Visualización de encuentros con replisoma con una lesión bloqueadora etiquetada con antígeno

Resumen

Si bien las colisiones de horquilla de replicación con aductos de ADN pueden inducir roturas de doble cadena, se sabe menos sobre la interacción entre los replisomas y las lesiones de bloqueo. Hemos empleado el ensayo de ligadura de proximidad para visualizar estos encuentros y caracterizar las consecuencias para la composición replisómica.

Resumen

Existe una visión considerable de la respuesta celular a las roturas de doble cadena (DSB), inducidas por nucleasas, radiación y otros rompedores de ADN. En parte, esto refleja la disponibilidad de métodos para la identificación de los lugares de ruptura y la caracterización de los factores reclutados por los OSD en esas secuencias. Sin embargo, los DSB también aparecen como intermediarios durante el procesamiento de aductos de ADN formados por compuestos que no causan roturas directamente y no reaccionan en sitios de secuencia específicos. En consecuencia, para la mayoría de estos agentes, se desconocen las tecnologías que permiten el análisis de las interacciones de unión con factores de respuesta y proteínas de reparación. Por ejemplo, los enlaces cruzados entre cadenas de ADN (ICL) pueden provocar interrupciones después de los encuentros con la bifurcación de replicación. Aunque se forman por fármacos ampliamente utilizados como quimioterápicos del cáncer, no ha habido una metodología para monitorear sus interacciones con proteínas de replicación.

Aquí, describimos nuestra estrategia para seguir la respuesta celular a las colisiones de horquillas con estos aductos desafiantes. Vinculamos un antígeno esteroide al psoraleno, que forma ICL dependientes de fotoactivación en núcleos de células vivas. Las ICLs fueron visualizadas por inmunofluorescencia contra la etiqueta de antígeno. La etiqueta también puede ser un socio en el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) que informa la asociación cercana de dos antígenos. El PLA se explotó para distinguir las proteínas que estaban estrechamente asociadas con las ICL marcadas de las que no lo estaban. Fue posible definir proteínas replisomas que fueron retenidas después de encuentros con ICLs e identificar otras que se perdieron. Este enfoque es aplicable a cualquier estructura o aducto de ADN que pueda detectarse inmunológicamente.

Introducción

La respuesta celular a las roturas de doble cadena está bien documentada debido a una sucesión de métodos cada vez más potentes para dirigir las roturas a sitios genómicos específicos ^1,2,3. La certeza de la ubicación permite una caracterización inequívoca de las proteínas y otros factores que se acumulan en el sitio y participan en la respuesta al daño del ADN (DDR), impulsando así las vías de unión final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) que reparan las roturas. Por supuesto, muchas roturas son introducidas por agentes como la radiación y las especies químicas que no atacan secuencias específicas⁴. Sin embargo, para estos hay procedimientos disponibles que pueden convertir los extremos en estructuras susceptibles de etiquetado y localización ^5,6. Las roturas también son introducidas por procesos biológicos, como el reordenamiento de inmunoglobulinas,^{y la tecnología} reciente también permite su localización7. La relación entre los factores que responden y esos sitios se puede determinar.

Las roturas también aparecen como una consecuencia indirecta de los aductos formados por compuestos que no son rompedores inherentes pero que interrumpen las transacciones de ADN, como la transcripción y la replicación. Pueden formarse como una característica de la respuesta celular a estas obstrucciones, tal vez durante la reparación o porque provocan una estructura que es vulnerable al ataque de nucleasas. Típicamente, la relación física entre el aducto, la ruptura y la asociación con los factores que responden es inferencial. Por ejemplo, las ICLs están formadas por quimioterápicos como cisplatino y mitomicina C⁸ y como producto de reacción de sitios abásicos⁹. Las ICL son bien conocidas como bloques potentes para las horquillas de replicación¹⁰, deteniendo así las horquillas que pueden ser escindidas por las nucleasas¹¹. El enlace covalente entre hebras a menudo se alivia por vías que tienen rupturas obligadas como intermedias 12,13^, lo que requiere una recombinación homóloga para reconstruir la horquilla de replicación¹⁴. En la mayoría de los experimentos, el investigador sigue la respuesta de los factores de interés a las roturas que se forman aguas abajo de la colisión de una horquilla de replicación con una ICL. Sin embargo, debido a que no ha habido tecnología para la localización de una lesión provocativa, la proximidad del replisoma y sus partes componentes a la ICL solo se puede asumir.

Hemos desarrollado una estrategia para permitir el análisis de asociaciones de proteínas con aductos covalentes no específicos de secuencia, ilustrados aquí por ICLs. En nuestro sistema, estos son introducidos por el psoraleno, un producto natural fotoactivo utilizado durante miles de años como terapéutico para los trastornos de la piel¹⁵. Nuestro enfoque se basa en dos características importantes de los psoralenos. El primero es su alta frecuencia de formación de reticulación, que puede superar el 90% de los aductos, en contraste con el menos del 10% formado por compuestos populares como el cisplatino o la mitomicina C ^8,16. El segundo es la accesibilidad del compuesto a la conjugación sin pérdida de capacidad de reticulación. Hemos vinculado covalentemente el trimetilpsoraleno a la digoxigenina (Dig), un inmunotag establecido desde hace mucho tiempo. Esto permite la detección de los aductos de psoraleno en el ADN genómico por inmunotinción de la etiqueta Dig, y la visualización por inmunofluorescencia convencional¹⁷.

Este reactivo fue aplicado, en nuestro trabajo previo, al análisis de encuentros de horquilla de replicación con ICLs utilizando un ensayo basado en fibra de ADN¹⁶. En ese trabajo encontramos que la replicación podría continuar más allá de una ICL intacta. Esto dependía de la quinasa ATR, que se activa por estrés de replicación. El reinicio de la replicación fue inesperado dada la estructura de la helicasa replicativa CMG. Esto consiste en el heterohexámero MCM (M) que forma un anillo separado de desplazamiento alrededor de la hebra plantilla para la síntesis de la cadena principal que está bloqueada por las proteínas del complejo GINS (G, que consiste en PSF1, 2, 3 y SLD5) y CDC45 (C) ¹⁸. La propuesta de que la replicación podría reiniciarse en el lado de la ICL distal al lado de la colisión del replisoma abogaba por un cambio en la estructura del replisoma. Para abordar la cuestión de qué componentes estaban en el replisoma en el momento del encuentro con una CIT, desarrollamos el enfoque descrito aquí. Explotamos la etiqueta Dig como socio en Ensayos de Ligadura de Proximidad (PLA)¹⁹ para interrogar la estrecha asociación de la ICL con proteínas del replisoma²⁰.

Protocolo

1. Preparación celular

1. Día 1
   1. Pretrate las placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm con una solución adhesiva celular.
   2. Células en placa en los platos pretratados un día antes del tratamiento. La célula debe dividirse activamente y 50-70% confluente el día del experimento.
      NOTA: Las células HeLa se utilizaron en este experimento con Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1x penicilina / estreptomicina. No hay restricción para las líneas celulares adherentes. Sin embargo, las células no adherentes deben centrifugarse en portaobjetos y fijarse antes del análisis por PLA.
2. Día 2
   1. Preparar una solución madre de digoxigenina trimetilpsoraleno (Dig-TMP) resuspendiendo una alícuota congelada de Dig-TMP previamente sintetizado en 1:1 EtOH:H2O. Determinar la concentración midiendo OD a 250 nm de una dilución 100x (en_H2O) del Dig-TMP disuelto. El coeficiente de extinción de Dig-TMP es de 25.000. Verifique la concentración midiendo OD a 250 nm antes de cada uso y calcule la concentración madre: Abs x 100 x 10⁶/25,000 = Concentración (en μM). Generalmente, la solución madre es de alrededor de 3 mM. La solución puede almacenarse a –20 °C durante aproximadamente un mes.
      NOTA: Dig-TMP debe sintetizarse químicamente por adelantado, siguiendo el procedimiento descrito aquí. Reflujo 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno con 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amina en tolueno bajo nitrógeno durante 12 h. Retirar el disolvente y recuperar el producto 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno mediante cromatografía en gel de sílice. Conjugar el producto con éster NHS de digoxigenina en dimetilformamida y trietilamina a 50 °C durante 18 h. Eliminar el disolvente y purificar el residuo mediante cromatografía preparativa en gel de sílice de capa fina. Eluya la banda del producto cloroformo: metanol: mezcla de hidróxido de amonio al 28% (8:1:0.1). Evaporar los disolventes y disolver el pellet en 50% EtOH:H₂O.
   2. Añadir el material de Dig-TMP en EtOH:_H2Oal 50% al medio de cultivo celular hasta una concentración final de 5 μM. Llevar el medio a 37 °C. Aspirar el medio de las placas, añadir el medio que contiene Dig-TMP precalentado y colocar las placas en una incubadora (37 °C, 5% de_CO2) durante 30 min para permitir que el Dig-TMP se equilibre.
   3. Mientras las células se están incubando, precaliente la caja UV (consulte la Tabla de materiales) a 37 °C.
   4. Coloque las placas en la caja UV precalentada y exponga las células a una dosis de 3 J / cm² de luz UVA durante 5 minutos para este experimento. Las placas se colocaron encima de un termobloque mantenido a 37 °C, durante la irradiación. Calcula el tiempo usando la fórmula:
      
   5. Aspirar el medio con una pipeta, añadir el medio fresco precalentado y volver a colocar las placas en la incubadora a 37 °C, 5% de_CO2 durante 1 h.
   6. Retire los medios y lave los platos una vez suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   7. Retire PBS y agregue formaldehído (FA) al 0,1% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Esto evita el desprendimiento celular durante el pretratamiento CSK-R (tampón de extracción del citoesqueleto que contiene RNasa, descrito en 1.2.9.) necesario para extraer los elementos citoplasmáticos y reducir el fondo de PLA.
   8. Aspire FA y lave los platos con PBS una vez.
   9. Añadir tampón CSK-R e incubar durante 5 min en RT para eliminar el citoplasma [tampón CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM sacarosa, 3 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 300 μg/mL RNasa A]. Aspire el tampón, agregue CSK-R fresco e incube durante 5 minutos en RT.
      NOTA: Se puede almacenar un stock de tampón CSK a 4 °C, y se pueden agregar Triton X y RNaseA justo antes de su uso.
   10. Lavar con PBS tres veces.
   11. Fijar las células con formaldehído al 4% en PBS durante 10 min en RT.
   12. Lave las celdas con PBS. Realice este paso tres veces.
   13. Añadir metanol frío al 100% e incubar durante 20 min a -20 °C.
   14. Lave las celdas con PBS tres veces. En este punto, las células pueden almacenarse en PBS en una cámara húmeda a 4 °C durante un máximo de una semana.
   15. Incubar células en 80 μL de 5 mM TritonX-100 durante 10 min a 4 °C.
   16. Incubar células con 100 μL de 5 mM EDTA en PBS suplementado con 1 μL de 100 mg/ml de RNasa A durante 30 min a 37 °C.
   17. Lave las celdas con PBS tres veces.
   18. Almacenar las células en tampón de bloqueo (5% BSA y 10% de suero de cabra en PBS) en una cámara húmeda durante la noche a 4 °C.

2. Ensayo de ligadura de proximidad

NOTA: Realice el ensayo de ligadura de proximidad el día 3.

1. Tinción de anticuerpos
   1. Preparar 40 μL de la solución de anticuerpos primarios por placa: Añadir el volumen adecuado de anticuerpos primarios para lograr la dilución deseada (antidigoxigenina de ratón y anticuerpos de conejo contra un componente replisoma como MCM5, CDC45, PSF1 o pMCM2, diluciones especificadas en la Tabla de materiales) en el tampón de bloqueo (para alcanzar un volumen final de 24 μL). Mezcle dando un toque y déjelo reposar durante 20 minutos en RT. Prepare una mezcla maestra para múltiples muestras y mezcle golpeando antes de aplicar a los pocillos.
   2. Añadir 40 μL de solución de anticuerpos primarios al centro del pocillo e incubar en una cámara húmeda durante 1 h a 37 °C. Durante la tinción, permita que las sondas de PLA y el amortiguador de bloqueo se calienten a la temperatura ambiente.
   3. Lave las células con PBS-T [PBS-T: 0.05% Tween-20 en 1X PBS] en RT. Realice este paso tres veces.
   4. Durante el lavado, prepare 40 μL de solución de sonda de PLA por plato (las sondas de PLA consisten en un anticuerpo secundario que reconoce IgG de conejo o ratón, unido covalentemente a un oligonucleótido PLUS o MINUS): 8 μL de sonda de PLA anti ratón-PLUS + 8 μL de sonda de PLA anticuerpo anti conejo-MINUS + 24 μL de tampón de bloqueo. Mezcle y deje reposar durante 20 minutos en RT. Prepare una mezcla maestra para múltiples muestras y mezcle bien antes de aplicarla a los pocillos. Coloque la solución en el centro del pocillo en la placa.
   5. Retire el último lavado, agregue 40 μL de solución de sonda de PLA al centro del pocillo e incube en una cámara húmeda durante 1 h a 37 °C.
   6. Lavar en el tampón A tres veces, durante 10 minutos cada una, en una plataforma basculante en RT. Durante el lavado, lleve la mezcla de ligadura a RT.
2. Ligadura y amplificación
   1. Preparar 40 μL de mezcla de ligadura por placa: 8 μL (5x) de caldo de ligadura + 31 μL de agua destilada + 1 μL de ligasa. Prepare la mezcla maestra para múltiples platos y mezcle bien antes de aplicarla en los pocillos.
   2. Añadir 40 μL de solución de ligadura a cada placa e incubar en una cámara húmeda durante 30 min. a 37 °C.
   3. Lave las celdas 3 veces con tampón A, cada una durante 2 minutos, en una plataforma basculante en RT.
   4. Preparar 40 μL de solución de amplificación por plato: 8 μL (5x) de material de amplificación + 31,5 μL de agua destilada + 0,5 μL de ADN polimerasa. Prepare una mezcla maestra para múltiples muestras y mezcle bien antes de aplicarla a los pocillos.
   5. Añadir 40 μL de solución de amplificación a cada placa e incubar en una cámara húmeda a 37 °C durante 100 min.
   6. Aspirar la solución de amplificación y lavar con tampón B. Realizar 6 lavados cada uno durante 10 min, en una plataforma basculante en RT.
   7. Lavar una vez con 0.01x buffer B durante 1 min en RT.
   8. Aspirar tampón B e incubar placas con anticuerpos secundarios, Alexa Fluor 488 IgG anti-ratón y Alexa Fluor 568 IgG anti-conejo en solución de bloqueo a diluciones apropiadas en tampón de bloqueo, en una cámara húmeda, durante 30 min a 37 °C o durante la noche a 4 °C.
   9. Lave las celdas tres veces con PBS-T, durante 10 minutos cada una en una plataforma basculante en RT.
   10. Aspirar PBS-T y montar en medio de montaje con DAPI. Las placas montadas pueden visualizarse inmediatamente o almacenarse a 4 °C en la oscuridad durante no más de 4 días antes de la obtención de imágenes.

3. Imagen y cuantificación

1. Realice imágenes en un microscopio epifluorescente o confocal (si es deseable obtener imágenes 3D, cubra al menos 3 μm en 15 pilas). Realizar experimentos por triplicado e imaginar un número suficiente de campos para realizar al menos 100 observaciones por muestra o condición. Imagen de todos los campos y muestras, incluidos los controles, utilizando la misma configuración de exposición.
2. Cuantificar con un software de análisis de imágenes apropiado (consulte la Tabla de materiales para software comercial y de código abierto capaz de realizar este análisis en imágenes planas únicas o múltiples).
   1. Segmentar núcleos celulares basados en la tinción DAPI. Realizar la detección de puntos PLA nucleares. Asigne puntos PLA a su núcleo correspondiente. Exporte los puntos PLA por núcleo como un archivo csv (consulte Archivo complementario 1 y Archivo complementario 2).
3. Análisis estadístico (consulte la Tabla de materiales para obtener información sugerida de código abierto y software comercial).
   1. Verifique si las muestras siguen una distribución normal con una prueba de Shapiro-Wilk.
   2. Determine si hay una diferencia significativa entre dos muestras utilizando una prueba de Student-t (si se cumple la suposición de distribución normal) o una prueba de suma de Wilcoxon-Rank (si se viola la suposición de distribución normal para una muestra).
4. Visualización de datos: Genere diagramas de puntos combinados con diagramas de caja para visualizar la distribución de datos, mediana (Q₂^{), percentil} 25 (Q₁) y 75 para las diferentes^{muestras (consulte} la Tabla de materiales para obtener software comercial y de código abierto sugerido).

4.3D visualización de pMCM2: interacciones ICL

1. Placas de PLA de imagen en un microscopio confocal de disco giratorio, utilizando un objetivo de aceite de apertura numérica Plan Fluor 60x/1.25. Adquiera 16 pilas que cubren 1,6 mm y genere la reconstrucción 3D con el software de análisis de imágenes adecuado (ver Tabla de materiales).

Resultados

PLA de Dig-TMP con proteínas replisómicas
La estructura del Dig-TMP se muestra en la Figura 1. Los detalles de la síntesis, en la que el trimetilpsoraleno se conjugó a través de un ligador de glicol a digoxigenina, se han discutido previamente^17,21. La incubación de células con el compuesto seguida de la exposición a la luz de 365 nm (UVA) fotoactiva el compuesto e impulsa la reacción de reticulación. Algo más del...

Discusión

Aunque el PLA es una técnica muy potente, existen inquietudes técnicas que deben resolverse para obtener resultados claros y reproducibles. Los anticuerpos deben ser de alta afinidad y especificidad. Además, es importante reducir las señales de fondo no específicas tanto como sea posible. Hemos encontrado que las membranas y los desechos celulares contribuyen al fondo, y los hemos eliminado tanto como sea posible. Los lavados con detergente que contiene tampones antes de la fijación, y el lavado con metanol después de la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 568, Anticuerpo secundario de adsorción cruzada de IgG (H + L) anticuerpo secundario de adsorción cruzada	de	A-10011	1 en 1000
placas de 35 mm con cubreobjetos de vidrio 1.5	MatTek	P35-1.5-14-C Placas de	micropocillos con fondo de vidrio Micropozo de placa de Petri de 35 mm
Alexa Fluor 488, anticuerpo secundario de adsorción cruzada de cabra IgG (H + L)	Invitrogen	A-10001	1 en 1000
suero bovino albúmina (BSA)	SeraCare	1900-0012	Solución de bloqueo, los reactivos deben almacenarse a 4 & ° C
CDC45 anticuerpo (conejo)	Abcam	ab126762	1 en 200
Adhesivo celular	Life Science	354240	para solución de célula TAK
Microscopio confocal	Nikkon Nikon	TE2000 microscopio de disco giratorio	equipado con software Volocity
Anticuerpo de digoxigenina (Dig) (ratón)	Abcam	ab420	1 en 200
Dig-TMP	sintetizado en el Reactivos de amplificación Seidman Lab
Duolink (5&veces;)	de DUO82010 Sigma-Aldrich		deben almacenarse a -20 °C; Los
reactivos de detección in situ C Duolink	Sigma-Aldrich	DUO92007	reactivos deben almacenarse a -20 & grados; C
Sonda de PLA de oligonucleótido in situ C Duolink MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-ratón MINUS, los reactivos deben almacenarse a 4 & grados; C
Oligonucleótido in situ PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-conejo PLUS, los reactivos deben almacenarse a 4 & grados;
Tampón de lavado in situ C Duolink A	Sigma-Aldrich	DUO82046	tampones de lavado Duolink, los reactivos deben almacenarse a 4 & °C. Tampón
lavado in situ C Duolink Tampón de lavado B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Tampones de lavado, los reactivos deben almacenarse a 4 & grados;
Microscopio epifluorescente C Microscopio	Zeiss	Axiovert 200M	Equipado con los paquetes de software Axio Vision (Zeiss, Alemania)
Formaldehído 16%	Fisher Scientific	PI28906	para solución fija
Suero de cabra	Thermo	31873	Solución de bloqueo, los reactivos deben almacenarse a 4 & grados; C
Software de análisis de imágenes	de código abierto	El perfilador de células	funciona para el análisis de imágenes de un solo plano
Se requiere licencia de software de análisis de imágenes	Bitplane	Imaris	. Puede cuantificar puntos/núcleos de PLA en pilas de imágenes (3D) y hacer reconstrucciones 3D
de ligasa (1 unidad/μ l)	de DUO82029 Sigma-Aldrich		deben almacenarse a -20 & deg;
Reactivo de ligadura C (5 veces)	de DUO82009 Sigma-Aldrich		deben almacenarse a -20 °C; C
Anticuerpo MCM2 (conejo)	Abcam	ab4461	1 en 200
Anticuerpo MCM5 (monoclonal de conejo)	Abcam	Ab75975	1 en 1000
Metanol	Lab ALLEY	A2076	pre-frío a -20 grados; C antes de usar
phosphoMCM2S108 anticuerpo (conejo)	Abcam	ab109271	1 en 200
Polimerasa (10 unidad/μ l)	de DUO82030 Sigma-Aldrich		deben almacenarse a -20 °C; C
Prolongar los medios de montaje de oro con DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 anticuerpo (conejo)	Abcam	ab181112	1 en 200
reactivos de ARNasa A 100 mg/ml	Qiagen	19101	deben almacenarse a 4 & deg; C
Software de análisis estadístico y visualización de datos	código abierto	R studio	ggplot2 para la generación de diagramas de puntos y diagramas de caja
Se requiere licencia de software de análisis estadístico y visualización de datos:	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
Caja UV	Southern New England Ultraviolet		Descontinuado. Ver Cámara de prueba UV Opsytec como un posible reemplazo
Cámara de prueba UV	Opsytec	CÁMARA DE PRUEBA UV BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	concentrtion final es 1µ M