Aquí, describimos un método de limpieza simple, barato y rápido para resolver la estructura 3D del tejido adiposo blanco humano y de ratón utilizando una combinación de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células inmunitarias, neuronas y proteínas de la capa de gotas de lípidos mediante imágenes fluorescentes.
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Artículo de método
Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D
En este artículo
Resumen
Resumen
La obesidad es un importante problema de salud pública en todo el mundo que aumenta el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2 y enfermedades hepáticas. La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa del tejido adiposo (AT) debido a la hiperplasia de adipocitos y/o hipertrofia, lo que conduce a una profunda remodelación de su estructura tridimensional. De hecho, la capacidad máxima de AT para expandirse durante la obesidad es fundamental para el desarrollo de patologías asociadas a la obesidad. Esta expansión AT es un importante mecanismo homeostático para permitir la adaptación a un exceso de ingesta de energía y para evitar el derrame de lípidos nocivos a otros órganos metabólicos, como el músculo y el hígado. Por lo tanto, entender la remodelación estructural que conduce al fracaso de la expansión AT es una cuestión fundamental con alta aplicabilidad clínica. En este artículo, describimos un método de limpieza simple y rápido que se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para explorar la morfología del ratón y el tejido adiposo blanco humano por imágenes fluorescentes. Este método de compensación AT optimizado se realiza fácilmente en cualquier laboratorio estándar equipado con una capucha química, un agitador orbital con temperatura controlada y un microscopio fluorescente. Además, los compuestos químicos utilizados están fácilmente disponibles. Es importante destacar que este método permite resolver la estructura 3D AT manchando varios marcadores para visualizar específicamente los adipocitos, las redes neuronales y vasculares, y la distribución de células inmunitarias innatas y adaptativas.
Introducción
La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa de tejido adiposo y se ha convertido en un importante problema de salud pública en todo el mundo, dado que las personas con obesidad tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2, enfermedades hepáticas y algunos tipos de cáncer.
Una función fisiológica fundamental del tejido adiposo es modular la glucosa de todo el cuerpo y la homeostasis lipídica1,2. Durante el período de alimentación, los adipocitos (es decir, las células principales del tejido adiposo) almacenan el exceso de glucosa y líp....
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Protocolo
Este protocolo fue probado y validado para todos los depósitos de ratón y tejido adiposo blanco humano. Los tejidos adiposos humanos y de ratón fueron recogidos en consecuencia a las leyes europeas y aprobados por los comités éticos franceses y suecos.
1. Fijación del ratón y el tejido adiposo blanco humano
- Sumerja el ratón cosechado o los tejidos adiposos blancos humanos en al menos 10 ml de PBS que contengan un 4% de paraformaldehído (PFA) en un tubo de plástico de 15 ml.
- Agitar el tubo de plástico a temperatura ambiente en una placa de rodadura durante 1 h.
- Deje el tubo de plástico a 4 oC en una placa enroll....
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Resultados
Usando el procedimiento descrito aquí y resumido en la Figura 1,pudimos manchar y limpiar ópticamente el tejido adiposo blanco humano y ratón como se presenta en la Figura 2A y la Figura 2B,respectivamente. El tejido transparente se transfirió a la cámara de imágenes metálicas para realizar imágenes confocales(Figura 3A). El aclaramiento mejoró drásticamente la profundidad de las imágenes tisulares que .......
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Discusión
Las modificaciones que se producen dentro del tejido adiposo a lo largo de la progresión patológica, como la de la obesidad, son fundamentales para la comprensión de los mecanismos detrás de la patología. Estudios pioneros que revelaron estos mecanismos en el tejido adiposo se han basado en enfoques globales como la proteómica entera del tejido adiposo21,la citometría de flujo22,,23,y la transcriptómica24,,
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el INSERM, Universidad De Costa Azul, y con subvenciones de la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través de las Inversiones para el Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), el programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) a través de Academy 2 "Syst-mes Complexes" y Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", La Fundación para la Recherche Médical (quipe FRM DEQ20180839587), y el Programa de Jóvenes Investigadores a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos también el Fondo Básico de Imagen del C3M financiado por el Conseil Départemental des Alpes-Maritimes y la Région PACA, y que también cuenta con el apoyo de la Plat....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microtubos de 1,5 mL | Tubos Eppendorff - Dutscher | 33528 | |
| Tubos de plástico de 15 | mL Tubos Falcon - Dutscher | 352096 | |
| cubreobjetos de vidrio redondos de 18 mm | Mariendfeld | 0117580 | |
| Frasco de vidrio de 20 ml | Wheaton | 986546 | |
| anticuerpo conjugado anti-mouse-alexa647 | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilución: 1/100 |
| anti-conejo-Alexa647-anticuerpo conjugado | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilución: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE anticuerpo Biolegend | BLE145703 | Dilución: 1/100 | |
| Anticuerpo CD31 | AbCam | ab215912 | Dilución: 1/50 |
| Software comercial de análisis 3D - Instrumento | IMARIS Oxford | con módulo de célula | |
| Microscopio confocal - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Concentración de stock: 5 mg/mL; dilución 1/1000 |
| Desoxicolato | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Anticuerpo Glut4 | Santa Cruz | sc-53566 | Dilución: 1/50 |
| Glicina | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 Concentración de | existencias : 2 y micro; g/µ L; Inyección intravenosa: 50 y micro; L/mices |
| Cámara de imagen metálica equipada con fondo de cristal - Cámara AttoFluor | Thermofisher | A7816 | |
| Salicilato de metilo | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Anticuerpo de perilipina | Progen | 651156 | Dilución: 1/50 |
| Faloidina-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilución: 1/100 |
| Anticuerpo TCR-β-PB | Biolegend | BLE109225 | Dilución: 1/100 |
| TH anticuerpo | AbCam | ab112 | Dilución: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
Referencias
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E.
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Reimpresiones y permisos
