Aislamiento e identificación comensal conjuntival en ratones

El objetivo de este protocolo es aumentar el aislamiento específico de microbios anaeróbicos aeróbicos y facultativos viables y raros de la conjuntiva ocular para caracterizar el microbioma ocular. Amplios estudios han perfilado comunidades de la mucosa conmensal en la piel, intestino, vías respiratorias y genitales y muestran que estas comunidades influyen en el desarrollo del sistema inmune y la respuesta^1,2,3. Se ha demostrado que las comunidades comensales oculares cambian durante ciertas patologías de la enfermedad, como la enfermedad del ojo seco^4,el síndrome de Sjogren⁵ y la diabetes^6. Sin embargo, la capacidad de definir una comunidad comensal de superficie ocular típica se ve obstaculizada por su abundancia relativamente baja en comparación con los otros sitios de la mucosa^6,7,8. Esto provoca una controversia sobre si existe un microbioma ocular residente y si existe, si difiere del microbioma de la piel y, en consecuencia, su efecto local sobre el desarrollo y la respuesta del sistema inmune innato. Este protocolo puede ayudar a resolver esta pregunta.

En general, los enfoques para definir el nicho comensal ocular se basan en técnicas de secuenciación y cultivo^4,7,9. La secuenciación del ADNr 16 S y el análisis BRISK⁷ muestran una diversidad más amplia que las técnicas basadas en la cultura, pero son incapaces de diferenciar entre microbios vivos y muertos. Dado que la superficie ocular es hostil a muchos microbios debido a las propiedades antimicrobianas de la película lagrimal⁴ que generan una gran variedad de fragmentos de ADN, los enfoques basados en adn detectarán estos artefactos que pueden sesgar los datos hacia la identificación de bacterias muertas como comensales residentes en lugar de contaminantes. Esto resulta en una aberrante identificación comensal y caracterización del espacio ocular como mayor en abundancia y diversidad de microbios¹⁰. Esto hace que sea difícil definir el microbioma ocular residente a través de métodos basados en el ADN. Mientras que, las técnicas estándar basadas en el cultivo no pueden detectar los contraensales porque la carga es demasiado baja¹¹. Nuestro método mejora las prácticas estándar mediante el uso de un hisopo delgado que puede dirigirse a la conjuntiva, evitando así la contaminación de la piel vecina, así como el concepto de que los organismos viables pueden enriquecerse mediante un breve cultivo en medios densos en nutrientes con el objetivo de resucitar viables pero no cultivables, así como, enriquecer para microbios viables raros.

Los resultados, abundancia relativa de comensales oculares por hisopo ocular, caracterizan el microbioma residente de la conjuntiva y son importantes para fines comparativos. Nuestros datos muestran que hay una diferencia entre la piel y la microbiota conjuntival, así como una mayor diversidad con el aumento de la edad y una diferencia específica del sexo en la abundancia. Además, este enfoque ha encontrado de forma reproducible diferencias cómicas en ratones knock-out¹². Este protocolo se puede aplicar para describir el microbioma ocular que puede variar debido a las prácticas de enjaulado, la geografía o el estado de la enfermedad, así como los efectos locales de los metabolitos y productos consal sobre el desarrollo y la respuesta del sistema inmunológico.

Todos los procedimientos que involucran ratones siguen las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Siga las pautas de seguridad del laboratorio (según las indicaciones de su departamento institucional de salud y seguridad ambiental) cuando trabaje con microorganismos y materiales potencialmente contaminados. Utilice recipientes de desecho apropiados y procedimientos de descontaminación antes de la eliminación de materiales contaminados potencialmente peligrosos.

1. Preparación del hisopo ocular, configuración del campo de trabajo, hisopado de ojo de ratón y enriquecimiento de la muestra

1. Preparar hisopos oculares estériles
   NOTA: Los hisopos de ojos estériles son palillos de madera finamente recubiertos con una capa delgada de fibra de algodón y hechos en casa.
   1. Autoclave cantidad apropiada de algodón bateando y palillos de dientes para el número de ratones a ser hisopados.
   2. Pellizque un pedazo de medio centímetro de largo de bateo de algodón con el pulgar y el índice. Burlarse del bateo tirando de los bordes con pulgares y dedos interiores para formar una sola capa porosa plana, deteniéndose justo antes de que el bateo se deshaga (pequeños trozos de algodón dispersos a lo largo del bateo estirado son aceptables).
   3. Gire el bateo alrededor de uno de los extremos afilados del palillo de dientes sosteniendo ligeramente la pieza estirada en la punta del palillo de dientes a medida que se tuerce, consulte la Figura 1. El hisopo de ojo "completado" tendrá una capa muy delgada de algodón estirada sobre la punta, que se extiende aproximadamente de medio a un centímetro de distancia de la punta.
   4. Inserte los hisopos "completados" en el pequeño casto, el lado del hisopo hacia abajo y la cubierta. autoclave.
2. Configurar el área de trabajo
   1. Preparar anestesia que contenga 2 mL de ketamina (100 mg/mL), 400 μL de xilazina (100 mg/ml) y 27,6 mL de solución salina estéril (0,9% nacl en dH₂O) en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml de ventosa. Filtro esterilizar y anestesia alícuota para uso inmediato (puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes; siempre dejar equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso).
   2. Despeje y limpie el área de trabajo con desinfectante para minimizar la contaminación.
   3. Alícuota 0.5 mL de medios estériles de infusión de corazón cerebral (BHI) en tubos de microcentrífuga estériles etiquetados de 1.5 mL (1 tubo por ratón y control); organizar en rack de microcentrífuga. Poner el bastidor en el hielo.
   4. Configure el flujo de trabajo de la siguiente manera (de izquierda a derecha): estación de anestesia de ratón (jaula que contiene ratones experimentales, jaula estéril vacía, anestesia a temperatura ambiente, aguja de 25 G y jeringa de 1 mL), estación de hisopado ocular (IMC alícuota sobre hielo, hisopos oculares esterilizados, toallas de papel limpias, pulverización de isopropanol al 70%) y estación de chapado (placas de agar sangre a temperatura ambiente, pipeta de 10 μL , 10 μL de puntas desechables estériles, contenedor de residuos de riesgo biológico).
3. Hisopado ocular
   1. Administrar 10 μL de anestesia por 1 g de dosis de peso de ratón de ketamina y xilazina respectivamente por vía intraperitoneal a cada ratón adulto y colocar en una jaula en autoclave. Pruebe la anestesia exprimiendo la almohadilla del pie trasero; ningún movimiento indica anestesia apropiada.
   2. Asigne una mano para manejar solo ratones anestesiados y la otra mano para manejar solo el hisopo del ojo y el cultivo. Para el hisopado, retire el ratón completamente anestesiado de la jaula; colocar en la parte superior de la superficie de trabajo limpia colocado en su' lado con el ojo izquierdo expuesto. Rocíe las manos enguantadas con isopropanol, seque con toalla de papel limpia.
   3. Uncap etiqueta específicamente como tubo de micro-centrífuga BHI con mano dedicada al manejo de medios. Coloque el tubo de nuevo en el estante de microcentrifugación sobre hielo.  Sumerja la punta recubierta de algodón del hisopo ocular en BHI, retire el hisopo del ojo del tubo que arremolina la punta 2 veces contra el tubo interno para eliminar el exceso de líquido.
   4. Con la mano de manejo del ratón, sostenga suavemente el ratón por el desaliño del cuello. Con la otra mano, coloque la punta del hisopo ocular contra la región conjuntival medial del ojo izquierdo, ver Figura 2A. Deprima ligeramente el globo ocular y mueva el hisopo en un movimiento de lavado de ventanas (Figura 2B) hacia adelante y hacia atrás, entre el párpado inferior y el ojo, 10 veces. Mantener una presión constante.
   5. Sin tocar el pelaje, retire suavemente la punta del hisopo, perpendicular al lugar donde se insertó, y coloque el lado del algodón del hisopo hacia abajo directamente en un tubo de microcentrifugación etiquetado que contenga medios de IMC. Aplique una gota lubricante para los ojos en el ojo hisopado.
   6. Devuelva el ratón a la jaula.
   7. Deje reposar el hisopo durante 10 a 15 minutos sobre hielo y retire el hisopo ocular con la mano enguanada esterilizada mezclando la punta en el medio durante 10 rotaciones. Retire el hisopo girando la punta contra la pared interna del tubo de microcentrifugación durante 5 rotaciones. Deseche el hisopo en un recipiente de riesgo biológico.
   8. Repita los pasos 1.3.2 a 1.3.7 para cada ratón y para las muestras de control (hisopo de piel o piel). Esterilice los guantes apropiadamente entre cada hisopo.
4. enriquecimiento
   1. Enriquecer la muestra incubando el tubo estáticamente durante 1 h a 37 °C
   2. Durante la incubación, etiquete una triptasa de soja a temperatura ambiente con una placa de agar sangre de oveja al 5% (placa TSA) por ratón y divida por la mitad.
   3. Después de la incubación del cultivo de hisopos oculares, retire las muestras enriquecidas de la incubadora y colóquelo en el hielo.
   4. Brevemente muestras de vórtice para mezclar y platear de acuerdo con el esquema de la Figura 3A. Alícuota 10 μL de la muestra sobre la placa TSA e incline la placa para formar una tira, repita 2 veces.
   5. En el otro lado de la línea divisoria de la placa, punto 10 μL de muestra en agar, repita 9 veces.
   6. Incubar placas a 37 °C durante 18 h, 2 días y 4 días (en una cámara limpia que evite que las placas de agar se sequen). Contar colonias en tiras, observar la morfología y calcular las unidades formantes de colonias (UFC) por hisopo para aislamientos morfológicamente similares. Mira los puntos para los organismos únicos no capturados en tiras.

2. Placa maestra, caracterización e identificación de microbios oculares

1. Placa maestra
   1. Dibuje cuadrículas en la parte posterior de una placa TSA (Figura 3B). Elija una colonia con un palillo de dientes estéril de cada placa de hisopo de ojo de ratón y raye el cuadrado de la placa maestra (cuadrículas), etiquete la cuadrícula con el número de colonia y la información del ratón. Recoger y platear tres colonias diferentes para cada colonia morfológicamente distinta.
   2. Incubar la placa durante la noche a 37 °C. Continuar la incubación durante 96 horas, comprobando diariamente la aparición de nuevos aislados.
      NOTA: La población de Commensal variará según la edad del ratón, la nutrición, el estado de la enfermedad y las prácticas de enjaulado. La caracterización aislada se basa en las bacterias anaeróbicas aeróbicas y facultativas predominantes encontradas en nuestro laboratorio.
2. caracterización
   1. Duplicar¹³ microbios de placa en placas de agar salado de manitol (MSA) y MacConkey (MAC), incubar durante la noche a 37 °C. Nótese el crecimiento para cada aislado y la presencia de colonias cerosas o colonias amarillas con halo en MSA.
   2. Para los cocos Gram positivos, prueba con la prueba de catalasa^13,14. Coloque una gota de peróxido de hidrógeno al 3% en un portaobjetos de vidrio limpio. Usando un palillo de dientes estéril, elija el microbio correspondiente de la placa de hisopo del ojo. Ninguna formación de burbujas indica Streptococcus spp.,ligera formación de burbujas indica Corynebacterium spp.
3. Identificación: Análisis MALDI-TOF MS
   NOTA: Las identificaciones bacterianas se llevan a cabo utilizando el MALDI-TOF y la base de datos de software. Este sistema emplea la ionización por desorción láser asistida por matriz-tiempo de espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF MS) para el desarrollo de perfiles de espectros que se comparan con los espectros bacterianos conocidos para su identificación. E.coli,ATCC 8739, se utiliza para la calibración del sistema.
   1. Platea aislados bacterianos en placas TSA que contienen 5% de sangre de oveja e incuban durante la noche con 5% de dióxido de carbono a 37 °C.
   2. Usando un bucle de 1 μL, aplique una capa delgada de las bacterias puras al portaobjetos objetivo MALDI-TOF; 1 μL de solución de matriz MALDI-TOF MS CHCA (ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico) se sobreslía y se deja secar completamente antes de cargar el portaobjetos en el instrumento MALDI-TOF.
   3. Cada aislado se detecta por duplicado.
   4. Los informes que contienen puntuaciones de probabilidad superiores al 80%, que indican un alto valor de discriminación, se aceptan como resultados fiables y se acepta la identificación bacteriana.

Los resultados representativos de una placa de hisopo ocular que demuestran diferentes métodos para el revestimiento se muestran en la Figura 3A que muestra aislados morfológicamente diversos del ratón C57BL/6. Para cada aislante distinto, las colonias fueron contadas en la tira y la abundancia relativa, unidades formantes únicas de la colonia (CFUs) por la hisopo del ojo, calculadas y trazadas para los propósitos de la comparación. Para la caracterización microbiológica, las bacterias se seleccionaron de placas de hisopo de ojo de ratón individuales para producir una placa maestra de TSA (creada mediante la selección de aislados morfológicamente distintos por triplicado de cada placa de hisopo de ojo de ratón). A partir de la placa maestra, en el día siguiente o cuando aparece el crecimiento, se realizaron pruebas adicionales para caracterizar o identificar los microbios. La placa maestra fue utilizada para proporcionar bastante inóculo para ampliar los aislantes respectivos.

Las especies fueron caracterizadas mediante técnicas microbiológicas y luego identificadas por el análisis MALDI-TOF MS. Cada aislado de la placa maestra, fue probado por la prueba de catalasa13,14 y crecido en medios selectivos. Dado que los microbios predominantes en nuestros estudios son Streptococcus spp., Staphylococcus spp. y Corneybacterium spp., el agar salado de manitol (MSA) y el agar Mac Conkey (MAC) se utilizaron como agar selectivo13. El crecimiento en el agar salado de manitol indica Staphylococcus spp13,16. Dado que la MSA contiene rojo fenol, un halo amarillo alrededor de la colonia indica la fermentación del manitol y la clasificación como Staphylococcus aureus (confirmar con pruebas alternativas como la prueba de coagulasa)13. El crecimiento en agar MacConkey indica bacterias Gram negativas, ya que las sales biliares y la violeta cristalina son capaces de transgredir la membrana bacteriana e inhibir el crecimiento bacteriano Gram positivo13. El crecimiento ceroso en MSA indica la producción de ácido micólico y puede deberse a organismos como Corneybacterium spp13. Finalmente, la prueba de catalasa diferencia Streptococcus spp. de Staphylococcus spp13,16,y en algunos casos, una prueba positiva débil puede indicar Aerococcus spp15.

Para identificar aislados, una placa de TSA se rayó e incubó durante la noche en un ambiente de dióxido de carbono al 5% y 37 °C y se realizó MALDI-TOF MS. En la Figura 4 se muestran los resultados de S. acidominimus (un miembro de viridans Streptococcus spp. 17)y A. viridans. A menudo Aerococcus spp. se identifica erróneamente como el grupo viridans de estreptococos18,19,basado en pruebas bioquímicas y fenotípicas. MALDI-TOF MS pudo identificar los aislados con un nivel de confianza de 99,9 sin especies no identificables.

Las diferencias sesgadas por sexo se pueden observar en la Figura 5,donde se recuperaron niveles significativamente diferentes de organismos commensales de ratones C57BL/6 machos y hembras. La abundancia relativa para cada aislante fue determinada. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans y estafilococo coagulasa negativo(SNC)aislado #1 y E. coli spp. se encontraron en todos los ratones, con los machos mostrando mayor abundancia relativa y mayor diversidad.

Figura 1: Hisopo de ojo interno.
(A) Un pedazo delgado, de aproximadamente 1 cm, de bateo de algodón tirado se mantuvo entre el punto estéril del palillo de dientes y el dedo índice y el palillo de dientes se rodó manteniendo una ligera presión contra el dedo índice hasta que el algodón se enrolló completamente en la punta del palillo de dientes. (B) Ejemplo de un hisopo ocular. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Colocación del hisopo conjuntival del ojo del ratón.
(A) La punta del hisopo húmedo del ojo de BHI fue insertada, en un ángulo de 90°, en la esquina intermedial del ojo izquierdo de un ratón anestesiado, deprimiendo el globo ocular. (B)El hisopo se movió a lo largo de la conjuntiva mientras se mantenía una ligera presión sobre el ojo en un movimiento de ida y vuelta, 10 veces. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3: Resultados representativos para el hisopo ocular y las placas maestras.
(A)10 μL de hisopo ocular inoculado de medios enriquecidos se alícuota en el lado derecho de la placa de agar sangre y se inclinaron de 30 a 60 grados para permitir que el medio formara tiras y en el lado izquierdo de la placa, se dispensaron diez puntos de 10 μL de la muestra. La fotografía de la placa incubada muestra colonias individuales y diversidad morfológica. (B)Una placa maestra de aislados se creó recogiendo una colonia de la placa de hisopo del ojo y rayando dentro de uno de los cuadrados (rejillas). Tres colonias morfológicamente similares están rayadas en cuadrículas separadas. Cada cuadrícula tiene tres rayas de la misma colonia que se recogió de la placa de hisopo del ojo del ratón. Después de que el crecimiento apareciera en las placas, el aislante fue caracterizado por la prueba selectiva de la galjanoplastia y de la catalasa. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4: Ejemplo de resultados de MALDI-TOF MS.
Cada aislante fue cultivado en TSA durante la noche, aplicado a la diapositiva del MS de MALDI-TOF y overlaid con la solución del MS de MALDI-TOF, secado al aire y manchado en duplicado. Los resultados de Streptococcus acidominimus (A)y Aerococcus viridans (B)se identificaron positivamente con un valor de confianza de 99,9. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5: Crecimiento conjuntival commensal sesgado por sexo.
Los ratones de edad comparable de C57BL6/N fueron comparados para la diversidad commensal relativa. Los ojos fueron hisopados y los organismos commensales identificados. La especie más predominante fue Streptococcus acidominimus,que fue significativamente más abundante en ratones machos que hembras (ANOVA de 2 vías, p<0,0001). Se identificaron 5 aislados diferentes del SNC, Aerococcus viridans y E. coli. Mientras que algunos de los aislados del SNC no estaban presentes en todos los ratones, el Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans, el aislado del SNC 1 y E. coli se encontraron en todos los ratones con abundanciasdistintas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

No hay conflicto de intereses que revelar.