Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.
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Artículo de método
Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La electroporación se ha establecido como un método crítico para transferir genes específicos a las células para entender su función. Aquí, se describe una técnica de electroporación unicelular que maximiza la eficiencia (~ 80%) de la transfección genética in vitro en las neuronas inhibitorias excitatorias y específicas de la clase en el cultivo organotípico de la rebanada del hipocampo de ratón. Usando los electrodos de cristal grandes, el líquido cerebroespinal artificial tetrodotoxina-que contenía y los pulsos eléctricos suaves, entregamos un gene del interés en las neuronas piramidales hippocampal cultivadas CA1 y las interneuronas inhibitorias. Por otra parte, la electroporación podría llevarse a cabo en rodajas de hipocampo cultivadas hasta 21 días in vitro sin reducción en la eficiencia de transfección, lo que permite el estudio de diferentes etapas de desarrollo del cultivo en rodajas. Con el creciente interés en examinar las funciones moleculares de los genes a través de una amplia gama de tipos de células, nuestro método demuestra un enfoque confiable y sencillo para la transfección de genes in vitro en el tejido cerebral de ratón que se puede realizar con el equipo y las técnicas de electrofisiología existentes.
Introducción
En biología molecular, una de las consideraciones más importantes para un investigador es cómo entregar un gen de interés en una célula o población de células para dilucidar su función. Los diferentes métodos de administración pueden clasificarse como biológicos (por ejemplo, un vector viral), químicos (por ejemplo, fosfato de calcio o lípidos) o físicos (por ejemplo, electroporación, microinyección o biolística)1,2. Los métodos biológicos son altamente eficientes y pueden ser específicos del tipo celular, pero están limitados por el desarrollo de herramientas genéticas específicas. Los enfoques químicos son m....
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Protocolo
Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts. La preparación del cultivo en rodajas, la preparación del plásmido y la electroporación también se detallan en nuestros métodos publicados anteriormente y pueden ser referidos para obtener información adicional10.
1. Preparación del cultivo de la rebanada
- Prepare los cultivos organotípicos de la rebanada hippocampal del ratón según lo descritopreviamente 11,usando los ratones postnatales de 6 a 7 ....
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Resultados
Nuestra electroporación unicelular es capaz de entregar genes con precisión en neuronas excitatorias e inhibitorias identificadas visualmente. Hemos electroporated tres tipos diferentes de células neuronales en tres puntos de tiempo diferentes. Parvalbumin (Pv) o glutamato vesicular tipo 3 (VGT3) que expresan las neuronas se visualizaron cruzando Pvcre (JAX #008069) o VGT3cre (JAX #018147) líneas con TdTomato (una variante de la proteína fluorescente roja) línea reportero (Jax #007905), respectivame.......
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Discusión
Describimos aquí un método de electroporación que transfecta las neuronas excitatorias e inhibitorias con alta eficiencia y precisión. Nuestro protocolo de electroporación optimizado tiene tres avances innovadores para lograr una transfección génica altamente eficiente. Nuestra primera modificación fue aumentar el tamaño de la pipeta en comparación con los protocolos publicados anteriormente3,5,6. Este cambio nos permitió electr.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Becas de Salud (R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 y F30MH122146 a A.C.). Los autores agradecen a la Sra. Naoe Watanabe su hábil asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Preparación de plásmidosKit de | |||
| plásmidos | Qiagen | 12362< | |
| fuerte>Preparación organotípica de cultivos en cortes | |||
| 6 Placas de pocillos | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Pinzas | FST | #5/45 | Pinzas de disección en ángulo para la preparación de cultivos organotípicos en rodajas |
| Unidad de filtro de matraz | Millipore | SCHVU02RE | Filtración y almacenamiento de medios de cultivo |
| Aglutinante | incubadora | BD C150-UL | |
| Picadora de tejidos McIlwain | TED PELLA, INC. | 10180 | Picadora de tejidos para la preparación de cultivos organotípicos en rodajas |
| Inserto de cultivo celular Millicell, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Insertos organotípicos para cultivo en rodajas Sistemas de |
| precisión | osmómetros | OSMETTE II | |
| ESPÁTULAS RECUBIERTAS DE PTFE | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Tijeras | FST | 14958-09 | |
| Estéreo Microscopio | Olympus | SZ61 | |
| Sistema de filtración al vacío estéril | Millipore | SCGPT01RE | Filtración y almacenamiento de aCSF |
| Preparación de electrodos | |||
| Vidrios capilares | Warner Instruments | 640796 | |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instrumento | P-1000 | Extractor |
| Encuadernador | horno | BD (E2) | |
| Extractor Filamento | Sutter Instrumento | FB330B | Puller |
| Imagen de electroporación y fluorescencia de una sola célula #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Plateas | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| Cámara CCD | Q Imaging | Retiga-2000DC | Cámara |
| Sistema de Electroporación | Dispositivos Moleculares | Axoporator 800A | Electroporador |
| Sistema de Iluminación de Fluorescencia | Manipulador | Prior Lumen 200 | |
| Instrumento Sutter | MPC-385 | Manipulador | |
| Metamorph software | Dispositivos moleculares | Adquisición de imágenes | |
| Bomba peristáltica | Rainin | Dynamax, RP-2 Bomba de | perfusión |
| Mesa giratoria | Luigs & Altavoz Neuman | 240 XY | |
| Desconocido | Altavoces conectados al electroporador | ||
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZ30 | |
| Incubadora de sobremesa | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Olympus | BX61WI | ||
| strong>Fluorescencia microscopio de fluorescencia todo en uno Keyence | |||
Referencias
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22....
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Reimpresiones y permisos
