Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida

Resumen

El protocolo presentado aquí está destinado a demostrar la ocurrencia de interacciones heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi con N- y/o C-termini expuestas citoplasmáticamente en células vivas de mamíferos utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida.

Resumen

El objetivo de este protocolo es explorar la aplicabilidad de la variante más reciente de complementación de luciferasa dividida para demostrar complejos heterólogos formados por transportadores de azúcar de nucleótidos (NST). Estas proteínas multitransmembrana residentes en ER y Golgi transportan los azúcares nucleótidos sintetizados citoplasmáticamente a través de las membranas de orgánulos para suministrar enzimas que median la glicosilación con sus sustratos. Los NST existen como dímeros y/oligómeros superiores. También se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes NST. Para verificar si la técnica es adecuada para estudiar el fenómeno de heteromerización de NST, la probamos contra una combinación de los dos NST residentes en Golgi que previamente se ha demostrado que se asocian por varios otros medios. El ensayo de complementación con luciferasa parece ser particularmente adecuado para estudiar las interacciones entre las proteínas de membrana residentes en Golgi, ya que no requiere altos niveles de expresión, que a menudo desencadenan una mala localización de las proteínas y aumentan el riesgo de falsos positivos.

Introducción

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para verificar la presencia de interacciones heterólogas entre las proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi en células humanas transfectadas transitoriamente utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida. El procedimiento ha sido probado más extensamente contra transportadores de azúcar de nucleótidos (NST), pero también pudimos obtener resultados positivos para otras proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi cuyos N- y / o C-termini se enfrentan al citoplasma.

Nuestro grupo de investigación explora el papel de los NST en la glicosilación de macromoléculas. Los NST son proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi y/o ER con N- y C-termini frente al lado citoplasmático de la membrana organelástica1. Se cree que los NST transportan azúcares activados por nucleótidos a través de las membranas de orgánulos para suministrar glicosiltransferasas con sus sustratos. Los NST forman dímeros y/o oligómeros superiores2,3,4,5,6,7,8,9,10. Además, también se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes ^NST6,11. También se demostró que los NST forman complejos con enzimas de glicosilación funcionalmente relacionadas12,13,14. Buscamos una alternativa a la técnica utilizada actualmente, el enfoque FRET basado en imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM), para estudiar las interacciones de los NST y las proteínas residentes de Golgi funcionalmente relacionadas, por lo que decidimos probar el ensayo de complementación de luciferasa dividida. Nos permitió identificar una nueva interacción entre un NST y una enzima de glicosilación funcionalmente ^relacionada9.

La modificación más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida, NanoBiT, se utiliza en el protocolo presentado ^aquí15. Se basa en la reconstitución de la enzima luciferasa (por ejemplo, NanoLuc) de los dos fragmentos: el grande, denominado como BiT grande o LgBiT, una proteína de 17,6 kDa, y el pequeño, compuesto de solo 11 aminoácidos, denominado BiT pequeño o SmBiT. Las dos proteínas de interés se fusionan con los fragmentos complementarios y se expresan transitoriamente en una línea celular humana. Si las dos proteínas de fusión interactúan, se produce una luminiscencia in situ tras la adición de un sustrato permeable a la célula. Estos dos fragmentos han sido optimizados para que se asocien con una afinidad mínima a menos que se unan mediante una interacción entre las proteínas de interés a las que se fusionan.

En general, los métodos basados en bioluminiscencia tienen algunas ventajas sobre los basados en la fluorescencia. Las señales bioluminiscentes tienen una mayor relación señal-ruido porque la luminiscencia de fondo es insignificante en comparación con la señal derivada de la ^luciferasa16. En contraste, los enfoques basados en la fluorescencia generalmente sufren de un fondo relativamente alto causado por el fenómeno de la autofluorescencia. Además, la bioluminiscencia es menos perjudicial para las células analizadas que la fluorescencia, ya que en el primer caso no hay necesidad de excitar la muestra. Por esas razones, los enfoques bioluminiscentes para estudiar los IBP in vivo superan a los métodos fluorescentes comúnmente utilizados como la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) o la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC).

Nuestro protocolo se basa en referir la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés a la luminiscencia obtenida para la combinación de control. Este último incluye la de las proteínas probadas que se fusiona con un fragmento más grande y una proteína de control (por ejemplo, HaloTag), fusionada con un fragmento más pequeño. Esta última es una proteína de origen bacteriano que no se espera que interactúe con ninguna de las proteínas de mamíferos. El uso de esta proteína como control plantea limitaciones a la topología de los pares de proteínas residentes de Golgi a analizar. Dado que en las células de mamíferos esta proteína se sintetiza en el citoplasma, ambas proteínas de interés deben tener al menos una cola citoplasmática.

Este enfoque puede ser particularmente útil para el cribado inicial de IBP. Puede convertirse en el método de elección cuando las proteínas de fusión de interés se expresan a niveles que son simplemente insuficientes para que se apliquen otros enfoques. Del mismo modo, el ensayo de complementación de luciferasa dividida puede ser la mejor opción si las proteínas de interés se expresan en niveles altos, pero esto afecta negativamente su localización subcelular o se sabe que fuerza interacciones no específicas. Dado que el fragmento más pequeño tiene solo 11 aminoácidos, el ensayo de complementación de luciferasa dividida se puede aplicar cuando el uso de etiquetas más grandes es imposible. Finalmente, se puede emplear para confirmar aún más los datos obtenidos utilizando otras técnicas, como en el caso presentado aquí.

Protocolo

1. Generación de plásmidos de expresión

1. Examinar la topología de membrana de las proteínas de interés utilizando una herramienta de predicción de topología.
2. Diseñar la estrategia de clonación para que los fragmentos más grandes y más pequeños se enfrenten al citoplasma una vez que las proteínas de fusión se hayan insertado en las membranas de Golgi. Si, como en el caso aquí presentado, tanto N- como C-termini de las proteínas de interés están orientadas citoplasmáticamente, etiquete las proteínas de ocho maneras posibles (ver Figura 1B). Si N- o C-terminal de una o ambas proteínas de interés está orientada luminalmente, excluirla del etiquetado.
3. Subclónea los genes de interés en vectores de expresión apropiados (ver Tabla de Materiales) siguiendo protocolos de clonación estándar.
   NOTA: Se recomienda probar todas las orientaciones posibles, ya que algunas opciones de etiquetado pueden no funcionar debido a una proximidad insuficiente, orientación subóptima o restricciones espaciales.

2. Transfección transitoria de los plásmidos de expresión en las células

1. Cosechar el cultivo celular adherente HEK293T por tripsinización y resuspendir las células en un medio de crecimiento completo dedicado. Coloque las celdas (2 x ¹⁰⁴/100 μL/pozo) en una placa inferior transparente, de 96 pocillos. Ajuste el número total de pozos para acomodar todas las combinaciones y controles probados, incluidas las réplicas.
   NOTA: Intente usar solo los 60 pocillos internos de la placa para minimizar los cambios térmicos y evitar la evaporación durante la noche. El uso de placas recubiertas de poli-D-lisina es muy recomendable, como las indicadas en la Tabla de Materiales, de lo contrario las celdas pueden desprenderse durante los pasos de lavado posteriores.
2. Cultive las células durante la noche en condiciones estándar (37 °C, 5% _co2).
3. Al día siguiente transfectar las células con las combinaciones deseadas de plásmidos de expresión obtenidos en el punto 1.1.
   1. Diluir los plásmidos de expresión en un medio libre de suero (ver Tabla de Materiales) a 6,25 ng/μL para cada constructo.
   2. Agregue el reactivo de transfección a base de lípidos en una proporción adecuada de lípidos a ADN e incube de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   3. Añadir 8 μL de mezcla de lípidos:ADN a los pocillos designados. Mezcle el contenido de la placa mediante una rotación suave. Esto da como resultado la transfección de ambos constructos de expresión a 50 ng/pocillo.
4. Cultive las células durante 20-24 h en condiciones estándar (37 °C, 5% _CO2).
   NOTA: El cultivo de las células durante más tiempo puede resultar en niveles más altos de expresión de proteínas de fusión, lo que puede promover una asociación no específica entre los fragmentos.

3. Intercambio medio

1. Al día siguiente, reemplace el medio acondicionado con 100 μL de un medio sin suero en cada pozo. Asegúrese de que las células no se hayan desprendido tras el intercambio de medios.
   NOTA: Este paso debe realizarse 2-3 h antes de la adición de la solución de trabajo de furimazina. La abstinencia sérica minimiza el fondo causado por la autoluminiscencia de furimazina.

4. Preparación de la solución de trabajo de furimazina

1. Justo antes de la medición, mezcle 1 volumen de furimazina con 19 volúmenes de un tampón de dilución (una dilución de 20 veces).
   NOTA: El volumen total de la solución de trabajo de furimazina a preparar depende del número de pocillos individuales a analizar (la solución de trabajo de furimazina se agrega al medio de cultivo celular en una proporción de 1:5, por lo tanto, a cada pozo previamente lleno con 100 μL de un medio libre de suero se deben agregar 25 μL de la solución de trabajo de furimazina).
2. Agregue la solución de trabajo de furimazina a los pozos designados (25 μL/pocillo). Mezcle suavemente la placa a mano o usando un agitador orbital (por ejemplo, 15 s a 300-500 rpm).

5. Medición de luminiscencia

1. Inserte la placa en un lector de microplacas de luminiscencia.
   1. Para los experimentos que se van a realizar a 37 °C equilibrar la placa durante 10-15 min a la temperatura indicada.
2. Seleccione los pozos a analizar.
3. Luminiscencia de lectura con tiempo de integración de 0,3 s. Continúe monitoreando la luminiscencia hasta 2 h cuando sea necesario.

6. Análisis de datos

1. Calcule los valores medios y las desviaciones estándar para todas las combinaciones probadas y de control.
2. Analice datos utilizando ANOVA unidireccional con múltiples comparaciones.
3. Calcular los valores de cambio de pliegue dividiendo una luminiscencia media obtenida para combinaciones de interés por una luminiscencia media obtenida para los controles negativos correspondientes. Evaluar los resultados.
   NOTA: El enfoque de análisis de datos propuesto aquí asume que la interacción puede ser reclamada si la luminiscencia obtenida para la combinación probada es estadísticamente significativamente mayor que la luminiscencia obtenida para la combinación de control correspondiente y, al mismo tiempo, la relación de estos dos valores supera 10.

Resultados

Para obtener los datos más fiables en este enfoque se deben probar todas las combinaciones posibles (ver Figura 1). Paralelamente, deben incluirse controles positivos y negativos. El control positivo debe consistir en las dos proteínas que se sabe que interactúan, de las cuales una está fusionada con el fragmento más grande y la otra está fusionada con el fragmento más pequeño. El control negativo idealmente debería consistir en las dos proteínas de membrana de tipo III que no interactúan et...

Discusión

Aquí proporcionamos un protocolo detallado que permite la demostración de complejos heterólogos formados entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi, como los NST, utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida. El enfoque propuesto para el análisis e interpretación de datos implica relacionar la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés con la luminiscencia obtenida para la combinación de control correspondiente, que está compuesta por una de las proteínas de interés fus...

Materiales

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Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de tripsina-EDTA al 0,25% Línea
			celular de mamíferos adherente
BioCoat Poly-D-Lisina 96 pocillos Blanco/Transparente Fondo plano Microplaca tratada con TC, con tapa	Corning	356651
Centrífuga
Suplementos de cultivo celular (suero bovino fetal inactivado por calor, L-glutamina, penicilina, estreptamicina)
Incubadora
Expresión de plásmidos que codifican proteína(s) de interés no marcados con fragmentos
Reactivo de transfección FuGENE HD	Promega	E2311
GloMax Discover Lector de microplacas (o un lector de microplacas de luminiscencia diferente)	Promega	GM3000
Medio de crecimiento dedicado a la línea celular utilizada
Materiales y reactivos para la clonación molecular estándar (bacterias, polimerasa termoestable, enzimas de restricción, ADN ligasa, materiales y reactivos para la purificación de ácidos nucleicos)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	Este kit contiene vectores que permiten el marcaje de las proteínas de interés con fragmentos de NanoBiT en diferentes orientaciones, así como el plásmido de control que codifica la proteína HaloTag fusionada con SmBiT y un par de plásmidos de control positivo.
Sistema de ensayo de células vivas Nano-Glo	Promega	N2011	Este kit contiene furimazina, que es un sustrato que permite la detección de la actividad de NanoLuc en células vivas, y un tampón de dilución dedicado.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, sin rojo fenol	Gibco	11058021
Oribital Agitador
para el análisis de datos (p. ej., GraphPad Prism)
Termociclador

de cultivo celularde COde NanoBiT Software