Artículo de método

Una plataforma de membrana modelo para la reconstitución de la dinámica de membrana mitocondrial

DOI:

10.3791/61620

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2 de septiembre de 2020

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1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Chemistry, University of Akron, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

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La fusión mitocondrial es una reacción homeostática importante subyacente a la dinámica mitocondrial. Aquí se describe un sistema de reconstitución in vitro para estudiar la fusión de membrana interna mitocondrial que puede resolver el anclaje de membrana, acoplamiento, hemisfusión y apertura de poros. Se discute la versatilidad de este enfoque en la exploración de los sistemas de membrana celular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dinámica mitocondrial es esencial para las diversas funciones y respuestas celulares del orgánulo. La membrana mitocondrial abarrotada, espacialmente compleja, es un entorno difícil para distinguir los factores reguladores. El control experimental de los componentes proteicos y lipídicos puede ayudar a responder preguntas específicas de regulación. Sin embargo, la manipulación cuantitativa de estos factores es un desafío en los ensayos celulares. Para investigar el mecanismo molecular de la fusión de membrana interna de las mitocondrias, introdujimos una plataforma de reconstitución in vitro que imita el entorno lipídico de la membrana interna mitocondrial. Aquí describimos pasos detallados para preparar bicapas lipídicas y reconstituir proteínas de membrana mitocondrial. La plataforma permitió el análisis de los intermedios en la fusión de membrana interna mitocondrial, y la cinética para transiciones individuales, de manera cuantitativa. Este protocolo describe la fabricación de bicapas con composición lipídica asimétrica y describe consideraciones generales para reconstituir las proteínas transmembranas en una bicapa acolchada. El método se puede aplicar para estudiar otros sistemas de membrana.

Introducción

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La compartimentación de membranas es un sello distintivo de las células eucariotas1 (Figura 1A). Las membranas biológicas son cada vez más reconocidas como más que un disolvente bidimensional, y se consideran como un entorno que desempeña un papel crítico en la regulación de la función proteica y el ensamblaje del complejo macromolecular2,,3. Los lípidos nativos son ligandos que regulan la actividad proteica de membrana3,4. La organización espacial de membranas y la capacidad de las membranas para ser esculpidas en diversas formas son propiedades físicas importantes para seleccionar nuevas funciones3,,5.

Las plataformas de membrana modelo son sistemas biomiméticos que pueden ayudarnos a entender la estructura de la membrana celular, la dinámica y la función6,7,8. Las membranas modelo suelen comprender una mezcla de lípidos de composición bien definida, con propiedades biofísicas definidas (rigidez, grosor y elasticidad). Acopladas a imágenes de fluorescencia, las plataformas de membrana modelo permiten el análisis cuantitativo de la estructura de la membrana y la función9,10,11. Se han utilizado estrategias de reconstitución de bicapas para estudiar la fusión de membranas mediada por SNARE9,10, fusión de membrana mediada por ADN12, y fusión viral11,13. Una ventaja de estos métodos es la posibilidad de obtener información cinética para pasos intermedios anteriores a un evento de reacción observable14.

La membrana plasmática ha sido ampliamente estudiada utilizando membranas modelo. Las bicapas con separación de fase lipídica se han desarrollado para estudiar estructuras de balsa de lípidos importantes en la señalización celular11,15,16. Micropatroides de lípidos planarbicapas 17,18 se han utilizado para investigar la organización de los receptores celulares. Las membranas apoyadas por polímeros o geles se han utilizado como sistemas biomiméticos para estudiar la organización de la membrana-citoesqueleto, la partición de proteínas de membrana durante la señalización celular y la migración en contactoscelulares-células 19.

También se están aplicando sistemas de membrana artificial para estudiar los orgánulos subcelulares20. Los organelles presentan morfologías características que crean subeconos distintos. La red endoplasmática retículo (ER) es un ejemplo. Tras la reconstitución de los reticulons en liposomas, se forman estructuras de membrana tubular con propiedades similares a la ER celular21. La adición de atlastina, una proteína de fusión de ER, puede inducir túbulos lipídicos de liposomas para formar una red20. Este es un ejemplo de cómo los proteoliposomas pueden proporcionar una visión funcional de la morfología y la dinámica del orgánulo.

La fusión de membrana mitocondrial y la fisión son esenciales para la salud de la población mitocondrial22,23,24,25. Un conjunto de la familia de dinaminas GTPases cataliza la fusión de membranas mitocondrias. Mfn 1/2 cataliza la fusión de membrana exterior. Opa1 media la fusión de membrana interna26 (Figura 1B). Opa1 tiene dos formas: una forma larga (l-Opa1), transmembrana anclada a la membrana interna mitocondrial, y una forma corta 'soluble' (s-Opa1), presente en el espacio intermembrano. La relación de las dos formas Opa1 está regulada por la actividad de dos proteasas, Oma1 y Yme1L27,,28,,29,,30. Preguntas importantes en la regulación Opa1 incluyen: cómo las dos formas de Opa1, (corto y largo) mediar la fusión de membrana y su interacción reguladora28,29,31,32,33.

Aquí describimos una estrategia de reconstitución aplicada con éxito para investigar la fusión de membrana interna mitocondrial que aclaró las funciones de l- y s-Opa1 en la fusión de membrana interna. Desarrollamos una plataforma que imita la membrana interna mitocondrial utilizando una bicala de lípidos con anclaje de polímero y vesículas unilamelares de 200 nm. Los beneficios de una correa de polímero debajo de la bicatra lipídica incluyen los siguientes. En primer lugar, conserva la proteína transmembrana reconstituida, que de otro modo podría verse interrumpida por la proximidad al portaobjetos de vidrio34. En segundo lugar, sirve una capa de agua gruesa entre la bicapa lipídica y el sustrato de vidrio, lo que facilita el estudio de la apertura de los poros9,y en tercer lugar la naturaleza viscoelástica del polímero PEG permite cambios de curvatura de membrana35. Usamos imágenes de fluorescencia de tres colores para caracterizar pasos en la fusión de membranas(Figura 1C-F).

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Figura 1: Monitorización de la fusión de membrana mitocondrial.
(A) Los organelles son compartimentos de membrana celular. (B) Pasos secuenciales de fusión de membrana mitocondrial. La fusión de la membrana externa de las mitocondrias es catalizada por Mfn1 y/o Mfn2, mientras que la fusión de membrana interna está mediada por Opa1. (C-F) Esquema de la plataforma de reconstitución in vitro para estudiar la fusión de membrana mitocondrial. La plataforma incluye dos partes: un proteoliposoma y una bicapa lipídica con anclaje a polímeros, ambas con l-Opa1 reconstituido. Las etiquetas fluorescentes, incluyendo dos tintes de membrana fluorescentes diferentes y un marcador de contenido, ayudan a distinguir los pasos durante la fusión de membrana. Los dos marcadores de membrana (Cy5-PE (rojo) y TexasRed PE (naranja) hacen un par FRET, que puede informar sobre el acoplamiento de membrana estrecha. La difusión de TexasRed-PE que etiqueta el proteoliposoma es un indicador de la desmezcla de lípidos (hemifusión). La liberación de contenido se supervisa a través de la morosa de la señal de calceína (mostrada en verde). Paneles A y B creados con Biorender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

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1. Preparación de mezclas de lípidos

  1. Preparar una solución de lípido disolviendo 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PAPA), L-o-fosfatidislinol (PI de hígado), cardiolipina, y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (18:1 PEG2000 PE) en cloroformo a la concentración de 25 mg/ml. Disolver cloroformo conjugado con lípido fluorescente (TexasRed DHPE y Cy5 DOPE) a una concentración de 1 mg/ml. Conservar la solución lipídica en viales de color ámbar con revestimiento resistente al cloroformo, sellado además con cinta de politetrafluoroetileno. La solución se puede conservar a -20 oC durante un máximo de 6 meses.
  2. Haga las soluciones A y B.
    1. Mezclar lípidos para preparar la solución A (concentración final 1 mg/ml) que contiene DOPC (52,8 mol%), PAPA (20 mol%), PI de hígado (7 mol%) cardiolipina (20 mol%) y fluoróforo 0,2 mol%.
    2. Hacer solución B (concentración final 1 mg/ml) que contenga DOPC (47,8 mol%), PAPA (20 mol%), PI hepático (7 mol%), cardiolipina (20 mol%) y DOPE-PEG2000 (5 mol%), y 0.2 mol% de fluoróforo.
    3. Genere la mezcla de lípidos añadiendo el volumen calculado de solución de almacenamiento en viales de ámbar utilizando una jeringa de vidrio. Haga coincidir el volumen final añadiendo cloroformo adicional a los viales.
      NOTA: Para FCS (espectroscopia de correlación de fluorescencia), disminuya la proporción de lípidos conjugados de colorante a 0.002 mol% y reemplace el resto por DOPC.

2. Fabricación de bicapas de lípidos

  1. El microscopio de hornear cubre los portaobjetos a 520 oC durante 30 min. Después de hornear, enfríe los portaobjetos a temperatura ambiente.
  2. Pesar aproximadamente 10 g de hidróxido de sodio y añadir a 500 ml de metanol durante la agitación. Revuelva durante 2 h, continúe agregando hidróxido de sodio en la solución hasta que los precipitados comiencen a mostrarse. Asegúrese de usar el EPP adecuado durante todo el proceso.
  3. Limpie los portaobjetos de vidrio en una solución de dodecil sulfato sódico al 10%; metanol saturado con hidróxido de sodio; y ácido clorhídrico de 50 mM, secuencialmente (sonicación de baño bajo cada condición durante 30 min). Limpie el tobogán de vidrio en agua ultrapura durante 10 minutos entre cada condición.
    NOTA: Aunque se recomienda utilizar soluciones frescas para la preparación de diapositivas de vidrio, cada solución se puede reutilizar hasta 5 veces o en 1 mes, lo que ocurra primero. Asegúrese de mezclar la solución antes de cada uso.
  4. Almacene el vidrio de la cubierta limpia sellado en solución HCl hasta 2 semanas para garantizar una buena calidad de la bicapa. Si se almacena en agua ultrapura, utilice los portaobjetos en el plazo de una semana.
  5. Limpie el canal de politetrafluoroetileno del sistema de inmersión Langmuir-Blodgett utilizando cloroformo y agua ultrapura hasta que no se observe humectación en la vaguada. Rocíe el cloroformo en la superficie de la vaguada, limpie bien con toallitas de celulosa 3x. Enjuagar con agua ultrapura y retirar el agua mediante succión. Repita 3x.
  6. Cubra la superficie de la vaguada con agua ultrapura limpia.
  7. Tome 2 piezas de vidrio de cubierta tratada en la superficie de la solución de limpieza o agua ultrapura, y enjuague el portaobjetos de vidrio con agua ultrapura durante aproximadamente 30 s.
  8. Coloque el vidrio de la cubierta de forma consecutiva. Utilice la abrazadera de sustrato para sujetar los portaobjetos de vidrio. Sumerja el tobogán de vidrio debajo de la superficie del agua haciendo clic manualmente en "dipper down" en el software de control Langmuir.
  9. Cero el balance de la película, extendiendo cuidadosamente la solución B gota a gota en la interfaz aire-agua (Figura 2A). Asegúrese de que los lípidos sólo se propaguen en la interfaz aire-agua, sin tejas de cloroformo y lípidos hundiéndose en la parte inferior de la superficie de politetrafluoroetileno.  Si no se asegura de esto, se creará un "canal" de lípidos y se evitará la formación de monocapas.
  10. Deje de agregar lípidos hasta que la película haga una lectura de equilibrio alrededor de 15-20 mN/m, espere entre 10 y 15 minutos. Inicie el controlador de barrera para alterar el área de superficie haciendo clic en "iniciar experimentos", hasta que la lectura del equilibrio de la película sea de 37 mN/m. Mantener la presión durante 20-30 min(Figura 2B).
  11. Levante el vidrio de la cubierta a una velocidad de 22 mm/min manteniendo la tensión superficial a 37 mN/m. Una monocapa lipídica con anclaje de polímero se transferirá desde la interfaz aire-agua a la superficie del vidrio de cubierta a través del proceso de inmersión Blodgett (Figura 2C). Esto forma el prospecto inferior de la bicala lipídica.
  12. Limpie la interfaz aire-agua por succión, enjuague la vaguada con agua ultrapura.
  13. Limpie un portaobjetos de vidrio de un solo pozo (por ejemplo, diapositiva Shaefer) con cloroformo, etanol y agua ultrapura antes de su uso. Ajuste el portaobjetos de vidrio limpio en la vaguada con agua ultrapura debajo de la capa de agua. Asegúrese de que el pozo esté mirando hacia la interfaz aire-agua y vierta agua ultrapura fresca hasta que el portaobjetos de vidrio esté completamente cubierto. Repita el paso 2.8.
  14. Sostenga el vaso de la cubierta con monocapa lipídica del paso 2.4 usando una ventosa de silicio (asegúrese de que el lado monocapa esté lejos de la ventosa), empuje suavemente la monocapa lipídica a la interfaz aire-agua, sostenga el vidrio de la cubierta durante 2-3 s en la interfaz, luego empuje el cristal de la cubierta contra la diapositiva (Figura 2D). Saque la diapositiva con una diapositiva de cubierta.
    NOTA: La bicapa lipídica se mantendrá en la superficie del vidrio de cubierta frente al área intercalada entre los dos portaobjetos (Figura 2E).
  15. Lleve el vidrio de la cubierta con la bicapa a un microscopio de epifluorescencia. Imagen de la bicala de lípidos. Si se observa una distribución homogénea de tinte lipídico, fotoblanquear un área pequeña de la bica procapa durante 30 s, apague la fuente de luz durante 30 s-1 min., luego vuelva a la imagen para observar la recuperación. La bicaca de lípidos mostrará recuperación de la fluorescencia.
    NOTA: Las membranas con defectos o recuperación de fluorescencia incorrecta no deben utilizarse para experimentos posteriores.

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Figura 2: Pasos en la fabricación de una bicala de lípidos con anclaje a polímeros.
Pasos de fabricación de bicapas de lípidos utilizando las técnicas de inmersión Langmuir-Blodgett (A-C) y Langmuir-Schaefer transfer (D). (E) El "sándwich" final que contiene la bicala lipídica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Reconstitución de proteínas en la bicala de lípidos teñidos de polímero

  1. Preparar un plato de cristalización que contenga agua ultrapura. Prepare un anillo de imagen de microscopio limpio y colóquelo debajo del plato.
  2. Sumerja el "sándwich" del portaobjetos Schaefer y cubra el vidrio que contiene bicapa lipídica debajo del agua, separe suavemente el portaobjetos Schaefer y cubra el vidrio, sostenga el portaobjetos de vidrio de la cubierta desde la parte inferior, lejos del lado bicapa, transfiera el vidrio de la cubierta al anillo de la imagen, cierre el anillo de la imagen.
    NOTA: Asegúrese de que el cristal de la cubierta con bicapa lipídica esté siempre en agua, y el anillo esté bien sellado.
  3. Reemplace el agua ultrapura en el anillo de imagen por el tampón Bis-Tris NaCl, asegúrese de que la bicapladora de lípidos no esté expuesta a ninguna burbuja de aire. Añadir 1,1 x 10-9 M n-Octyl-O-D-Glucopyranoside a la bicapida lipídica. Añadir inmediatamente la mezcla de 1,2 x 10-9 M de DDM y 1,3 x 10-12 mol purificado l-Opa136 en el anillo de imagen. Incubar la muestra en una coctelera de sobremesa a baja velocidad durante 2 h(Figura 3).
    NOTA: Los detergentes pueden variar dependiendo de la proteína a reconstituir.
  4. Distribuya 30 mg de perlas de resina SM-2 en 3 ml de tampón Bis-Tris y agite antes de aplicar. Utilice una pipeta de plástico para añadir 5 x 10 l de cuentas de resina SM-2 al anillo de imagen, incubar durante 10 minutos, eliminar las cuentas de resina enjuagando. El volumen final del buffer en el anillo de imagen es 1.5 mL.

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Figura 3: Procedimiento para reconstituir l-Opa1 en una bicapa lipídica con anclaje a polímeros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Preparación de proteoliposomas

  1. Preparar 1 mg de mezcla de lípidos A en solución de cloroformo. Evaporar cloroformo bajo flujo de nitrógeno durante 20 minutos y mantener bajo vacío durante la noche y formar una película de lípidos.
  2. Preparar 50 mM de calceína que contiene tampón disolviendo 15,56 g de calceína a 50 ml de solución NaOH de 1,5 mol, agitar a temperatura ambiente hasta que la calcelina se disuelva por completo, añadir 12,5 mM Bis-Tris y agua ultrapura al volumen final de 500 ml. Ajuste el pH a 7.5.
  3. Suspenda la película lipídica en el tampón que contiene calceína, hidrata completamente el lípido calentando la suspensión a 65oC durante 20 min. 200 nm se forman liposomas a través de la extrusión utilizando una membrana de policarbonato.
  4. Añadir 2 g de l-Opa1 en DDM de 0,5 m a 0,2 mg de liposoma e incubar a 4 oC durante 1,5 h. Retirar el tensioactivo mediante diálisis utilizando un cassette de diálisis de 3,5 kDa contra 250 ml de 25 mM Bis-Tris, 150 mM de NaCl y 50 mM de tampón de calceína a 4 oC durante la noche, cambiando el tampón dos veces.
  5. Retire la calceína adicional utilizando una columna de desalgadora PD-10.

5. Diagnóstico por imágenes y datos

  1. Adquiera imágenes TIRF utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x (N.A 1.4). Utilice láser de 543 nm y un láser de 488 nm para el análisis de liposomas etiquetados con TexasRed-PE y proteoliposomas encapsulados con calceína. Utilice un láser de 633 nm para el análisis de Cy5-PE incrustado en la bicacapa de lípidos planos.
  2. Alinee el ángulo TIRF utilizando una bicala lipídica para obtener la máxima emisión. La calidad de la bicapla lipídica después de la reconstitución se observa utilizando un objetivo de aceite 100x a 25 oC. El coeficiente de difusión de fosfolípidos y bicapo reconstituido se determina utilizando FCS con un protocolo que se describe en otro lugar37.
  3. Agregue 10 ml de proteoliposomas de 2 mg/ml al anillo de la imagen y ajuste durante 10 minutos antes de la imagen. GTP, GMPPCP o PIB se añaden al anillo de reacción con 1 mM MgCl2 y 1 mM de nucleótido.
  4. Para determinar la influencia de s-Opa1 en la fusión de membrana, valore s-Opa1 en una muestra de bicapa proteoliposoma/apoyada que contenga l-Opa1 y registre eventos de fusión.
  5. La imagen simultánea de TexasRed-DHPE y calceina se logra a través de un sistema de división de haces. Los láseres de 488 nm y 543 nm se aplican simultáneamente a la muestra como fuentes de excitación harinera. La luz de emisión se divide entonces utilizando un divisor de haz de 560 nm. La luz de emisión dividida entonces es filtrada por un filtro de 510 nm con un ancho de banda de 42 nm y un filtro de 609 nm con un ancho de banda de 40 nm. El haz filtrado se proyecta en dos áreas adyacentes en el chip de la cámara.
  6. La emisión fluorescente se registra simultáneamente a través de un filtro de 609 emisiones con una anchura de banda de 40 nm, y un filtro de 698 emisiones con una anchura de banda de 70 nm. El sistema de microscopio está equipado con una cámara CMOS mantenida a -10 oC.
  7. La identificación de partículas de los liposomas se puede realizar utilizando un algoritmo de reconocimiento de partículas basado en Gaussian. La distribución e intensidad de partículas se analizan canal por canal. Una señal bicapida lipídica se utiliza como máscara para aislar partículas.

Resultados

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La proteína transmembrana reconstituida se difunde libremente y se distribuye homogéneamente en la membrana.

En la Figura 4se muestran imágenes de ejemplo de una bicapa lipídica y su fluidez lipídica validada por microscopía de epifluorescencia. La distribución de lípidos en bicaca antes y después de la fotoblancada se muestra en la Figura 4A,B. La homogeneidad de la bicapa lipídica se visualizó utilizando un microscopio de epifluorescencia antes y después de la reconstitución (Figura 4D,E). l-Opa1 reconstituido en bicapa lipídica fue validado por espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS). Utilizamos lípidos conjugados de tinte para evaluar la difusividad lipídica de la bicapas. Opa1 reconstituido fue etiquetado usando un anticuerpo C-terminal anti-Opa1 con etiqueta fluorescente. La difusión de lípidos bicapa se midió de 1,46 a 0,12 m2/s, mientras que el coeficiente de difusión de l-Opa1 reconstituido por bicapa fue de 0,88 a 0,10 m2/s. Lectura de intensidad de las curvas FCS indicadas 75% de l-Opa1 se reconstituye en la bicapa lipídica (Figura 4G,H). Estos resultados sugieren que l-Opa1 se difunde libremente en la bicapa lipídica con anclaje a polímeros con el potencial de autoensamblarse en complejos funcionales.

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Figura 4: Distribución de lípidos y proteína reconstituida en la membrana modelo.
(A-C) Imágenes de ejemplo de una bicapa lipídica y su fluidez lipídica validada por microscopía de epifluorescencia. (A) Distribución homogénea de lípidos en bicapida antes de la fotoblancada. (B) Instantánea inmediatamente después de la fotoblancha. (C) Bicacap imagen después de la recuperación de fluorescencia indica una buena fluidez lipídica de la membrana después de la reconstitución. (D,E) Las imágenes representativas de la distribución de lípidos antes (D), y después de (E) la reconstitución l-Opa1 indican que el proceso de reconstitución no creó defectos en la bicapa. Imagen representativa TIRF de l-Opa1 etiquetada con anticuerpo conjugado Alexa 488 (F) que muestra una distribución homogénea de Opa1 tras la reconstitución. G. Recuentos representativos de fotones en bruto de la señal l-Opa1 por espectroscopia de correlación fluorescente. En el control, no se reconstituyó l-Opa1 en la bicapa, mientras que se añadió y enjuagar anticuerpos. La difusión de l-Opa1 es significativamente más lenta que los lípidos en la membrana, consistente con la reconstitución exitosa de la transmembrana l-Opa1 (H). Barra de escala: 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El blanqueo de pasos de fluorescencia indicaba que se reconstituyeron un promedio de 2-3 copias de l-Opa1 en un liposoma determinado (Figura 5A,B). La distribución del tamaño de los proteoliposomas reconstituidos de Opa1 se probó después de la reconstitución utilizando DLS (Figura 5C). La reconstitución de Opa1 en proteoliposomas también se verificó utilizando FCS. El coeficiente de difusión de los anticuerpos libres fue de 164 a 22 m2/s; El coeficiente de difusión de los liposomas etiquetados con un tinte lipídico fue de 2,22 a 0,33 m2/s, y el coeficiente de difusión de los proteoliposomas l-Opa1 unidos a un anticuerpo anti-Su etiquetado con TexasRed fue de 2,12 a 0,36 m2/s.

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Figura 5: Fabricación y caracterización de proteoliposomas.
(A) Pasos en la fabricación de proteoliposomas con calceína encapsulada y apretada. (B) Los datos representativos del blanqueo fluorescente muestran un promedio de 2-3 copias de l-Opa1 incrustadas en el liposoma. (C) Distribuciones de tamaño representativos de proteoliposomas (rojo) sin nucleótidos 1 h después de la incubación de GTP (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Detección de tethering de membrana, desmezcla/hemifusión lipídica y apertura de poros por microscopía fluorescente.

El anclaje de membrana se controla observando la señal de TexasRed en la superficie de la bicapo lipídica mediante microscopía TIRF (Figura 6A). El comportamiento de la desmezcla de lípidos de membrana (hemifusión) fue monitoreado a través de TexasRed a medida que el tinte se difunde desde los liposomas en la bicapo lipídica. La morosen de calceína ayuda a distinguir la formación completa de poros de fusión de sólo la desmezcla de lípidos. Esto permite la comparación entre las condiciones en las que las partículas se estancan en la hemitión (Fig. 6B) y las partículas que proceden a la fusión completa (Figura 6C).

El anclaje de membrana está indicado por una señal lipídica estable de liposomas. La distancia podría evaluarse en función de la señal FRET entre las etiquetas de las dos membranas36. La señal de hemisfusión no tiene contracción en la señal de calceína(Figura 6B, fila inferior), pero una rápida descomposición de la señal TexasRed indica la difusión del tinte en la bicacapa lipídica(Figura 6B fila superior). La fusión completa (con abertura de poro) presenta tanto la descomposición de lípidos como la liberación de contenido (Figura 6C). TexasEn la intensidad y la intensidad de la calceína se pueden rastrear de una manera dependiente del tiempo para proporcionar detalles cuantitativos para la cinética de la fusión de membrana36.

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Figura 6: Resultados representativos que muestran el tethering de partículas (A, barra de escala de 10 m), hemicusión (B, barra de escala de 0,5 m) y fusión (C, barra de escala de 0,5 m).
(A) Proteoliposomas atados a la bicapa lipídica reconstituida por Opa1 antes de la adición de GTP. (B) Un ejemplo de hemumisión. La fila superior en B muestra desmezcla de lípidos (señal TexasRed, rojo), fila inferior en B no muestra ninguna liberación de contenido (señal de calceína, verde) bajo estas condiciones. (C) Un rastro representativo de fusión proteoliposoma con la bicapo lipídica. La liberación de contenido se puede observar a partir de imágenes en la fila inferior de mostrar la morosa de calceína (fila inferior, verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Los sistemas de membrana modelo in vitro pueden describir procesos de membrana complejos en condiciones bien definidas. Estos sistemas pueden distinguir los componentes mínimos necesarios para que los procesos moleculares complejos revelen los mecanismos moleculares6,,15,,20,,38. Para las proteínas de membrana, los liposomas y las bicapas con soporte plano son sistemas de reconstitución comunes. A diferencia de las bicapas lipídicas de apoyo sólido, el cojín de polímero entre el sustrato y la membrana soportada en bicapas con anclaje a polímeros permite la libre movilidad de grandes proteínas de membrana, y las proteínas transmembrana para difundir y ensamblar libremente34. Estas características nos ayudaron a investigar la cinética de la fusión de membrana interna de las mitocondrias36.

Preparamos una bicala de lípidos con anclaje a polímeros utilizando técnicas Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). Esto nos permite preparar una bicacapa con componentes lipídicos asimétricos. Las membranas celulares tienen composición asimétrica del prospecto, y el enfoque LB/LS permite el estudio de tales bicapas. Con la transferencia de Schaefer, un sustrato de vidrio entero puede ser cubierto por una bicapa lipídica. Es fundamental preparar una superficie limpia para la preparación de la bicacapa. Además, se necesita práctica para realizar una transferencia Schaefer correctamente. La transferencia de Schaefer sin éxito puede crear defectos no deseados en una bicapida lipídica. En este protocolo, la presión añadida al balance de la película es aplicable para una bicapia que contiene 20% de cardiolipina. Para bicapas con otros componentes, consulte la isotérmica de área de presión superficial de los componentes clave. Un método alternativo es el método de fusión Langmuir-Blodgett/vesicle (LB/VF), donde la monocapa lipídica inferior se transfiere desde la interfaz aire-agua de una vaguada Langmuir a un sustrato limpio, luego los liposomas se fusionan a la parte superior de la monocapa lipídica soportada y forman la bicapa final39. La reconstitución de proteínas de membrana utilizando el método LB/VF es más sencilla que LB/LS, ya que la reconstitución se puede realizar a través de la fusión de proteoliposomas. Sin embargo, la fusión de vesículas requiere la adición de liposomas excesivos, lo que puede complicar el estudio de eventos de membrana dependientes de interacciones proteína-proteína dependientes de la concentración.

La reconstitución exitosa de proteínas transmembranas en bicapas de lípidos con anclaje a polímeros y liposomas en una orientación funcional preferida es importante, pero difícil de aplicar. Los controles experimentales son necesarios para tener en cuenta esto. Para las bicapas de lípidos con anclaje a polímeros, también es importante mantener la integridad de la bicapela lipídica durante la reconstitución. Las concentraciones de surfactantes deben mantenerse relativamente bajas para evitar la disolución de la bicapía lipídica, pero lo suficientemente altas como para evitar la desnaturalización de la proteína de interés37,40. El método descrito aquí es ideal para reconstituir proteínas de membrana para estudios de una sola molécula, pero no es necesariamente escalable para estudios a gran escala. La elección de surfactante es otra consideración importante. Con frecuencia, el tensioactivo utilizado para la purificación y el almacenamiento es un buen punto de partida. La concentración máxima de surfactante suele ser 200 veces menor de la CMC36,en un rango en el que el tensioactivo mantiene la estabilidad de las proteínas y previene la agregación de proteínas, manteniendo la integridad de la membrana36. Se pueden considerar cócteles que contengan 2 o 3 tensioactivos. Para la reconstitución en liposomas, no es necesaria una baja concentración de surfactante. Sin embargo, las concentraciones de tensioactivos por debajo de CMC son preferibles para mantener un tamaño uniforme y la distribución morfológica de los liposomas. Para evitar fugas de tinte de contenido, es necesario dializar contra un tampón que contenga tinte.

A diferencia de los ensayos de fusión basados en liposomas, la plataforma que establecimos proporciona un enfoque para investigar la cinética de cada paso de la fusión de membrana. Este método proporciona la capacidad de estudiar las proteínas de fusión transmembrana en condiciones casi nativas. Las plataformas de membrana modelo se pueden aplicar para estudiar el ensamblaje y la oligomerización de proteínas de membrana, la "escultura" de membrana y las interacciones proteína-lípido de proteínas en entornos subcelulares, como la membrana interna mitocondrial. Este método también permite la exploración de condiciones fisiológicas importantes en la interacción entre membrana y proteína, como la asimetría de composición bicapo. Queda por definir el papel de un lípido mitocondrial clave, cardiolipina, en las propiedades bicapas de los liposomas y las bicapas apoyadas por polímeros. Propiedades tales como la resistencia iónica, espesor de la membrana, rigidez de la membrana, curvatura de membrana, y propiedades de viscosidad elástica de membrana todos pueden influir en la capacidad de las proteínas para montar en estados funcionales específicos. Estudios futuros que aplican creativamente los sistemas de membrana modelo tienen potencial para descubrir nuevos aspectos de la organización y función de la proteína de membrana.

Agradecimientos

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Los autores reconocen el apoyo del Premio de Investigación en Salud Infantil de la Fundación Charles H. Hood y el generoso apoyo del Departamento de Biología Molecular del Hospital General de Massachusetts.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cianina 5)Lípido polar AvantiCat #: 810335C1mgmarcadores fluorescentes de membrana
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio)Ávidos polares Avanti Cat#: 880130Pmoléculas lipídicas
1',3'-bis[1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo]-glicerol (sal de sodio)Avanti Polar lípidosCat #: 710335P moléculaslipídicas
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC)Avanti Lípidos PolaresCat #: 850375P Moléculaslipídicas
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminaAvanti Lípidos polaresCat #: 850757Plipídicas
Alexa Fluor 488 Kit de etiquetado de anticuerposThermoFisher ScientificA20181
Frasco ámbar con revestimiento de PTFEFisher scientific14-955-332viales de muestra para conservar los lípidos soluciones
CalceinSigma-AldrichCat #: C0875; PubChem Identificación de sustancias: 24892279tinte fluorescente
CloroformoFisher scientific298-500 / C295-4El cloroformo de la marca Fisher suele ser bastante confiable para los trabajos de lípidos.
Portaobjetos de concavidad (1 pocillo)Ciencia de la microscopía electrónica71878-05aplicado como portaobjetos Schaefer
Herramienta de análisis FCSSmith Lab, Universidad de Akronherramienta de software
Fiji /ImageJFijiSCR_002285herramienta de software
Fisherbrand Cover Glasses: CírculosFisher scientific12-545-102Cubreobjetos para bicapas lipídicas sólidas soportadas, el artículo ha sido descontinuado ya que los autores prepararon el manuscrito. Una alternativa es el vidrio de cubierta premium de la marca Fisher con número de catálogo: 12-548-5M
GTP Sal disódicaSIGMA-ALDRICH INCCat #: 10106399001
Langmuir & Langmuir-Blodgett CanalBiolin ScientifcKN2002
L-α-lysofosfatidilinositol (Hígado, Bovino) (sal sódica)Avanti Lípidos polaresCat #: 850091Plipídicas
Mini extrusoraAvanti Polar lípidos610020
n-Dodecil-β-D-MaltopyranósidoAnatraceCat #: D310 25 GMsurfactante para reconstitución
n-Octyl-α-D-GlucopiranósidoAnatraceCat #: O311HA 25 GMsurfactante para la reconstitución
de membranas de PC 0.2μ mAvanti Polar Lipids610006
Rabbit Anticuerpo anti-Opa1NOVUS BIOLOGICALSCat #: NBP2-59770anticuerpo para la detección de Opa1 C-terminal
Libro de diapositivasImágenes inteligentesRRID: SCR_014300herramienta de software
Cinta de sellado roscada de teflónCinta de taflón NC0636085 Fisher Scientific para el almacenamiento de muestras
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoetanolamina, sal de trietilamonio (Texas Red DHPE)ThermoFisher ScientificCat #: T1395MPmarcadores fluorescentes de membrana
moléculas moléculas

Referencias

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Lipid Bilayer FormationLangmuir Blodgett TechniqueProtein ReconstitutionFluorescence Correlation SpectroscopyTIRF MicroscopyLiposome ExtrusionOPA1 Fusion AssayAsymmetric Lipid CompositionMembrane Tethering Analysis

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