Imágenes ópticas basadas en fotodiodos para registrar dinámicas de red con resolución de una sola neurona en invertebrados no transgénicos

Resumen

Este protocolo presenta un método para obtener imágenes de la actividad de la población neuronal con resolución de una sola célula en especies de invertebrados no transgénicos utilizando colorantes sensibles al voltaje de absorbancia y una matriz de fotodiodos. Este enfoque permite un flujo de trabajo rápido, en el que las imágenes y el análisis se pueden realizar en el transcurso de un solo día.

Resumen

El desarrollo de preparaciones de invertebrados transgénicos en las que la actividad de conjuntos especificables de neuronas puede ser registrada y manipulada con luz representa un avance revolucionario para los estudios de la base neuronal del comportamiento. Sin embargo, una desventaja de este desarrollo es su tendencia a centrar a los investigadores en un número muy pequeño de organismos "diseñadores" (por ejemplo, C. elegans y Drosophila),lo que podría tener un impacto negativo en la realización de estudios comparativos en muchas especies, lo que es necesario para identificar los principios generales de la función de la red. El presente artículo ilustra cómo el registro óptico con colorantes sensibles al voltaje en los cerebros de especies de gasterópodos no transgénicos se puede utilizar para revelar rápidamente (es decir, dentro del curso del tiempo de experimentos individuales) características de la organización funcional de sus redes neuronales con resolución de una sola célula. Describimos en detalle los métodos de disección, tinción y registro utilizados por nuestro laboratorio para obtener rastros de potencial de acción de docenas a ~ 150 neuronas durante programas motores relevantes para el comportamiento en el SNC de múltiples especies de gasterópodos, incluida una nueva en neurociencia: el nudibranquio Berghia stephanieae. Las imágenes se realizan con tintes sensibles al voltaje de absorbancia y una matriz de fotodiodos de 464 elementos que toma muestras a 1.600 fotogramas / segundo, lo suficientemente rápido como para capturar todos los potenciales de acción generados por las neuronas registradas. Se pueden obtener múltiples grabaciones de varios minutos por preparación con poco o ningún blanqueamiento de señal o fototoxicidad. Los datos ópticos en bruto recopilados a través de los métodos descritos pueden analizarse posteriormente a través de una variedad de métodos ilustrados. Nuestro enfoque de registro óptico se puede utilizar fácilmente para sondear la actividad de la red en una variedad de especies no transgénicas, lo que lo hace muy adecuado para estudios comparativos de cómo los cerebros generan comportamiento.

Introducción

El desarrollo de líneas transgénicas de invertebrados como Drosophila y C. elegans ha proporcionado sistemas poderosos en los que las bases neuronales del comportamiento pueden ser interrogadas y manipuladas ópticamente. Sin embargo, estas preparaciones especiales pueden tener la desventaja de reducir el entusiasmo por los estudios de circuitos neuronales de especies no transgénicas, particularmente con respecto a la introducción de nuevas especies en la investigación de la neurociencia. Centrarse exclusivamente en uno o dos sistemas modelo va en detrimento de la búsqueda de principios generales de función de red, porque los estudios comparativos representan una ruta esencial por la que se descubren tales principios^1,2,3,4. Nuestro objetivo aquí es demostrar un enfoque de imágenes a gran escala para obtener una visión rápida de la estructura funcional de las redes neuronales de gasterópodos, en un esfuerzo por facilitar los estudios comparativos de la función de la red neuronal.

Los moluscos gasterópodos como Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea y otros se han utilizado durante mucho tiempo para investigar los principios de la función de la red neuronal, en gran parte porque sus comportamientos están mediados por neuronas grandes, a menudo identificables individualmente, ubicadas en la superficie de los ganglios, lo que las hace fácilmente accesibles a las técnicas de grabación⁵.  En la década de 1970, se desarrollaron colorantes sensibles al voltaje (VSD) que pueden integrarse en la membrana plasmática que pronto permitieron los primeros registros sin electrodos de los potenciales de acción generados por múltiples neuronas⁶. Aquí, demostramos nuestro uso de VSD para examinar la actividad de la red en varias especies de gasterópodos, incluido uno nuevo en neurociencia, Berghia stephanieae. El dispositivo de imagen es una matriz de fotodiodos (PDA) de 464 elementos disponible comercialmente que toma muestras a 1.600 fotogramas/segundo(Figura 1),que, cuando se utiliza con VSD de rápida absorbancia, revela los potenciales de acción de todas las neuronas registradas⁷. Las señales registradas por todos los diodos se muestran inmediatamente después de la adquisición y se superponen a una imagen del ganglio en el software de adquisición PDA, lo que permite investigar neuronas de interés con electrodos afilados en la misma preparación^8,9.

En los datos de PDA en bruto, muchos diodos registran redundantemente las neuronas más grandes, y muchos también contienen señales mixtas de múltiples neuronas. Un punto de inflexión fue el desarrollo de un método automatizado de clasificación de picos que utiliza el análisis de componentes independientes para procesar rápidamente cada conjunto de datos PDA de 464 canales en bruto en un nuevo conjunto de trazas, en el que cada neurona registrada aparece en un rastro separado que contiene solo sus potenciales de acción^10,11.

En este artículo describimos los pasos esenciales involucrados en la obtención de grabaciones de potencial de acción a gran escala de los sistemas nerviosos de los gasterópodos con una matriz de fotodiodos y VSD de rápida absorbancia.  Además, ilustramos métodos analíticos que pueden emplearse para agrupar y mapear las neuronas registradas ópticamente con respecto a sus conjuntos funcionales, y para caracterizar características a nivel de población que a menudo no son evidentes a través de una simple inspección de las trazas de disparo^12,13.

Protocolo

NOTA: El flujo de trabajo que se describe a continuación se resume en la Figura 2.

1. Minimizar la vibración

1. Si es posible, asegúrese de que la plataforma esté en la planta baja y use una mesa de aislamiento basada en resorte, que amortigua una gama más amplia de frecuencias de vibración que las mesas de aire.
2. Si usa una mesa basada en resortes, asegúrese de que esté flotando (debe ajustarse cada vez que uno agregue o quite algo de la mesa).
3. Reduzca el ruido basado en vibraciones en la sala de imágenes tanto como sea posible, incluso hasta el punto de apagar el flujo de aire durante la toma de imágenes si es necesario. Minimice cualquier vibración derivada de la turbulencia de fluidos en los sistemas de perfusión.
   NOTA: La preparación neuronal no debe moverse durante la adquisición. Los movimientos de cualquier tipo producen cambios de bordes de contraste a través de los diodos, lo que lleva a señales artificuales. Si el procedimiento implica un estímulo durante la adquisición, no debe inducir el movimiento de preparación.

2. Ejecute una prueba estenopeica para permitir la alineación adecuada de las fotos ganglionares con los datos de PDA

1. Coloque un trozo de papel de aluminio con 3 pequeños agujeros en él en un portaobjetos de microscopio. Toma una imagen de los tres agujeros con la cámara digital montada en su fotopuerto parfocal.
2. Usando el software de imágenes que viene con la PDA, adquiera un archivo corto (por ejemplo, 5 s). A mitad de la adquisición, toque la mesa para inducir artefactos de vibración que serán muy visibles alrededor de los bordes de los agujeros, lo que permitirá que la imagen de los agujeros se alinee con precisión con los datos ópticos.
3. Utilice la función Superponer en el software de imágenes, que se encuentra en el elemento de menú"Mostrar | Página Superponer | Superponer rastros con | de imagen externa Superponer imagen",para superponer los datos del diodo en la foto de los agujeros de alfiler, y luego ajustar iterativamente la configuración de x, y y ampliación de la foto hasta que los agujeros de alfiler se asienten directamente sobre los artefactos de agujero de alfiler en los datos del diodo.
   1. Guarde estos números para alinear las imágenes de preparación tomadas con la cámara con los datos del diodo en futuros experimentos.
      NOTA: La alineación estenopeica de la PDA solo debe realizarse una vez después de que la PDA esté montada en el microscopio, hasta que se gire o retire, momento en el que debe hacerse nuevamente.

3. Disecciones para tres especies de gasterópodos marinos

1. Para las especies que crecen a gran tamaño, como Tritonia y Aplysia,comience con individuos más pequeños, que tienen ganglios más delgados y menos opacos, lo que facilita la obtención de suficiente luz para una señal óptima a ruido.
2. Tenga agua de mar artificial filtrada lista para ser utilizada como solución salina para las disecciones y experimentos de imágenes.
   NOTA: En todos los pasos posteriores del protocolo, "solución salina" denota agua de mar artificial.
3. Disección de Tritonia diomedea
   1. Coloque un animal en el refrigerador durante unos 20 minutos para anestesiarlo.
   2. Para los animales más grandes, exponga el cerebro sosteniendo al animal en una mano, dejando que el extremo de la cabeza cubra el índice para exponer el "cuello". Para los animales más pequeños, fije el lado dorsal hacia arriba en un plato de disección forrado de cera antes de exponer el cerebro.
   3. Usando tijeras de disección, haga una incisión de línea media de 3-4 cm en el lado dorsal del animal, por encima de la masa bucal (que se puede sentir a través de la pared del cuerpo).
      NOTA: La porción necesaria del SNC, que consiste en ganglios cerebropleurales y pedales bilaterales fusionados, es de color naranja y de apariencia distinta del tejido circundante; se encuentra inmediatamente posterior a los rinóforos y encima de la masa bucal.
   4. Extirpa el SNC mediante la eliminación de los nervios que inervan el cuerpo del animal con pórceps y tijeras de microdisección, manteniendo intactos todos esos nervios que conectan los ganglios centrales. Deje una larga longitud de nervio del pedal 3 (PdN3), o cualquier nervio que se estimule.
   5. Use alfileres minutien para fijar el SNC en la parte inferior de un plato forrado con elastómero lleno de solución salina para una disección adicional. Mantenga la temperatura de preparación a 11 °C perfundiendo el plato con solución salina suministrada con un sistema de enfriamiento Peltier en línea controlado por retroalimentación utilizando una bomba peristáltica.
   6. Usando forrcepciones y tijeras de microdisección, retire cuidadosamente la capa de adherida del tejido conectivo de alrededor del SNC. Deje la vaia fina adherida estrechamente a los ganglios.
   7. Brevemente (~10 s) sumergir los ganglios en una solución de glutaraldehído al 0,5% en solución salina. Coloque los ganglios de nuevo en el plato forrado de elastómero perfundido con solución salina, permitiendo que la solución salina lave el glutaraldehído antes de comenzar la tinción de VSD.
      NOTA: Esta fijación ligera del tejido conectivo y sus músculos intrínsecos ayudará a prevenir el movimiento durante las imágenes.
4. Disección de Aplysia californica
   1. Anestesiar a un animal de aproximadamente 40 g inyectando ~ 20 ml de 350 mM MgCl₂ en el cuerpo a través de la superficie ventral (pie).
   2. Use alfileres para colocar el lado ventral del animal hacia arriba en un plato de disección forrado con cera.
   3. Usando tijeras de disección, haga una incisión de 2-3 cm en la línea media a lo largo de la extensión más anterior del pie. Fije los colgajos del pie a cada lado de la incisión para revelar parte del SNC y la masa bucal.
      NOTA: La porción necesaria del SNC, que consiste en ganglios cerebrales fusionados, y ganglios pleurales y pedales bilaterales estrechamente appuestos, es de color amarillo-naranja y de apariencia distinta del tejido circundante; se asienta dorsal y posterolateral a la masa bucal muscular bulbosa.
   4. Use pórceps y tijeras de disección para diseccionar cuidadosamente la masa bucal, revelando los ganglios cerebrales.
   5. Extirpa el SNC mediante la eliminación de los nervios que inervan el cuerpo del animal con pórceps y tijeras de microdisección, manteniendo intactos todos esos nervios que conectan los ganglios centrales. Deje una larga longitud de nervio del pedal 9 (PdN9), o cualquier nervio que se estimule.
   6. Use alfileres minutien para colocar el SNC en un plato forrado de elastómero relleno de solución salina. Mantenga la temperatura de preparación a 15-16 °C perfundiendo el plato con solución salina que pasa a través de un dispositivo de enfriamiento Peltier.
   7. Usando fórceps y tijeras de microdisección, elimine el exceso de tejido conectivo del SNC y diseccione una porción superficial de la hela en el ganglio o ganglios para obtener imágenes. Tenga cuidado durante este proceso para no hacer un agujero en la vaina, lo que resultaría en que las neuronas se derramen desde adentro.
   8. Brevemente (~20 s) sumergir los ganglios en una solución de glutaraldehído al 0,5% en solución salina. Coloque los ganglios de nuevo en el plato forrado de elastómero perfundido con solución salina, permitiendo que la solución salina lave el glutaraldehído antes de comenzar la tinción de VSD.
5. Disección de Berghia stephanieae
   1. Coloque un animal en el refrigerador durante unos 20 minutos para anestesiarlo.
   2. Usando un plato forrado de elastómero lleno de solución salina a temperatura ambiente, coloque alfileres minutien tanto en la cabeza como en la cola.
   3. Usando tijeras de microdisección, haga una incisión dorsal de 5-7 mm superficial al SNC.
      NOTA: Los ojos, manchas oscuras que residen dentro del animal al lado del SNC, marcan convenientemente la posición de la porción necesaria del SNC, que consiste en ganglios cerebropleurales y de pedal bilateralmente fusionados y se asienta sobre la masa bucal.
   4. Extirpa el SNC mediante la eliminación de los nervios que inervan el cuerpo del animal con pórceps y tijeras de microdisección. Deje que cualquier nervio que se estimule el tiempo suficiente para un electrodo de succión.

4. Manche la preparación con un tinte sensible al voltaje

1. Prepare soluciones de stock de RH155 (también conocido como NK3041) o RH482 (también conocido como NK3630 o JPW1132).
   1. RH155: Disolver 5,4 mg de colorante sólido en 1 mL de EtOH al 100%, pipeteando 29 μL en cada uno de los 34 tubos de microcentrífuga. Con el contenido de cada tubo expuesto al aire, déjelos secar durante la noche en la oscuridad. Tapar y colocar las alícuotas sólidas resultantes de RH155, cada una conteniendo 0,15 mg, en un congelador de -20 °C.
   2. RH482: Disolver 2 mg de colorante sólido en 100 μL de DMSO, dividir la solución en 20 alícuotas de 5 μL, cada una conteniendo 0,1 mg de RH482, y almacenar en un congelador de -20 °C.
      NOTA: Para Tritonia y Aplysia,se puede utilizar la perfusión de baño o la aplicación de presión para cargar el VSD RH155 en las membranas de las neuronas en la preparación. La aplicación de presión tiene la ventaja de exponer solo el ganglio que se está fotografiando al VSD.
2. Para la perfusión en baño, agregue 5 ml de solución salina a cada una de las dos alícuotas anteriores de RH155 sólido y vórtice en solución, produciendo una solución combinada de 10 ml que contenga 0,03 mg / ml RH155.
   1. Perfusión en la oscuridad (para evitar el fotobleaching) durante 1 a 1,5 h a 11 °C para Tritonia y a 16 °C para Aplysia. Mantenga la temperatura pasando la solución de perfusión a través de un sistema de enfriamiento Peltier.
3. Para la aplicación a presión, agregue 500 μL de solución salina a una alícuota de RH155 y vórtice para producir una concentración de colorante de 0,3 mg / ml.
   1. Extraiga aproximadamente 200 μL de la solución en tubos de polietileno utilizando un microdispensador de mano, asegurándose de que haya una buena coincidencia entre el diámetro del tubo y el diámetro del ganglio a teñir.
   2. Use un micromanipulador para colocar cuidadosamente el extremo del tubo sobre el ganglio objetivo, bajándolo hasta que forme un sello ajustado en el ganglio. Utilice el tipo de sistema de enfriamiento descrito anteriormente para mantener los ganglios a la temperatura deseada.
   3. Atenúe las luces de la habitación para evitar el fotoblanqueo y gire la perilla del aplicador del microdispensador cada 5 minutos para forzar más tinte en el ganglio.
   4. Verifique a los 30 minutos para confirmar que se está produciendo una buena tinción y luego continúe durante un tiempo total de tinción de aproximadamente 1 h.
4. Para la tinción en Berghia,agregue 1 ml de solución salina a una alícuota congelada de RH482 y vórtice para disolver.
   1. Transferir 200 μL de esta solución a un tubo de microcentrífuga que contiene 800 μL de solución salina y vórtice en solución, produciendo una solución de tinción final de 0,02 mg/ml RH482 en solución salina con DMSO al 0,1%.
   2. Coloque todo el SNC en el tubo de la microcentrífuga, envolviendo el tubo en papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo, y agite a mano cada 5-6 minutos durante aproximadamente 1 h. Guarde los 800 μL restantes de la primera solución en el refrigerador y úselos hasta por 3 días para manchar las preparaciones posteriores.

5. Aplanar la preparación y prepararse para la estimulación nerviosa

NOTA: Los pasos de esta sección deben realizarse con una iluminación mínima o con luz verde para minimizar el fotobleaching.

1. Después de la tinción, sumerja el SNC en solución salina dentro de la cámara de imágenes y colóquelo bajo un microscopio de disección.
2. Coloque trozos de silicona (para Tritonia o Aplysia)o gotas de vaselina (para Berghia)a la izquierda y derecha del ganglio / ganglio para ser fotografiadas.
3. Presione una pieza del tamaño adecuado de una cubierta de vidrio o plástico sobre la preparación para aplanarla. Presione con firmeza pero no tan fuerte como para dañar las neuronas.
   NOTA: Aplanar la superficie convexa de la preparación de esta manera hará que un mayor número de neuronas sean parfocales, aumentando así el número de neuronas registradas, y además ayudará a inmovilizar la preparación durante la obtención de imágenes.
4. Si estimula un nervio para provocar un programa motor ficticio, prepare un electrodo de succión cuya punta frontal sea aproximadamente tan ancha como el diámetro del nervio. Logre esto fundiendo cuidadosamente un segmento de tubo de polietileno PE-100 sobre una llama mientras tira suavemente de ambos extremos del segmento de tubo y luego corta el cónico resultante en el punto deseado.
   1. Extraiga un pequeño volumen de solución salina a través del extremo cónico de un electrodo de succión de polietileno, seguido del extremo del nervio a estimular, uniendo una longitud de tubo de polímero flexible de paredes gruesas al extremo posterior del electrodo y utilizando la succión bucal para aplicar presión negativa.
   2. Confirme que la solución salina en el electrodo carece de burbujas que podrían interrumpir la conducción eléctrica.

6. Preparación y optimización para la obtención de imágenes

1. Mueva la cámara a la plataforma de imágenes. Inicie la perfusión salina a través de la cámara de grabación y coloque la sonda de temperatura cerca de la preparación. Ajuste el controlador de temperatura para la temperatura deseada para las especies que se están fotografiando (para Tritonia,11 °C, para Aplysia,15-16 °C, o para Berghia,26-27 °C).
2. Coloque un cable de plata cloruro por el electrodo de succión, asegurándose de que entre en contacto con la solución salina en el electrodo, y coloque el otro cable Ag-AgCl (la ruta de retorno) en la solución salina del baño, cerca del electrodo de succión.
3. Baje la lente de inmersión en agua en la solución salina. Cierre el diafragma base y luego suba o baje el condensador de la subetapa y ajuste el enfoque hasta que los bordes del diafragma estén bien enfocados, creando una iluminación de Köhler.
   1. Concéntrese en la región de la preparación para ser fotografiada. Sesgo centrado en las neuronas más pequeñas sobre las más grandes, ya que las señales ópticas que se originan en las neuronas más grandes tienen más probabilidades que las más pequeñas de registrarse, incluso si están ligeramente desfocadas.
   2. Tome una foto del ganglio para ser fotografiado con la cámara digital parfocal.
   3. Con el interruptor de ganancia del panel de control configurado en 1x, inspeccione la intensidad de la luz en reposo (RLI) en el software de imágenes haciendo clic en el botón "RLI"y verificando el RLI promedio de los diodos. Ajuste el nivel de voltaje enviado desde un estimulador a la fuente de alimentación de la lámpara LED y continúe verificando el nivel promedio de RLI hasta que esté en el rango deseado (generalmente alrededor de 3-4 V).
      NOTA: Los RLIs altos, correspondientes a aproximadamente 3-4 V en el PDA, son deseables. Cuanto mayor sea la luz, mejor será la relación señal-ruido de las señales ópticas, sin embargo, esto debe equilibrarse con una tasa más rápida de fotobleaching a RLIs más altos. Este riesgo se minimiza mediante el uso de lentes de objetivo de alto NA. Las lentes de objetivo de inmersión en agua utilizadas son 10x/0.6 NA, 20x/0.95 NA, 40x/0.8 NA y 40x/1.15 NA.
4. Configure el interruptor de ganancia del panel de control a 100x para la grabación.
5. Si estimula un nervio, establezca el voltaje, la frecuencia y la duración deseados en un estimulador separado del utilizado para establecer el nivel de luz. Confirme que la activación TTL entre el panel de control y el estimulador está configurada correctamente.
   NOTA: Los parámetros de estímulo nervioso de muestra en cada especie son los siguientes: Tritonia PdN3, 2 s, tren de pulsos de 10 Hz de 5 ms, pulsos de 10 V; Aplysia PdN9, 2.5 s, tren de pulsos de 20 Hz de 5 ms, pulsos de 8 V; un nervio de pedal Berghia, 2 s, tren de pulsos de 10 Hz de 5 ms, pulsos de 5 V.
6. Verifique que el resorte o la mesa de aire estén flotando.

7. Grabación óptica

1. Apague o atenúe las luces de la habitación, incluida cualquier iluminación fluorescente superior.
2. Establezca la duración deseada del archivo, la ruta y el nombre del archivo, y luego haga clic en el botón "Tomar datos" en el software de imágenes para adquirir archivos hasta la capacidad de la RAM disponible de la computadora. Permanezca quieto durante la grabación óptica, ya que pequeñas vibraciones pueden introducir grandes artefactos en los datos de grabación óptica.
   NOTA: Para adquisiciones que excedan la RAM disponible de la computadora, un programa de adquisición de C ++ personalizado está disponible a través del Dr. Jian-young Wu de la Universidad de Georgetown.
3. Para ver los datos inmediatamente después de la adquisición, utilice la función Superimponer en el software de imágenes para superponer los datos recopilados por los 464 diodos sobre la imagen del ganglio tomada antes de la preparación⁷. Haga clic en cualquiera de los diodos representados en el software para expandir lo que grabaron en una pantalla de seguimiento separada.
   1. Lograr la alineación exacta de los diodos con respecto a la preparación ingresando los factores x, y y de aumento según lo determinado previamente por la prueba estenopeica.
   2. Para maximizar la visibilidad del potencial de acción y mejorar el rendimiento de las neuronas para la posterior clasificación de picos^14,imponga un filtro Butterworth de paso de banda con cortes de 5 Hz y 100 Hz (disponible en el software de imágenes) para eliminar el ruido de baja y alta frecuencia.
   3. Para guardar los datos ópticos filtrados como un archivo de texto para su posterior análisis en una plataforma de computación científica, primero seleccione el cuadro "Filtro TP" justo debajo de la pantalla "Página" en el software de imágenes. Luego, seleccione "Guardar página como ASCII" en la pestaña "Salida" e ingrese el nombre de archivo deseado en el cuadro de diálogo que aparece.

Resultados

Tritonia
El contacto de la piel con su depredador estrella de mar desencadena el nado de escape de Tritonia diomedea, que consiste en una serie rítmica de flexiones de todo el cuerpo que lo impulsan a un lugar seguro(Figura 3A). En preparaciones cerebrales aisladas, un breve estímulo para pedalear el nervio 3 (PdN3) provoca el programa motor de natación rítmica (SMP) para este comportamiento, que es fácilmente reconocible en las grabaciones ópticas de los ganglios del pedal. La Figura 3B muestra el diseño de un experimento de imágenes VSD diseñado para registrar la actividad de disparo de las neuronas en la superficie dorsal del ganglio del pedal izquierdo de Tritonia, sobre el cual se colocó el PDA, como un estímulo para que el PdN3 contralateral (derecha) provoque el SMP. Los datos brutos y filtrados (filtro Butterworth de paso de banda, cortes de 5 y 100 Hz) de 20 diodos que registran la actividad antes, durante y después de la estimulación de PdN3 se muestran en las Figuras 3C, D, respectivamente. El estímulo nervioso se entregó 20 s en el archivo de 2 minutos. Inmediatamente después de la adquisición, las señales medidas por los 464 diodos de la matriz de grabación se pueden mostrar topográficamente sobre una imagen de la preparación en el software de imágenes(Figura 3E). En este punto, muchos rastros contienen picos registrados redundantemente de las mismas neuronas, y algunos rastros contienen picos de más de una neurona. La clasificación por picos de las trazas de diodos filtrados con ICA produjo 53 trazas neuronales únicas, 30 de las cuales se muestran en la Figura 3F. La cinética de los picos individuales se puede apreciar en la Figura 3G,que amplía un extracto de cuatro trazas de la Figura 3F (cuadro rojo); la precisión del algoritmo de clasificación de picos ICA se verificó previamente utilizando grabaciones simultáneas de electrodos afilados, que mostraron que todos los picos en los rastros clasificados corresponden a picos registrados intracelularmente de neuronas individuales^11,14.

Aplysia
Un estímulo de cola fuertemente aversivo a Aplysia californica provoca una respuesta de escape rítmica estereotipada de dos partes¹⁵. La primera fase de la respuesta es un galope de varios ciclos de estocadas en la cabeza y tirones de la cola que mueven al animal rápidamente hacia adelante. Esto es típicamente seguido por un período de gateo, que implica ondas repetidas de contracciones musculares de cabeza a cola que impulsan al animal hacia adelante a una velocidad más lenta durante varios minutos(Figura 4A). Para capturar estos programas motores de escape en grabaciones ópticas, el PDA se centró en la superficie dorsal del ganglio del pedal derecho en una preparación cerebral aislada, y se colocó un electrodo de succión en el nervio del pedal contralateral (izquierdo) 9 (PdN9; Figura 4B). Un minuto después de una grabación óptica continua de 20 minutos(Figura 4C),PdN9 fue estimulado para obtener la secuencia del programa motor de galope-arrastre. Las distribuciones espaciales gaussianas probabilísticas de las señales de las 81 neuronas registradas se mapearon en el ganglio(Figura 4D). La reducción de dimensionalidad aplicada a la grabación completa reveló que las fases galope (cian) y rastreo (azul oscuro) del programa de escape ocuparon áreas distintas y formaron diferentes trayectorias, en espiral y bucle, respectivamente, en el espacio de componentes principales(Figura 4E).

Tres videos basados en la grabación de Aplysia representada en la Figura 4 demuestran otros tipos de análisis que se pueden realizar en dichos conjuntos de datos. El video 1 anima el disparo de todas las neuronas grabadas durante toda la duración de la grabación. El período postestimulante inicial del programa motor de escape se caracterizó por un galope, en el que la actividad en el ganglio estuvo marcada por la explosión alterna de diferentes cúmulos funcionales(Video 2). Posteriormente, el galope pasó a un rastreo, en el que la actividad a través de los grupos neuronales permaneció ampliamente fásica, pero asumió una trayectoria de rotación en sentido contrario a las agujas del reloj en el ganglio(Video 3). Los dos últimos videos también incorporan agrupamiento de consenso, que revela el disparo y las ubicaciones de los diferentes conjuntos funcionales para las fases de galope y rastreo de la respuesta de escape por separado. Nótese que muchas neuronas asignadas al mismo cúmulo tanto en la fase de galope como en la de arrastre exhibieron proximidad física entre sí en el ganglio, consistente con hallazgos previos¹².

Berghia
El nudibranquio eólido Berghia stephanieae (Figura 5A)representa un nuevo sistema modelo para la neurociencia. La configuración de imágenes para un experimento típico de Berghia se muestra en la Figura 5B. Para provocar actividad neuronal a gran escala, se colocó un electrodo de succión en el nervio del pedal izquierdo más prominente, y se entregó un estímulo nervioso 30 s en una grabación de 2 minutos. Los rastros procesados por ICA revelaron actividad espontánea y evocada por estímulos en 55 neuronas(Figura 5C). La detección de la comunidad a través de la agrupación por consenso identificó diez conjuntos funcionales distintos, que se representan en la Figura 5D en un gráfico de red y en la Figura 5E,que reorganiza los rastros que se muestran en la Figura 5C en función de sus asignaciones de agrupación en clústeres. Las distribuciones gaussianas de las señales de todas las neuronas registradas se superponen a una imagen de la preparación en la Figura 5F para indicar las posiciones de las 55 neuronas registradas.

Figura 1: Vistas de la plataforma de imágenes ópticas y la matriz de fotodiodo (PDA). (A)La plataforma de imágenes ópticas, con la PDA, la cámara digital, el microscopio y el escenario. (B)El diseño interno de la PDA, en el que la fibra óptica conecta la apertura de la imagen a 464 fotodiodos. Una fila de amplificadores se encuentra sobre los fotodiodos. (C) La cara hexagonal de la abertura de la imagen, en la que se enfoca el área que se está fotografiando. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Un diagrama de flujo que ilustra el flujo de trabajo esencial en la obtención de grabaciones ópticas. Los pasos esenciales en el protocolo de imágenes VSD, desde la disección y la tinción hasta los detalles de las imágenes, se representan en este diagrama de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados de Tritonia diomedea, que ilustrandatos enbruto, filtrados y ordenados por picos. (A) Tritonia escapando de la estrella de mar depredadora Pycnopodia helianthoides a través de su nado, que consiste en alternar flexiones dorsales y ventrales del cuerpo. (B) Esquema de la configuración de imágenes. Ce=lóbulo cerebral del ganglio cerebropleural; Pl = lóbulo pleural del ganglio cerebropleural; Pd = ganglio de pedal. (C) Datos brutos de 20 fotodiodos, que muestran la actividad en el ganglio del pedal izquierdo para la estimulación del PdN3 contralateral (estímulo indicado por la flecha). (D) Datos filtrados de los mismos diodos que en C (filtro Butterworth de paso de banda de 5 y 100 Hz). (E) Salida de software de imágenes en la que los rastros comprimidos recogidos por los 464 diodos se superponen topográficamente sobre una imagen de la preparación. Las posiciones de los 20 diodos cuyas huellas se muestran en C y D están resaltadas en rojo. (F) Treinta trazas seleccionadas de una sola neurona generadas por la clasificación de picos a través de ICA. (G)Una vista ampliada de cuatro trazas de una sola neurona, correspondientes al cuadro rojo en F,muestra sus potenciales de acción a mayor resolución temporal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resultados de Aplysia californica,que ilustran el registro de larga duración, el mapeo de señales y la reducción de la dimensionalidad. (A) Las dos fases del programa motor de escape secuencial de Aplysia, el galope y el arrastre. (B) Esquema de la configuración de imágenes. Ce = ganglio cerebral; Pl = ganglio pleural; Pd = ganglio de pedal. (C) Un registro de 20 minutos de 81 neuronas en el ganglio del pedal derecho que responden a un estímulo al PdN9 contralateral (indicado por la flecha). Las barras verdes, cian y azul oscuro debajo de los rastros indican el período previo al estímulo, el galope y las fases de arrastre del programa motor de escape, respectivamente. (D) Una imagen de la preparación con distribuciones gaussianas probabilísticas mapeadas de las ubicaciones de las 81 fuentes de señal neuronal identificadas por ICA. El contorno verde representa la posición de la cara hexagonal del PDA con respecto al ganglio. Los números en cada gaussiano corresponden a los números de traza en C. (E) Reducción de la dimensionalidad mediante el análisis de componentes principales que traza los tres primeros componentes principales entre sí en el transcurso del archivo de 20 minutos. Las épocas de línea de base, galope y rastreo preestimuladores se muestran en verde, cian y azul oscuro, respectivamente. Vea los Videos 1-3 para ver las animaciones de disparo neuronal correspondientes a esta grabación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resultados de Berghia stephanieae,una nueva especie para la neurociencia, que ilustra la gráfica de redes, la agrupación funcionaly el mapeo de señales bilaterales. (A) Un espécimen de Berghia. (B) Esquema de la configuración de imágenes. Ce = lóbulo cerebral del ganglio cerebropleural; Pl = lóbulo pleural del ganglio cerebropleural; Pd = ganglio de pedal; Rh = ganglio de rinóforo. (C) Trazas que muestran la actividad espontánea y evocada por estímulos de 55 neuronas bilaterales en los ganglios cerebropleurales (la entrega del estímulo se indica con la flecha). (D) Un gráfico de red que muestra los diez conjuntos funcionales, cada uno asignado a un color único, identificado a través de la agrupación por consenso. Los nodos en esta gráfica representan neuronas, donde la distancia en el espacio de red representa el grado de correlación de disparo dentro y entre conjuntos. (E) Las trazas en C se reorganizan y codifican por colores (siguiendo el esquema de color de D)en conjuntos funcionales. (F) Una imagen de la preparación que muestra las ubicaciones mapeadas de las señales de cada neurona registrada, y los números traza en C y E a los que corresponden. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Animación del programa locomotor de escape Aplysia completo de 20 minutos. La opacidad de las formas blancas que recosan 81 neuronas individuales en el ganglio del pedal derecho (panel izquierdo) fue impulsada por los rastros neuronales correspondientes (panel derecho) y varió linealmente en función de la tasa de pico promedio (agrupada por cada 0,61 s de tiempo real en la grabación). Para cada neurona, la opacidad completa se normalizó a su velocidad máxima de disparo durante la duración de la grabación. Un segundo de tiempo transcurrido en el video representa 12.2 s de tiempo real. La barra de escala corresponde al tiempo real, con las líneas verde, cian y azul oscuro debajo de las trazas que indican las fases de línea de base previa al estímulo, galope y arrastre del programa locomotor de escape, respectivamente. Los cuadros amarillos alrededor de la fase de galope y una parte de la fase de rastreo indican los extractos de grabación utilizados para generar las animaciones en los videos 2 y 3. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar).)

Video 2: Animación de la fase galopante del programa locomotor de escape Aplysia. Se realizó un agrupamiento por consenso en las 81 neuronas registradas en solo la fase galopante del programa motor para derivar los conjuntos funcionales, utilizando el enfoque y el software descritos y puestos a disposición en la ref.^12. Los conjuntos neuronales que exhiben patrones de disparo en gran parte tónicos o irregulares durante esta fase del programa de escape se omitieron de este video. Los potenciales de acción de las neuronas pertenecientes a los conjuntos negro y verde oliva se pueden escuchar en la pista de audio del video, con las neuronas y rastros correspondientes resaltados. Las tasas de pico promedio se normalizaron como en el Video 1 y con un binning de tiempo equivalente; 1 s de tiempo transcurrido en el vídeo corresponde a 6,1 s de tiempo real. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar).)

Video 3: Animación de la fase de rastreo del programa locomotor de escape Aplysia. La agrupación por consenso se realizó en las 81 neuronas registradas en solo la fase de rastreo del programa motor para derivar los conjuntos funcionales. Los conjuntos que exhiben patrones de disparo en gran parte tónicos o irregulares durante esta fase del programa motor se omitieron de este video. Las tasas de pico promedio se normalizaron como en los Videos 1 y 2 y con un binning de tiempo equivalente; 1 s de tiempo transcurrido en el video corresponde a aproximadamente 12.2 s de tiempo real. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar).)

Discusión

Uno de los detalles más importantes en la implementación de nuestro enfoque de imágenes VSD a gran escala es minimizar la vibración, que produce movimientos de bordes de contraste a través de los diodos, lo que resulta en grandes señales artificuales. Debido a que los VSD de absorbancia producen cambios porcentuales muy pequeños en la intensidad de la luz con potenciales de acción, los artefactos de vibración, si no se previenen, pueden oscurecer las señales neuronales de interés. Empleamos varios métodos para minimizar los artefactos de vibración. En primer lugar, nuestra sala de imágenes está situada en la planta baja, lo que aísla la preparación de las vibraciones relacionadas con los equipos de tratamiento de aire del edificio y muchas otras fuentes. En segundo lugar, se utilizó una mesa de aislamiento basada en resorte, que otros usuarios de PDA han confirmado que proporciona una mejor amortiguación de vibraciones que la mesa de aire más común¹⁶. En tercer lugar, se utilizaron objetivos de inmersión en agua, que eliminan las fluctuaciones de imagen derivadas de las ondulaciones superficiales. Cuarto, la preparación que se está fotografiando se presionó ligeramente entre la parte inferior de la cubierta de la cámara y un fragmento de la cubierta presionada hacia abajo desde arriba que se mantiene en su lugar mediante tapones de silicona o vaselina, estabilizando aún más la preparación. Esto también aplana la superficie convexa del ganglio o ganglio que se está fotografiando, lo que resulta en más neuronas en el plano de enfoque del objetivo, lo que aumenta el número de neuronas registradas.

Para maximizar la relación señal-ruido para los cambios muy pequeños en el grado de absorbancia de la luz VSD resultantes de un potencial de acción, es esencial lograr una luz casi saturada a través de la preparación de la PDA, mientras que al mismo tiempo se minimiza el fotobleaching del tinte. Con este fin, normalmente trabajamos a 3-4 V de intensidad de luz en reposo, medida con el interruptor de ganancia del panel de control PDA en la posición 1x (los amplificadores 464 de la PDA se saturan a 10 V de luz). Durante la adquisición de datos, este factor de ganancia se cambia a 100x. Obtener suficiente luz para alcanzar 3-4 V según lo medido por la PDA se puede lograr de varias maneras. Primero, use una fuente de luz LED ultrabright que ofrezca una longitud de onda adecuada a las propiedades de absorción del tinte de absorbancia en uso. En consecuencia, se utilizó una lámpara colimada LED de 735 nm, que se superpone con las longitudes de onda de absorción óptimas de RH155 y RH482. En segundo lugar, si es necesario, use un condensador de subetapa abatible que concentre la luz de la fuente de luz LED en un área más pequeña. En tercer lugar, ajuste la altura del condensador para lograr una iluminación Köhler, que garantiza un brillo alto y uniforme y una calidad de imagen máxima. Cuarto, asegúrese de que no haya filtros de calor en la vía óptica, que puedan atenuar la longitud de onda de 735 nm de la lámpara LED. Quinto, retire los difusores, si se necesita más luz, de la vía óptica. En sexto lugar, utilizar objetivos de alto NA, que proporcionen una alta resolución espacial y permitan niveles suficientes de luz para alcanzar la PDA a intensidades de lámpara más bajas. Esto nos ha permitido minimizar el fotobleaching en la medida en que podemos obtener varios archivos de adquisición de 10-20 min de duración por preparación utilizando la misma intensidad de luz en todos los archivos y sin una pérdida significativa de amplitud de señal o la necesidad de volver a teñir. Crucialmente, si el experimentador desea rastrear las neuronas a través de estos archivos más largos, asegúrese de que el plano focal no cambie y que la preparación no se mueva. Finalmente, una forma adicional de dirigir suficiente luz al PDA es usar animales más jóvenes, que tienen ganglios más delgados y, por lo tanto, menos opacos.

De vez en cuando encontramos que la relación señal-ruido de las señales ópticas se deteriora y/o los ritmos del programa motor son subóptimos (por ejemplo, lentos o anormales). Cuando esto comienza a ocurrir de manera consistente, mezclamos nuevas soluciones de VSD. Las alícuotas de VSD generalmente permanecen viables durante aproximadamente 6 meses en un congelador de -20 ° C. Relacionadamente, vale la pena señalar que para Berghia,los mejores resultados se han obtenido hasta ahora con la absorbancia VSD RH482. Como RH482 es más lipofílico que RH155, puede teñir mejor las neuronas comparativamente más pequeñas de Berghiao permanecer en las membranas neuronales de manera más efectiva a la temperatura salina de registro más alta utilizada para esta especie tropical.

Una limitación de las imágenes basadas en PDA de la actividad neuronal se relaciona con el acoplamiento de CA de las señales de voltaje en el hardware antes del paso de preamplificación de 100x: aunque esto representa una característica necesaria para eliminar el gran desplazamiento de CC producido por el alto nivel de luz en reposo requerido por esta técnica, el acoplamiento de CA intrínseco al PDA impide la medición de cambios lentos en el potencial de membrana, como las asociadas a las entradas sinápticas. Si se desea registrar cambios potenciales lentos o en estado estacionario, se puede utilizar un sistema de imágenes de cámara CMOS acoplado a CC para capturar la actividad sublindera. Byrne y sus colegas utilizaron recientemente tal configuración con RH155 para obtener imágenes de la actividad de las neuronas en el ganglio bucal de Aplysia^17,18. Hemos utilizado ambos sistemas y hemos encontrado que la cámara CMOS, debido a su densidad mucho mayor de detectores (128 x 128), genera archivos de datos 50 veces más grandes para el mismo tiempo de imagen⁷. Los archivos más pequeños de la PDA facilitan un procesamiento y análisis más rápidos. Esto también permite grabaciones extendidas de un solo ensayo(Figura 4)y estudios de aprendizaje, en los que los datos de múltiples ensayos se concatenan en un archivo grande antes de la clasificación de picos, lo que permite rastrear la organización de la red a medida que se desarrolla el aprendizaje¹⁹.

En otras investigaciones basadas en cámaras, Kristan y sus colegas han utilizado VSD fluorescentes para examinar la función de red en los ganglios segmentales de la sanguijuela. En un estudio influyente esto llevó a la identificación de una neurona involucrada en la decisión del animal de nadar o gatear²⁰. En otro estudio, Kristan et al. examinaron la medida en que los comportamientos de natación y gateo de la sanguijuela son impulsados por circuitos multifuncionales frente a circuitos dedicados²¹. Más recientemente, Wagenaar y sus colegas utilizaron un microscopio de dos lados para obtener imágenes de voltaje que les permite registrar de casi todas las neuronas en un ganglio segmentario de sanguijuela²². A diferencia de muchos métodos de imágenes basados en cámaras, una ventaja de nuestro método de imágenes basado en PDA es la clasificación rápida e imparcial de picos por ICA, una forma de separación de fuente ciega que no implica decisiones sobre los límites neuronales para el procesamiento de resultados.

Con respecto a la elección de los VSD, una ventaja de los colorantes de absorbancia RH155 y RH482 es la poca o ninguna fototoxicidad asociada con ellos²³,^24,lo que permite tiempos de grabación más largos que los típicos para los VSD fluorescentes. Además, los VSD de rápida absorbancia que utilizamos son adecuados para registrar los potenciales de acción somática en preparaciones de gasterópodos, que suelen tener una amplitud de 80 mV. Como se muestra en la Figura 3G,nuestro método óptico puede registrar subgiros de potencial de acción (ninguna de nuestras grabaciones está promediada por trazas): esto sugiere que los VSD que utilizamos deberían poder discernir los potenciales de acción en otros sistemas de modelos que se atenúan hasta cierto punto y, por lo tanto, no se sobrepasan en el momento en que alcanzan el soma. Sin embargo, nuestro enfoque óptico puede no ser ideal para especies que se sabe que exhiben potenciales de acción altamente atenuados cuando se registran en el soma.

Gran parte de la investigación actual sobre redes neuronales se está centrando en un pequeño número de especies transgénicas de diseño. Sin embargo, la neurociencia se beneficia del estudio de una amplia variedad de especies filogenéticamente distintas. El estudio de muchas especies diferentes proporciona información sobre cómo evolucionan los circuitos^25,26e ilumina los principios de la función de red que pueden ser comunes en los^{filos 1,2,3,4,27.} Hasta ahora hemos aplicado nuestro método de imagen a una serie de especies de gasterópodos, incluyendo Aplysia californica^{8,11,12,13,14,28}, Tritonia diomedea^{8,9,11,14,19,28}, Tritonia festiva²⁸, Pleurobranchaea californica (datos no publicados), y más recientemente Berghia stephanieae (Figura 5). Un atractivo de este enfoque es que se puede aplicar fácilmente a muchas especies, sin necesidad de animales transgénicos. Queremos reconocer que nuestro uso de imágenes VSD con tintes de rápida absorbancia y una PDA sigue los pasos de un trabajo pionero que logró esto en preparaciones semi-intactas, comportándose Navanax²⁹ y Aplysia^30. Nuestro énfasis en la rapidez de nuestro enfoque es en parte una respuesta a las preocupaciones de que muchos investigadores pueden ser cada vez más reacios a iniciar estudios de red en nuevas especies debido al temor de que sean necesarios años de estudio para caracterizar la organización básica de la red antes de poder explorar cuestiones científicas de amplio interés para la neurociencia³¹. En consecuencia, nuestro objetivo aquí es demostrar una técnica que acelere en gran medida el proceso, hasta el punto de que se puedan obtener información significativa el mismo día sobre la organización de la red a partir de preparaciones individuales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Condensador oscilante Acromático 0.9 NA	Nikon	N/A
Controlador de temperatura bipolar	Warner Instruments	CL-100 con SC-20	Controla la temperatura salina de perfusión
Termómetro de cámara	Physitemp	BAT-12 con microsonda
Cámara digital	Optronics	S97808
Pinza de disección	Dumont	#5
Tijeras de disección	American Diagnostic Corp.	ADC-3410Q
Microscopio de imagen	Olympus	BX51WIF
Cámara de perfusión de imágenes	Siskiyou	PC-H
Instant Ocean	Instant Ocean	SS6-25	Produce 25 galones a la vez
Estimulador de pulsos Master-8	A.M.P.I.	Master-8
Microdispensador	Drummond Scientific	3-000-752	Aplicador de colorante para tinción a presión
Tijeras de microdisección	Moria	15371-92
Pines Minutien (0,1 mm)	Fine Science Tools	NC9677548	Para el posicionamiento y la estabilización CNS
Plataforma de microscopio motorizada	Thorlabs	GHB-BX	Plataforma Gibraltar
Software de imagen NeuroPlex	RedShirtImaging	NeuroPlex	Compatible con la matriz de fotodiodos WuTech
Lentes de objetivo	Olympus	XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW UAPON40XW340
PE-100 Tubo de polietileno	VWR	63018-726	Tubo para fabricar electrodos de aspiración
Bomba de perfusión	Instech	P720 con juego	de tubos DBS062SDBSU
Vaselina	Equate	NDC 49035-038-54
Matriz de fotodiodos con panel de control	Matriz de fotodiodos WuTech Instruments 469-IV Póngase	en contacto con jianwu2nd@gmail.com para obtener información sobre pedidos
RH155	Santa Cruz Biotechnology	sc-499432	Tinte sensible al voltaje
RH482	Univ of Conn. Health Center	JPW-1132	Tinte sensible al voltaje; pedido especial de Leslie Leow
Tapones de silicona para los oídos	Mack's	Model 7	Para usar en la preparación
Tinción Tubo de PE	VWR	63018-xxx	Diferentes tamaños según el ajuste
Kit de elastómero de silicona Sylgard 184	Dow Corning		elastómero de silicona Sylgard 184
Thorlabs LED y controlador	Thorlabs	M735L2-C1, lámpara LED DC2100	y driver
Tygon tubing	Fisher Scientific	14-171-xxx
Mesa de aislamiento de vibraciones	Kinetic Systems	MK26	A base de muelle