de cálculo para realizar un seguimiento de las mediciones por animal por herida.
  9. Copie la medición del área de la herida en la hoja de cálculo.
  10. Calcular el área media y la desviación estándar de todas las heridas para un experimento dado.
  11. Excluir cualquier herida fuera de dos desviaciones estándar de la media del análisis histológico.

7. Seccionamiento en serie

  1. Enfríe los bloques de la herida incrustados en la parafina a 4 oC durante la noche.
  2. Inserte el bloque de parafina en el soporte del bloque del microtoma y oriente para que la hoja se corte directamente a través del bloque. Orientar el bloque de tal manera que el tejido "se mantenga" a 90o permitiendo el seccionamiento simultáneo de la epidermis y la dermis (Figura 3C,D).
  3. Hacer 2-4 cintas de 20-30 secciones de parafina de 7 m cada una.
  4. Utilice un pincel de pintura seca y una aguja de disección para transferir cada cinta a una superficie firme pero manipulable, como una hoja de plástico negro firme.
  5. Separe la sección superior de cada cinta con una cuchilla de afeitar y colóquela en una diapositiva del microscopio.
  6. Observar las secciones no manchadas bajo un microscopio de campo brillante para determinar cuáles contienen tejido herido, que puede ser identificado por ausencia de folículo piloso, cambios en la apariencia del tejido conectivo o la epidermis, y / o la presencia de una costra (Figura 4A,B).
  7. Deseche las secciones sin aserrificar hasta 20 secciones antes del comienzo de la herida.
  8. Secciones a través de la herida repitiendo los pasos 7.3 y 7.4 hasta que no se detecte ninguna herida en las secciones no detenidas.

8. Montaje de secciones de parafina

  1. Separe las secciones de parafina cada 5 secciones con una cuchilla de afeitar, comenzando con la primera cinta (Figura 3E).
  2. Etiqueta las diapositivas del microscopio con el número de diapositiva y todos los números de sección.
  3. Coge el grupo de 5 secciones con un pincel de pintura húmeda y flota en la superficie del agua de un baño de agua tibia (40-45 oC) para aplanarlas.
  4. Escoge el grupo de 5 secciones del baño de agua usando uno de los portaobjetos de microscopio etiquetados (Figura 3F) y colóquelo en un calentador de diapositivas a 37 oC durante un máximo de 24 h.
  5. Guarde las diapositivas en posición vertical en una caja de diapositivas.

9. Tinción histológica

  1. Transfiera cada diapositiva del microscopio8o (equivalente a cada sección de parafina 40) a un estante de tinción y manche con hematoxilina y eosina.

10. Imágenes microscópicas

  1. Adquiera imágenes utilizando un microscopio de campo brillante equipado con un objetivo 4x y capacidades de adquisición digital. Registre la escala a la que se toma la imagen.
  2. Image toda la herida de la sección superior de cada diapositiva teñida y asegúrate de incluir algo de tejido sin rebobinar a cada lado. Tome varias imágenes superpuestas si la herida es más grande que el marco de una sola imagen.
  3. Guarde el archivo, incluido el número de sección para el análisis morfométrico. Utilice el número de sección seguido de a, b, c, etc. para imágenes superpuestas de la misma herida.

11. Análisis morfométrico

NOTA: Cuando la herida abarque varias imágenes, sume las medidas tomadas de las imágenes individuales para obtener un valor por métrica por sección de herida para registrar en la hoja de cálculo.

  1. En la imagen J, abra un archivo digital de una imagen de herida manchada. No utilice imágenes cosidas para el análisis. Realice mediciones en imágenes superpuestas ampliadas mediante la búsqueda de puntos de referencia para dejar y recoger las medidas de una imagen a una imagen.
  2. Establezca la escala y las preferencias de medición.
    1. Seleccione "Establecer escala" en Analizar. Introduzca la distancia en píxeles, la distancia correspondiente conocida y la unidad de la distancia (unidad de longitud). La escala debe aparecer en la ventana y debe corresponder a la escala en la que se adquirió la imagen.
    2. Marque la casilla"Global"para mantener la escala igual para cada imagen abierta.
    3. Repita los pasos 11.2.1 a 11.2.2 cada vez que se cierre y vuelva a abrir la imagen J.
    4. Marque la casilla"Area"en Analizar | Establecer medidas.
  3. Mida la longitud de la herida
    1. Seleccione "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas de Fiji.
    2. Medir a partir del último folículo piloso del tejido no lesionado en un lado de la herida hasta el primer folículo piloso del tejido no lesionado en el otro lado de la herida (Figura 4A,B).
    3. Traza a lo largo de la unión dermoepidérmica para llegar a estos dos puntos de referencia. Si la epidermis no cubre toda la herida, siga la unión dermoepidérmica en un lado de la herida y donde la lengua migratoria termina siguiendo el aspecto superior del tejido de granulación o la unión entre el tejido de granulación y la costra hasta llegar a la lengua migratoria y finalmente el primer folículo del tejido no lesionado en el otro lado (Figura 4E,F).
    4. En Analizar, haga clic en Medir. La longitud de la medida aparecerá en las mismas unidades establecidas en la escala.
    5. Cree una hoja de cálculo para realizar un seguimiento de las medidas(Tabla complementaria 1).
    6. Copie la longitud de la herida en la hoja de cálculo.
  4. Medir la longitud epidérmica
    1. Si la epidermis cubre toda la herida, la longitud epidérmica es la misma que la longitud de la herida.
      1. Copie la medida de "longitud de la herida" en la columna "longitud epidérmica" en la hoja de cálculo de Excel y vaya al paso 11.5.
    2. Si la epidermis no cubre toda la herida, seleccione las"selecciones a mano alzada"y mida la distancia entre cada borde delantero epidérmico siguiendo el aspecto superior del tejido de granulación o la unión entre el tejido de granulación y la costra al primer folículo piloso (Figura 4C,D).
      1. En Analizar, haga clic en Medir.
      2. Restar esta medida de la longitud de la herida y registrar el número en "longitud epidérmica" en la hoja de cálculo de Excel.
  5. Mida el área de la herida
    1. Seleccione "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas de Fiji.
    2. Medir a partir del último folículo piloso del tejido no lesionado en un lado de la herida hasta el primer folículo piloso del tejido no lesionado en el otro lado de la herida(Figura 4A,B,E,F).
    3. Traza a lo largo del aspecto superior de la epidermis (no incluyas la costra) o el aspecto superior del tejido de granulación si la herida no está completamente cubierta por la epidermis.
    4. Continúe trazando verticalmente a lo largo del folículo piloso en el tejido de granulación una vez que se alcanza el folículo piloso opuesto y hasta que se alcanza el tejido o músculo adiposo. Siga el borde inferior del tejido de granulación hasta el lado opuesto de la herida y únase al punto de partida a lo largo del folículo piloso para cerrar el área(Figura 4E,F).
    5. En Analizar, haga clic en Medir.
    6. Copie el área de la herida en la hoja de cálculo debajo del "área de la herida medida".
  6. Mida el área epidérmica
    1. Seleccione "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas de Fiji.
    2. Si la herida está completamente epitelializada:
      1. Traza a lo largo del aspecto superior de la epidermis hasta que se alcanza el folículo piloso opuesto y completa la zona "regresando" al punto de partida después de la unión dermoepidérmica entre la epidermis y la dermis (Figura 4D).
      2. En Analizar, haga clic en Medir.
      3. Copie el área epidérmica en la hoja de cálculo de Excel en "área epidérmica medida" y vaya al paso 11.7.
    3. Si la herida no está completamente epitelializada:
      1. Trazar a lo largo del aspecto superior de la epidermis hasta el borde de ataque y volver al punto de partida después de la unión dermoepidérmica (Figura 4C).
      2. En Analizar, haga clic en Medir.
      3. Repita los pasos 11.6.3.1 y 11.6.3.2 en el lado opuesto de la herida.
      4. En Analizar, haga clic en Medir.
      5. Suma los dos números obtenidos en los pasos 11.6.3.2 y 11.6.3.4 e introduce el resultado en "área epidérmica medida" en la hoja de cálculo.
  7. Repita los pasos 11.3 a 11.6 en cadasección 40 (cada 8diapositivas).
  8. Calcular el área epidérmica de toda la herida.
    1. Cree una nueva columna en la hoja de cálculo "área epidérmica calculada" junto a "longitud epidérmica."
    2. Multiplique el número de "longitud epidérmica" por 280 para cada sección excepto la última (sección de 7 m de espesor x 40 secciones).
    3. Multiplique el número de "longitud epidérmica" por 7 para la última sección (espesor de la sección).
    4. Sumar el valor del "área epidérmica calculada" para cada sección para obtener el área epidérmica de toda la herida.
  9. Calcule el área de la herida de toda la herida.
    1. Repita los pasos 11.8.1 a 11.8.4 utilizando las medidas de longitud de la herida.
  10. Calcular el volumen epidérmico de toda la herida.
    1. Repita los pasos 11.8.1 a 11.8.4 utilizando las mediciones de "área epidérmica medida".
  11. Calcule el volumen de la herida de toda la herida.
    1. Repita los pasos 11.8.1 a 11.8.4 utilizando las mediciones de "área de herida medida".
  12. Calcular el porcentaje de volumen epidérmico en la herida.
    1. Divida el volumen epidérmico total por el volumen total de la herida y multiplique por 100 para obtener el porcentaje (no haga esta proporción para cada sección).
  13. Calcular el porcentaje de área epidérmica entre el área de la herida.
    1. Divida el área epidérmica total por el área total de la herida y multiplique por 100 para obtener el porcentaje. Si una herida está completamente epitelializada, este número debe ser 100.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La Figura 5 representa el rango en valores medidos y calculados obtenidos mediante la realización de análisis morfométricos en heridas de tipo salvaje generadas en diferentes cepas de ratón por múltiples cirujanos y analizadas por diferentes individuos. Los ratones de tipo salvaje de diferentes cepas pueden mostrar diferencias estadísticas como se describe tanto en nuestros estudios como en la literatura9,10. Sobre la base de estos r...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El modelo bilateral de heridas por escisión es un procedimiento altamente personalizable que se puede utilizar para estudiar muchos aspectos diferentes de la cicatrización de heridas. Antes de comenzar un proyecto de cicatrización de heridas, los investigadores deben realizar un análisis de potencia para determinar el número de heridas necesarias para detectar un defecto de un tamaño de efecto particular. Existen incoherencias en la literatura sobre si los ratones individuales o las heridas deben utilizarse como réplicas...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Dunnwald que han contribuido a la optimización de este protocolo a lo largo de los años, y a Gina Schatteman cuya persistencia en la promoción del uso de la sección en serie para el análisis de heridas hizo posible su creación. Este trabajo fue apoyado por la financiación de NIH/NIAMS a Martine Dunnwald (AR067739).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
100% etanol
70% etanol
80% etanol
95% etanol
Preparación de alcoholNOVAPLUSV910070% Alcohol isopropílico, estéril
Hidróxido
Almohadillas de biopsiaCellpath22-222-012
LáminaAlgo firme pero manipulable del tamaño de una hoja de papel
MicroscopioCon capacidad de adquisición digital y un objetivo 4X
Aplicadores
Cubreobjetos22 x 60 #1
Hojas
de cera dentalCámaraIncluya una regla para la escala, si corresponde
Aguja de disección (recta)
Moldes de22 x 22 x 12
Anillos de inclusiónSimport Scientific Inc.M460
Eosina Y
Ácido
Cortapete
de pelo Almohadilla térmicaConairAlmohadilla térmica seca
y húmeda Hematoxilina
Microtomo
Cuchillas de micrótomo
Pinceles Parafina
Tipo 6
Paraformaldehído
fosfato (PBS)
Povidona-yodoAplicare82-255
M490-2
Hojas de afeitarASR.009
Hojas de bisturí de servicio regular #10
Mango
Tijeras quirúrgicas afiladas estérilespara cirugía
Punzones de biopsiaTamaño determinado por el investigador
Cajas
Calentadores de
Portaobjetos de microscopio superesmeriladosFisher Scientific22 037 246
agua con control de temperatura
Estaciónde inclusión de tejidos Mínimo de un dispensador de parafina y una placa fría
Procesadorde tejidos Mínimo de un horno con bomba de vacío
Triple antibiótico pinzas de ungüento
, de puntaestéril para cirugía
pinzas, de puntaestéril para cirugía
WypAll X60Kimberly-Clark34865
de amonio de plástico negro de campo claro con punta de algodón digital inclusión acético glacial Permount Solución tampón de Casete de procesamiento Simport Scientific Inc.de bisturí de piel de diapositivasportaobjetosBaño deoftálmico curvada cónica

Referencias

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040(2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Análisis morfométrico histológicocortes seriadosmedición del área epidérmicacálculo del volumen de la heridaheridas de espesor totaltécnica de biopsia por punciónprograma de procesamiento de imágenesextrapolación del volumen epidérmico
Modelo de cicatrización de heridas excisionales de Murine y análisis de heridas morfométricas histológicas
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.