Artículo de método

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

DOI:

10.3791/61640

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19 de agosto de 2020

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1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

En este artículo

Resumen

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Aquí, describimos un método de limpieza simple, barato y rápido para resolver la estructura 3D del tejido adiposo blanco humano y de ratón utilizando una combinación de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células inmunitarias, neuronas y proteínas de la capa de gotas de lípidos mediante imágenes fluorescentes.

Resumen

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La obesidad es un importante problema de salud pública en todo el mundo que aumenta el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2 y enfermedades hepáticas. La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa del tejido adiposo (AT) debido a la hiperplasia de adipocitos y/o hipertrofia, lo que conduce a una profunda remodelación de su estructura tridimensional. De hecho, la capacidad máxima de AT para expandirse durante la obesidad es fundamental para el desarrollo de patologías asociadas a la obesidad. Esta expansión AT es un importante mecanismo homeostático para permitir la adaptación a un exceso de ingesta de energía y para evitar el derrame de lípidos nocivos a otros órganos metabólicos, como el músculo y el hígado. Por lo tanto, entender la remodelación estructural que conduce al fracaso de la expansión AT es una cuestión fundamental con alta aplicabilidad clínica. En este artículo, describimos un método de limpieza simple y rápido que se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para explorar la morfología del ratón y el tejido adiposo blanco humano por imágenes fluorescentes. Este método de compensación AT optimizado se realiza fácilmente en cualquier laboratorio estándar equipado con una capucha química, un agitador orbital con temperatura controlada y un microscopio fluorescente. Además, los compuestos químicos utilizados están fácilmente disponibles. Es importante destacar que este método permite resolver la estructura 3D AT manchando varios marcadores para visualizar específicamente los adipocitos, las redes neuronales y vasculares, y la distribución de células inmunitarias innatas y adaptativas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa de tejido adiposo y se ha convertido en un importante problema de salud pública en todo el mundo, dado que las personas con obesidad tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2, enfermedades hepáticas y algunos tipos de cáncer.

Una función fisiológica fundamental del tejido adiposo es modular la glucosa de todo el cuerpo y la homeostasis lipídica1,2. Durante el período de alimentación, los adipocitos (es decir, las células principales del tejido adiposo) almacenan el exceso de glucosa y lípidos proporcionado por una comida en triglicéridos. Durante el ayuno, los adipocitos descomponen los triglicéridos en ácidos grasos no esterificados y glicerol para mantener la demanda de energía del cuerpo. Durante el desarrollo de la obesidad, el tejido adiposo se expande aumentando el tamaño (hipertrofa) y/o el número (hiperplasia) de adipocitos1,para aumentar su capacidad de almacenamiento. Cuando la expansión del tejido adiposo alcanza su límite, una constante altamente variable entre los pacientes, los lípidos restantes se acumulan en otros órganos metabólicos incluyendo músculos e hígado3,,4, lo que conduce a su fracaso funcional e inicia complicaciones cardio-metabólicas relacionadas con la obesidad1,,5. Por lo tanto, identificar los mecanismos que rigen la expansión del tejido adiposo es un desafío clínico clave.

Las modificaciones morfológicas documentadas dentro de los tejidos adiposos durante la obesidad están vinculadas a su disfunción patológica. Se han utilizado varios procedimientos de tinción para describir la organización tisular del tejido adiposo, incluyendo actina6,marcadores vasculares7, marcadores de gotas de lípidos8, y marcadores específicos de células inmunitarias9,10. Sin embargo, debido al enorme diámetro de los adipocitos (50 a 200 m)11, es esencial analizar una gran parte de todo el tejido en tres dimensiones con el fin de analizar con precisión los dramáticos cambios estructurales de AT observados durante la obesidad. Sin embargo, debido a que la luz no penetra en un tejido opaco, no es posible tomar imágenes en 3D dentro de una gran muestra de tejido utilizando microscopía de fluorescencia. En la literatura se han notificado métodos de limpieza de tejidos para hacerlos transparentes (para una revisión, véase12), lo que permite limpiar los tejidos y realizar una microscopía de fluorescencia de tejido entero en profundidad. Estos métodos ofrecen oportunidades sin precedentes para evaluar la organización celular 3D en tejido sano y enfermo. Cada uno de los métodos descritos tiene ventajas e inconvenientes, y por lo tanto debe ser cuidadosamente seleccionado dependiendo del tejido estudiado (para una revisión, ver13). De hecho, algunos enfoques requieren un largo período de incubación y/o el uso de materiales o compuestos que sean caros, tóxicos o difíciles de obtener14,,15,,16,,17,,18,,19. Aprovechando uno de los primeros compuestos utilizados hace un siglo por Werner Spalteholz para limpiar los tejidos20,hemos establecido un protocolo fácil de usar y económico que está muy bien adaptado para la limpieza de todos los depósitos de tejido adiposo humano y ratón en cualquier laboratorio con equipos típicos que incluyen una capucha química, un agitador orbital controlado por temperatura y un microscopio confocal.

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Protocolo

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Este protocolo fue probado y validado para todos los depósitos de ratón y tejido adiposo blanco humano. Los tejidos adiposos humanos y de ratón fueron recogidos en consecuencia a las leyes europeas y aprobados por los comités éticos franceses y suecos.

1. Fijación del ratón y el tejido adiposo blanco humano

  1. Sumerja el ratón cosechado o los tejidos adiposos blancos humanos en al menos 10 ml de PBS que contengan un 4% de paraformaldehído (PFA) en un tubo de plástico de 15 ml.
  2. Agitar el tubo de plástico a temperatura ambiente en una placa de rodadura durante 1 h.
  3. Deje el tubo de plástico a 4 oC en una placa enrollable durante la noche, para completar la fijación.
    NOTA: Este protocolo está adaptado para muestras de tejido adiposo grandes, como las almohadillas de grasa epidídmica enteras obtenidas de ratones alimentados con una dieta normal (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Para muestras más grandes como almohadillas epidídmicas de grasa obtenidas de ratones alimentados con una dieta alta en grasas (≈1,5 g - ≈4 cm3) o muestras de tejido adiposo humano, aunque el protocolo de compensación debería funcionar perfectamente para toda la muestra (ampliando la PFA y las mezclas de anticuerpos), en general, cortamos piezas de tejido alrededor de 1 g (≈2,5 cm3)para reservar las muestras restantes ya sea para tinciones adicionales o aplicaciones. Para el PFA (paso 1.1.) recomendamos usar aproximadamente 10 veces el volumen del tejido. Para las mezclas de anticuerpos (pasos 3.1. y 3.4.), aumente el volumen para sumergir completamente el tejido y utilice un tubo de plástico de 15 ml (ver Tabla de Materiales)si el tejido es demasiado grande para un microtubo de plástico de 1,5 ml (ver Tabla de materiales).

2. Permeabilización y saturación del ratón y el tejido adiposo blanco humano

  1. Enjuague el tejido adiposo blanco fijo en 10 ml de PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los restos de PFA.
  2. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,3% de glicina (ver Tabla de materiales)y agitar el tubo a temperatura ambiente en un agitador orbital durante 1 h a 100 revoluciones por minuto (rpm) para apagar los grupos de aldehídos libres restantes.
  3. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100 (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37oC en un agitador orbital con temperatura controlada durante 2 h a 100 rpm.
  4. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100 y un 20% de DMSO (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante la noche.
  5. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,1% de interpolación-20 (ver Tabla de Materiales),0,1% Tritón X-100, 0,1% desoxicolato (ver Tabla de Materiales)y 20% DMSO y agitar el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos 24 h.
  6. Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Triton X-100 y agitar el tubo a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 1 h.
  7. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante 12 h, para saturar cualquier sitio que no pueda enlazar específicamente anticuerpos.
    NOTA: En el paso 2.7, la BSA puede sustituirse por el suero sanguíneo de las especies del anticuerpo secundario utilizado.

3. Procedimiento de tinción para ratón y tejido adiposo blanco humano

  1. Transfiera el tejido en un microtubo plástico de 1,5 ml que contenga 300 l de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100, un 10% de DMSO, un 3% de BSA y los anticuerpos primarios (10 veces más concentrados que para la tinción por criocirios, pero se debe evaluar la concentración óptima de anticuerpos para cada anticuerpo). Proteja el tubo de la luz cubriendo con papel de aluminio y agite el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos dos días (véase la nota en los pasos 1.1 y paso 3.7.1).
  2. Enjuague el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agite el tubo protegido de la luz a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante 5 h. Realice este paso dos veces.
  3. Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante una noche a dos días.
  4. Transfiera el tejido a un microtubo de plástico de 1,5 ml que contenga 300 l de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100, un 10% de DMSO, un 3% de BSA y los anticuerpos secundarios (10 veces más concentrados que para la tinción por criocirión). Proteja el tubo de la luz cubriendo con papel de aluminio y agite el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos dos días (véase la nota en los pasos 1.1 y paso 3.7.1).
  5. Enjuague el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agite el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante 5 h. Realice este paso dos veces.
  6. Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante una noche a dos días.
  7. Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante 2 h.
    NOTA: Para el etiquetado de estructuras específicas como núcleos o actina, añadir 4o,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI o equivalente) y/o el fluorescente etiquetado-phalloidin deben añadirse en el paso 3.1. cuando sólo se utilizan anticuerpos primarios con etiqueta fluorescente, o en el paso 3.4. cuando se utilizan anticuerpos secundarios.
    NOTA: Para el procedimiento de tinción, se pueden utilizar anticuerpos primarios ya conjugados con fluorocromos (como los utilizados para la citometría de flujo) y lo recomendamos para la ganancia de tiempo y especificidad. De hecho, incluso si los anticuerpos primarios del ratón pueden ser utilizados seguidos de anticuerpos anti-ratón secundarios, como lo demostramos aquí, a menudo hemos observado tinción no específica de los vasos sanguíneos debido a la inmunoglobulina circulante. Por lo tanto, para evitar este problema, los anticuerpos primarios que ya están etiquetados son muy recomendables y aquí proporcionamos evidencia de que los anticuerpos utilizados en la citometría de flujo son compatibles con nuestro procedimiento. Sin embargo, en el caso específico de un antígeno que se expresa en niveles bajos, un paso de amplificación de señal a través de anticuerpos secundarios es obligatorio; cuando el único anticuerpo primario disponible se hace en ratón, una perfusión cardíaca de los ratones con PBS durante al menos 5 minutos en el sacrificio puede eliminar una gran proporción de inmunoglobulina circulante y, por lo tanto, la tinción no específica.

4. Procedimiento de limpieza para el ratón y el tejido adiposo blanco humano

  1. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 50% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.
  2. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 70% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.
  3. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 95% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.
  4. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 100% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.
  5. Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 100% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante la noche.
  6. Sumergir el tejido en una botella de vidrio de 20 ml con una tapa de plástico (ver tabla de materiales) que contenga 5 ml de salicilato de metilo (ver Tabla de materiales)bajo una capucha química y agitar el recipiente de vidrio, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante al menos 2 h.
    NOTA: El procedimiento de compensación podría acelerarse significativamente (si fuera necesario) evitando los pasos 4.3. y 4.5., aunque la calidad final de compensación se reduciría ligeramente.

5.3D-confocal imágenes de tejido adiposo blanco transparente

  1. Transfiera el tejido a una cámara de imágenes metálicas equipada con un fondo de vidrio (ver Tabla de Materiales)bajo una capucha química y llene la cámara con salicilato de metilo fresco.
    NOTA: Para asegurar el tejido en su lugar, y así evitar que flote o se mueva hacia los lados en la cámara, aplique múltiples cubreobjetos de vidrio redondos de 18 mm (ver Tabla de Materiales)en la parte superior del tejido al montarlo en la cámara.
  2. Coloque la cámara de imágenes en un microscopio confocal invertido.
  3. Imagen del tejido utilizando un objetivo de baja ampliación (por ejemplo, objetivo 4x) para generar unos pocos cm3 mapas 3D de todo el tejido adiposo o de la muestra de tejido humano.
  4. Seleccione varias áreas para el muestreo de tejido con mayor aumento. Normalmente, utilice un objetivo de aire de larga distancia de 20x que proporcione una buena relación entre resolución y profundidad. Adquirimos grandes imágenes de mosaico con pilas z de entre 600 y 2000 m de profundidad.
    NOTA: Utilice un objetivo de larga distancia para profundizar en el tejido.

6. Extracción de resultados cuantitativos de las imágenes de tejido adiposo 3D

NOTA: La segmentación de las diferentes estructuras y la posterior extracción de la información cuantitativa de la pila de imágenes 3D generada en el punto 5 se pueden realizar utilizando cualquiera de las muchas opciones de software de análisis de imágenes existentes, ya sea comercial o freeware. En los siguientes puntos, describimos una estrategia que se utiliza habitualmente en nuestro laboratorio para extraer información cuantitativa de imágenes de tejido adiposo 3D utilizando software comercial (ver Tabla de materiales).

  1. Convierta las pilas 3D en el formato de software para liberar espacio de memoria.
  2. Segmente las celdas.
    1. Abra el módulo Cell del software.
    2. Cambie el ajuste de Detección celular a Tinción de membrana plasmática.
    3. Elija el canal fluorescente del marcador utilizado para delinear la periferia celular (phalloidina que etiqueta la actina cortical o marcadores de membrana plasmática como F4/80 para macrófagos, TCR-β para células T o racimo de proteínas CD de diferenciación específicas para subtipos de células inmunitarias).
    4. Configure los umbrales y proporcione un rango de tamaño de celda esperado (es decir, de 1 a 200 m para la detección de celdas).
    5. Ejecute la segmentación. Se generará un volumen correspondiente a la pila z con las celdas segmentadas codificadas por colores con un color diferente para cada una de las celdas vecinas.
    6. Aplicar filtros estadísticos (tamaño, redondez, circularidad, etc.) en la pestaña estadística para excluir artefactos de segmentación y/o refinar las celdas segmentadas a la célula de interés en función de su tamaño (es decir, 20-200 m para los adipocitos; 5-25 m para macrófagos; 1-3 m para linfocitos).
    7. Extraiga medidas y datos cuantitativos (volumen, número, tamaño, diámetro, etc.) de la pestaña de estadísticas.
  3. Segmente componentes celulares (núcleos, vesículas, etc.) o vasos como estructura.
    NOTA: Aunque la segmentación del filamento es muy útil para estudiar la conectividad de los recipientes, utilizamos la segmentación del módulo de superficie para extraer datos sobre el tamaño, volumen y diámetros de los recipientes. De hecho, la cuantificación de los tamaños de los recipientes se pierde cuando se utiliza el módulo de filamentos.
    1. Abre el módulo Surface del software.
    2. Seleccione el canal fluorescente del marcador utilizado para etiquetar específicamente el componente subcelular para reconstruirlo en 3D.
    3. Configure los umbrales y proporcione un rango del tamaño de diámetro esperado de la estructura (es decir, 0,5-5 m para núcleos; 0-100 m para recipientes; etc.).
    4. Ejecute la segmentación. Se generará un volumen con la estructura celular segmentada. Las mediciones y los datos cuantitativos (volumen, número, tamaño, diámetro, etc.) se pueden extraer de la pestaña de estadísticas.
  4. Segmentar los vasos como un continuo tubular.
    NOTA: Aunque la segmentación del filamento es muy útil para estudiar la conectividad de los recipientes, utilizamos la segmentación del módulo de superficie para extraer datos sobre el tamaño, volumen y diámetros de los recipientes. De hecho, la cuantificación de los tamaños de los recipientes se pierde cuando se utiliza el módulo de filamentos.
    1. Abra el módulo Filamentos del software.
    2. Seleccione el canal fluorescente correspondiente a la tinción del recipiente.
    3. Configure los umbrales para la intensidad de fluorescencia y seleccione el número adecuado de nodos de conexión esperados.
    4. Ejecute la segmentación. Los filamentos que representan la red de buques se generarán en 3D. Las mediciones se pueden extraer de la pestaña de estadísticas, lo que permite obtener datos cuantitativos, incluida la longitud del buque, el número de ramificaciones de los buques, etc.

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Resultados

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Usando el procedimiento descrito aquí y resumido en la Figura 1,pudimos manchar y limpiar ópticamente el tejido adiposo blanco humano y ratón como se presenta en la Figura 2A y la Figura 2B,respectivamente. El tejido transparente se transfirió a la cámara de imágenes metálicas para realizar imágenes confocales(Figura 3A). El aclaramiento mejoró drásticamente la profundidad de las imágenes tisulares que ...

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Discusión

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Las modificaciones que se producen dentro del tejido adiposo a lo largo de la progresión patológica, como la de la obesidad, son fundamentales para la comprensión de los mecanismos detrás de la patología. Estudios pioneros que revelaron estos mecanismos en el tejido adiposo se han basado en enfoques globales como la proteómica entera del tejido adiposo21,la citometría de flujo22,,23,y la transcriptómica24,,

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el INSERM, Universidad De Costa Azul, y con subvenciones de la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través de las Inversiones para el Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), el programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) a través de Academy 2 "Syst-mes Complexes" y Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", La Fundación para la Recherche Médical (quipe FRM DEQ20180839587), y el Programa de Jóvenes Investigadores a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos también el Fondo Básico de Imagen del C3M financiado por el Conseil Départemental des Alpes-Maritimes y la Région PACA, y que también cuenta con el apoyo de la Plataforma de Microscopía e Imagen de IBISA (MICA). Agradecemos a Marion Dussot por la ayuda técnica en la preparación de tejidos. Agradecemos a Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, por la lectura comprobante del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microtubos de 1,5 mLTubos Eppendorff - Dutscher33528
Tubos de plástico de 15mL Tubos Falcon - Dutscher352096
cubreobjetos de vidrio redondos de 18 mmMariendfeld0117580
Frasco de vidrio de 20 mlWheaton986546
anticuerpo conjugado anti-mouse-alexa647Jackson ImmunoResearch715-605-150Dilución: 1/100
anti-conejo-Alexa647-anticuerpo conjugadoJackson ImmunoResearch711-605-152Dilución: 1/100
BSASigma-aldrichA6003
CD301-PE anticuerpo BiolegendBLE145703Dilución: 1/100
Anticuerpo CD31AbCamab215912Dilución: 1/50
Software comercial de análisis 3D - InstrumentoIMARIS Oxfordcon módulo de célula
Microscopio confocal - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306Concentración de stock: 5 mg/mL; dilución 1/1000
DesoxicolatoSigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Anticuerpo Glut4Santa Cruzsc-53566Dilución: 1/50
GlicinaSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1 Concentración deexistencias : 2 y micro; g/µ L; Inyección intravenosa: 50 y micro; L/mices
Cámara de imagen metálica equipada con fondo de cristal - Cámara AttoFluorThermofisherA7816
Salicilato de metiloSigma-aldrichM6752
Anticuerpo de perilipinaProgen651156Dilución: 1/50
Faloidina-alexa488ThermoFisherA12379Dilución: 1/100
Anticuerpo TCR-β-PBBiolegendBLE109225Dilución: 1/100
TH anticuerpoAbCamab112Dilución: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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