Este protocolo proporciona métodos para la visualización de células bacterianas y polisacáridos del locus de síntesis de polisacáridos (Psl) dentro del esputo de pacientes con fibrosis quística.
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Artículo de método
Visualización de Pseudomonas aeruginosa en el esputo de pacientes con fibrosis quística
En este artículo
Resumen
Resumen
La detección temprana y la erradicación de Pseudomonas aeruginosa en los pulmones de los pacientes con fibrosis quística pueden reducir la posibilidad de desarrollar una infección crónica. El desarrollo de infecciones crónicas por P. aeruginosa se asocia con una disminución de la función pulmonar y un aumento de la morbilidad. Por lo tanto, existe un gran interés en dilucidar las razones del fracaso en la erradicación de P. aeruginosa con terapia antibiótica que ocurre en aproximadamente el 10-40% de los pacientes pediátricos. Uno de los muchos factores que pueden afectar la eliminación del huésped de P. aeruginosa y la susceptibilidad a los antibióticos son las variaciones en la organización espacial (como la agregación o la formación de biopelículas) y la producción de polisacáridos. Por lo tanto, nos interesaba visualizar las características in situ de P. aeruginosa en el esputo de pacientes con FQ. Se aplicó una técnica de limpieza de tejidos a las muestras de esputo después de incrustar las muestras en una matriz de hidrogel para retener las estructuras 3D relativas a las células huésped. Después de la limpieza del tejido, se agregaron etiquetas fluorescentes y colorantes para permitir la visualización. Se realizó hibridación fluorescente in situ para la visualización de células bacterianas, unión de anticuerpos anti-Psl marcados con fluorescencia para la visualización del exopolisacárido y tinción de DAPI para teñir las células huésped para obtener información estructural. Estos métodos permitieron obtener imágenes de alta resolución de P. aeruginosa dentro del esputo de pacientes con FQ mediante microscopía de barrido láser confocal.
Introducción
En este estudio, se diseñaron experimentos para visualizar la estructura in vivo de Pseudomonas aeruginosa dentro del esputo de pacientes pediátricos con fibrosis quística (FQ). Las infecciones por P. aeruginosa se vuelven crónicas en el 30-40% de la población pediátrica con FQ; Una vez que las infecciones crónicas se establecen, son casi imposibles de eliminar1. Los aislados de P. aeruginosa de pacientes con infección temprana son generalmente más susceptibles a los antimicrobianos, por lo tanto, estos se tratan con antibióticos antipseudomonales para prevenir el establecimiento de infección crónica....
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Protocolo
Se requiere la aprobación de la Junta de Ética en Investigación (REB, por sus siglas en inglés) para recolectar y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Los estudios presentados en este documento fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB#1000058579.
1. Recolección de esputo
- Almacenar el esputo expectorado en un recipiente de recogida estéril y conservar inmediatamente a 4 °C durante un máximo de 24 h antes de la fijación.
NOTA: Dejar el esputo demasiado tiempo a 4 °C sin fijación puede provocar la degradación celular, en particular la degradación de los glóbulos blancos. Es preferible la fijación lo ant....
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Resultados
El diseño general del experimento se resume en la Figura 1 y la Figura 2. La Figura 1 proporciona un resumen de los protocolos de procesamiento y eliminación del esputo. El procesamiento y la eliminación del esputo pueden tardar hasta 17 días. Sin embargo, el protocolo puede detenerse y las muestras se pueden almacenar después de la fijación con PFA (día 2) o después de la limpieza del tejido (días 5-17 dependiendo del tiempo de lim.......
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Discusión
El propósito de este protocolo es permitir vislumbrar la organización in situ de las células de P. aeruginosa en el esputo de pacientes con FQ. Las muestras de esputo deben almacenarse a 4 °C hasta que se procesen si no pueden fijarse inmediatamente. Se ha demostrado que el número de células de P. aeruginosa en el esputo no cambia significativamente si se procesa a 1 h, 24 h o 48 h, cuando se almacena a 4 °C, aunque si se deja a 25 °C durante 24 o 48 h, los recuentos de células bacterianas aumentarán si.......
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Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Fundación de Fibrosis Quística que proporcionó fondos para esta investigación y a MedImmune por su generosa donación de anticuerpos anti-Psl0096. Para este estudio, las imágenes se realizaron en el centro de imágenes CAMiLoD de la Universidad de Toronto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acrilamida 29:1 Bisacrilamida, solución al 30 % | BioRad | 161-0146 | |
| Cubreobjetos de 8 cámaras Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Cámaras de perfusión Coverwell | Electrónica Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnasa Inhibidor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCCCCCCTTGC | Eurofins | Detalles del pedido: Producto: Oligo de ADN modificado; Nombre: PseaerA; Secuencia: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Síntesis: 50 nmol; Purificación: HPLC; Estado del barco: Producción completa (seco) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | Los anticuerpos rojos Psl0096-Texas fueron un regalo amablemente proporcionado por Medimmune y se debe contactar a la empresa para consultas sobre pedidos. | |
| VA-044 Endurecedor | Wako | 27776-21-21 |
Referencias
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
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Reimpresiones y permisos
