Artículo de método

Una Tubería Bioinformática Para La Investigación De La Evolución Molecular Y La Expresión Génica Usando RNA-seq

DOI:

10.3791/61633

⸱

28 de mayo de 2021

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

En este artículo

Resumen

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El propósito de este protocolo es investigar la evolución y expresión de genes candidatos utilizando datos de secuenciación de ARN.

Resumen

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Destilar y reportar grandes conjuntos de datos, como datos de genoma completo o transcriptoma, es a menudo una tarea desalentadora. Una forma de desglosar los resultados es centrarse en una o más familias de genes que son importantes para el organismo y el estudio. En este protocolo, se describen los pasos bioinformáticos para generar una filogenia y cuantificar la expresión de genes de interés. Los árboles filogenéticos pueden dar una idea de cómo los genes están evolucionando dentro y entre las especies, así como revelar la ortología. Estos resultados se pueden mejorar utilizando datos de ARN-seq para comparar la expresión de estos genes en diferentes individuos o tejidos. Los estudios de evolución molecular y expresión pueden revelar modos de evolución y conservación de la función génica entre especies. La caracterización de una familia de genes puede servir como trampolín para futuros estudios y puede destacar una familia de genes importante en un nuevo genoma o transcriptoma.

Introducción

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Los avances en las tecnologías de secuenciación han facilitado la secuenciación de genomas y transcriptomas de organismos no modelo. Además de la mayor viabilidad de secuenciar adn y ARN de muchos organismos, una gran cantidad de datos está disponible públicamente para estudiar genes de interés. El propósito de este protocolo es proporcionar pasos bioinformáticos para investigar la evolución molecular y la expresión de genes que pueden desempeñar un papel importante en el organismo de interés.

Investigar la evolución de un gen o familia de genes puede proporcionar información sobre la evolución de los sistemas biológicos. Los miembros de un....

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Protocolo

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Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de UC Irvine.

1. Preparación de la biblioteca de ARN-seq

  1. Aísle el ARN usando los métodos siguientes.
    1. Recoger muestras. Si el ARN se va a extraer en un momento posterior, congele la muestra o colótese en la solución de almacenamiento de ARN15 (Tabla de Materiales).
    2. Eutanasiar y diseccionar el organismo para separar tejidos de interés.
    3. Extraer el ARN total utilizando un kit de extracción y purificar el ARN utilizando un kit de purificación de ARN(Tabla de materiales)
      NOTA: Existen protocol....

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Resultados

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Los métodos anteriores se resumen en la Figura 1 y se aplicaron a un conjunto de datos de tejidos de Hydra vulgaris. H. vulgaris es un invertebrado de agua dulce que pertenece al filo Cnidaria que también incluye corales, medusas y anémonas de mar. H. vulgaris puede reproducirse asexualmente por gemación y pueden regenerar su cabeza y pie cuando están divididos en dos. En este estudio, el objetivo fue investigar la evolución y expresión de los genes de la .......

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Discusión

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El propósito de este protocolo es proporcionar un contorno de los pasos para caracterizar a una familia del gene usando datos del ARN-seq. Se ha demostrado que estos métodos funcionan para una variedad de especies y conjuntos de datos4,34,35. La tubería establecida aquí se ha simplificado y debería ser lo suficientemente fácil como para ser seguida por un novato en bioinformática. La importancia del protocolo es que describe tod.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad y Aline G. Rangel por su asesoramiento y orientación para incorporar algunos de estos pasos en nuestro flujo de trabajo. También estamos agradecidos a Katherine Williams, Elisabeth Rebboah y Natasha Picciani por los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación médica de la Fundación George E. Hewitt para A.M.M.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bioanalizador-kit de ADNAgilent5067-4626 materiales delaboratorio húmedo
Bioanalizador-kit de ARNAgilent5067-1513materiales de laboratorio húmedo
BLAST+ v. 2.8.1En clúster de ordenadores*
https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO (en su PC)En el ordenador local
https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0En el clúster de computadoras
Bowtie v. 1.0.0En el clúster de computadoras
https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
Clúster de computación (muy recomendado)NOTA: Los análisis de datos genómicos se realizan mejor en un clúster de computación de alto rendimiento porque los archivos son muy grandes.
Gemelos v. 2.2.1En el clúster
ordenadores edgeR v. 3.26.8 (en R)En Rstudio
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0En el clúster
de ordenadores Java v. 11.0.2En el clúster de ordenadores
MEGA7 (en su PC)En el ordenador local
https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1En el ordenador local
https://www.megasoftware.net
Kit NucleoSpin RNA IIMacherey-Nagel740955.5Materiales de laboratorio húmedo
Perl 5.30.3En el clúster
ordenadores pythonEn el clúster de ordenadores
Qubit 2.0 FluorímetroThermoFisherQ32866materiales de laboratorio húmedo
R v.4.0.0En clúster de ordenador
https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlaterThermoFisherAM7021materiales de laboratorio húmedo
Kit RNeasyQiagen74104materiales de laboratorio húmedo
RSEM v. 1.3.0Software informático
https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335En el equipo local
https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3Software de computadora
SRA Toolkit v. 2.8.1En el clúster de computadoras
https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0cEn el clúster de computadoras
https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4dEn clúster de computadoras
https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0En clúster de computadoras
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35En clúster de computadoras
http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5En clúster de computadoras
https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzolThermoFisher15596018materiales de laboratorio húmedo
TruSeq Kit de preparación para bibliotecas de ARN TruSeq v2IlluminaRS-122-2001materiales de laboratorio húmedo
Kit TURBO sin ADNThermoFisherAM1907materiales
de laboratorio húmedo
* Las descargas y la instalación en el clúster de computadoras pueden requerir acceso de root. Póngase en contacto con el administrador de la red.
de de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
  2. Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene ortholo....

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