Se presenta el cultivo in vitro de la corteza ovárica bovina y el efecto de la dieta nutricional Stair-step sobre el microambiente ovárico. Las piezas de la corteza ovárica se cultivaron durante siete días y se evaluaron los esteroides, las citoquinas y las etapas del folículo. El tratamiento de la dieta Stair-Step había aumentado la esteroidogénesis, lo que resultó en la progresión del folículo en cultivo.
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Artículo de método
Cultivo de tejido de corteza ovárica bovina
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo del folículo desde la etapa primordial hasta la antral es un proceso dinámico dentro de la corteza ovárica, que incluye factores endocrinos y paracrinos de las células somáticas y la comunicación cúmulo célula-ovocito. Poco se sabe sobre el microambiente ovárico y cómo las citoquinas y esteroides producidos en el entorno circundante afectan la progresión o detención del folículo. El cultivo in vitro de la corteza ovárica permite que los folículos se desarrollen en un entorno normalizado que permanece soportado por el estroma adyacente. Nuestro objetivo fue determinar el efecto de la dieta nutricional Stair-Step sobre el microambiente ovárico (desarrollo del folículo, producción de esteroides y citoquinas) a través del cultivo in vitro de la corteza ovárica bovina. Para lograr esto, se retiraron piezas corticales ováricas de novillas sometidas a dos esquemas nutricionalmente desarrollados diferentes antes de la pubertad: Control (desarrollo de la nutrición tradicional) y Stair-Step (alimentación y restricción durante el desarrollo) que se cortaron en aproximadamente 0.5-1 mm3 pedazos. Estas piezas se pasaron posteriormente a través de una serie de lavados y se colocaron en un inserto de cultivo de tejidos que se coloca en un pozo que contiene el medio de cultivo de Waymouth. La corteza ovárica se cultivó durante 7 días con cambios diarios en los medios de cultivo. Se realizó un seccionamiento histológico para determinar los cambios en el estadio del folículo antes y después del cultivo para determinar los efectos de la nutrición y el impacto del cultivo sin tratamiento adicional. El medio de cultivo Cortex se agrupó durante días para medir esteroides, metabolitos esteroides y citoquinas. Hubo tendencias para el aumento de las hormonas esteroides en el microambiente ovárico que permitieron la progresión del folículo en los cultivos de corteza ovárica Stair-Step versus Control. La técnica de cultivo de la corteza ovárica permite una mejor comprensión del microambiente ovárico y cómo las alteraciones en la secreción endocrina pueden afectar la progresión y el crecimiento del folículo tanto a partir de tratamientos in vivo como in vitro. Este método de cultivo también puede resultar beneficioso para probar posibles terapias que pueden mejorar la progresión del folículo en las mujeres para promover la fertilidad.
Introducción
La corteza ovárica representa la capa externa del ovario donde se produce el desarrollo del folículo1. Los folículos primordiales, inicialmente detenidos en desarrollo, se activarán para convertirse en folículos primarios, secundarios y luego antrales o terciarios basados en entradas paracrinas y gonadotropinas1,2,3,4. Para comprender mejor los procesos fisiológicos dentro del ovario, el cultivo de tejidos se puede utilizar como un modelo in vitro, lo que permite un entorno controlado para realizar experimentos. Mucho....
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Protocolo
Los ovarios se obtuvieron del U. S. Meat Animal Research Center16. Como se indicó anteriormente16,todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación de Animales de Carne de los Estados Unidos (USMARC) de acuerdo con la guía para el Cuidado y Uso de Animales Agrícolas en la Investigación y Enseñanza Agrícola. Los ovarios fueron llevados al Laboratorio Reproductivo de la Universidad de Nebraska-Lincoln, donde fueron procesados y cultivados.
1. Preparación de los medios requeridos
- Waymouth MB 752/1 medio
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Resultados
Este procedimiento de cultivo de corteza bovina se puede utilizar para determinar una amplia variedad de datos hormonales, citoquinas e histológicos de pequeñas piezas del ovario. La tinción, como la hematoxilina y la eosina (H&E), se puede utilizar para determinar la morfología ovárica a través de la estadificación del folículo16,23,31 ( Figura3). Brevemente, los folículos se clasificaron como .......
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Discusión
El beneficio del cultivo in vitro de corteza ovárica, como se describe en este manuscrito, es que los folículos se desarrollan en un ambiente normalizado con estroma adyacente que rodea los folículos. Las células somáticas y los ovocitos permanecen intactos, y existe una comunicación apropiada de célula a célula como modelo in vivo. Nuestro laboratorio ha encontrado que un sistema de cultivo de 7 días proporciona datos representativos de foliculogénesis y esteroidogénesis para el tratamiento de la corteza ovárica. Otros .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura 2013-67015-20965 a ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants to ASC. Subvención neb26-202/W3112 adhesión del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos #1011127 a ASC, Hatch–NEB ANHL Adhesión #1002234 a ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – Premio COVID-19 para la financiación de verano para CMS.
Los autores desean extender su agradecimiento al Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE para agradecerle por proporcionar los ovarios en una publicación anterior, q....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #11 Hoja Scapel | Swann-Morton | 303 | Hoja de Escapula |
| #21 Hoja de Scapel | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Filtro de tapa de botella | Corning | 430514 | Filtro de tapa de botella 0.22 µ m poro para medio filtrante |
| Ensayo AbsoluteIDQ Sterol17 Kit | Biocrates | Sterol17 Las | muestras se envían a Biocrates y se ejecutan los paneles de esteroides y se devuelven los resultados |
| Androstenediona Kit de RIA de doble anticuerpo | MPBio 7109202 | RIA para determinar androstenediona a partir de un medio de cultivo | |
| Bélgica A4 Assay Kit | Fuente DIA | KIP0451 | RIA para determinar androstenediona a partir de un medio de cultivo |
| Matriz de citocinas bovinas Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 Kit de | citocinas para determinar citocinas a partir de células de medio de cultivoSens |
| Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Software de imagen |
| Insulina-Transferrina-Selenio-X | Gibco ThermoFisher Scientific 5150056 | Aditivo al medio | |
| de cultivoLeibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | utilizado para el lavado de tejidos en banco limpio y en el cabniet de bioseguridad |
| Microscopio | Microscopio de | Olympus SZX16 | utilizado para la obtención de imágenes de piezas de cultivo de tejidos |
| Cámara microscópica | Cámara | Olympus DP71 | utilizada para la obtención de imágenes de piezas de cultivo de tejidos |
| Insertos de cultivo celular Millicell 0.4µ m, 12,mm de diámetro | Millipore Sigma | PICM01250 | Insertos que permiten que el tejido descanse contra el medio sin sumergirse en él |
| Placa de 24 pocillos Multipocillo | Falcon | 353047 | Placa utilizada para sujetar meduim, insertos y tejidos Placa de |
| Petri 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Placa de Petri utilizada para los pasos de lavado antes |
| del cultivo Solución salina tamponada con fosfato (PBS 1X) | Corning | 21-040- CV | Utilizado para el lavado de tejidos |
| SAS Versión 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Software de análisis estadístico |
| Thomas Stadie-Riggs Cortadora de pañuelos | Thomas Scientific | 6727C10 | Cortadora de tejidos para la preparación de secciones finas y uniformes de tejido fresco |
| Waymouth MB 752/1 Medio | Sigma-Aldrich | W1625 | Medio utilizado para cultivos de tejidos |
Referencias
- Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
- Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from gen....
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Reimpresiones y permisos
