Visualización de encuentros con replisoma con una lesión bloqueadora etiquetada con antígeno

Resumen

Si bien las colisiones de horquilla de replicación con aductos de ADN pueden inducir roturas de doble cadena, se sabe menos sobre la interacción entre los replisomas y las lesiones de bloqueo. Hemos empleado el ensayo de ligadura de proximidad para visualizar estos encuentros y caracterizar las consecuencias para la composición replisómica.

Resumen

Existe una visión considerable de la respuesta celular a las roturas de doble cadena (DSB), inducidas por nucleasas, radiación y otros rompedores de ADN. En parte, esto refleja la disponibilidad de métodos para la identificación de los lugares de ruptura y la caracterización de los factores reclutados por los OSD en esas secuencias. Sin embargo, los DSB también aparecen como intermediarios durante el procesamiento de aductos de ADN formados por compuestos que no causan roturas directamente y no reaccionan en sitios de secuencia específicos. En consecuencia, para la mayoría de estos agentes, se desconocen las tecnologías que permiten el análisis de las interacciones de unión con factores de respuesta y proteínas de reparación. Por ejemplo, los enlaces cruzados entre cadenas de ADN (ICL) pueden provocar interrupciones después de los encuentros con la bifurcación de replicación. Aunque se forman por fármacos ampliamente utilizados como quimioterápicos del cáncer, no ha habido una metodología para monitorear sus interacciones con proteínas de replicación.

Aquí, describimos nuestra estrategia para seguir la respuesta celular a las colisiones de horquillas con estos aductos desafiantes. Vinculamos un antígeno esteroide al psoraleno, que forma ICL dependientes de fotoactivación en núcleos de células vivas. Las ICLs fueron visualizadas por inmunofluorescencia contra la etiqueta de antígeno. La etiqueta también puede ser un socio en el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) que informa la asociación cercana de dos antígenos. El PLA se explotó para distinguir las proteínas que estaban estrechamente asociadas con las ICL marcadas de las que no lo estaban. Fue posible definir proteínas replisomas que fueron retenidas después de encuentros con ICLs e identificar otras que se perdieron. Este enfoque es aplicable a cualquier estructura o aducto de ADN que pueda detectarse inmunológicamente.

Introducción

La respuesta celular a las roturas de doble cadena está bien documentada debido a una sucesión de métodos cada vez más potentes para dirigir las roturas a sitios genómicos específicos ^1,2,3. La certeza de la ubicación permite una caracterización inequívoca de las proteínas y otros factores que se acumulan en el sitio y participan en la respuesta al daño del ADN (DDR), impulsando así las vías de unión final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) que reparan las roturas. Por supuesto, muchas roturas son introducidas por agentes como la radiación y las especies química....

Protocolo

1. Preparación celular

1. Día 1
   1. Pretrate las placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm con una solución adhesiva celular.
   2. Células en placa en los platos pretratados un día antes del tratamiento. La célula debe dividirse activamente y 50-70% confluente el día del experimento.
      NOTA: Las células HeLa se utilizaron en este experimento con Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1x penicilina / estreptomicina. No hay restricción para las líneas celulares adherentes. Sin embargo, las células no adherentes deben centrifugarse en portaobjetos y fijarse antes del análisis por PLA.
2. D....

Resultados

PLA de Dig-TMP con proteínas replisómicas
La estructura del Dig-TMP se muestra en la Figura 1. Los detalles de la síntesis, en la que el trimetilpsoraleno se conjugó a través de un ligador de glicol a digoxigenina, se han discutido previamente^17,21. La incubación de células con el compuesto seguida de la exposición a la luz de 365 nm (UVA) fotoactiva el compuesto e impulsa la reacción de reticulación. Algo más del.......

Discusión

Aunque el PLA es una técnica muy potente, existen inquietudes técnicas que deben resolverse para obtener resultados claros y reproducibles. Los anticuerpos deben ser de alta afinidad y especificidad. Además, es importante reducir las señales de fondo no específicas tanto como sea posible. Hemos encontrado que las membranas y los desechos celulares contribuyen al fondo, y los hemos eliminado tanto como sea posible. Los lavados con detergente que contiene tampones antes de la fijación, y el lavado con metanol después de la.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 568, Anticuerpo secundario de adsorción cruzada de IgG (H + L) anticuerpo secundario de adsorción cruzada	de	A-10011	1 en 1000
placas de 35 mm con cubreobjetos de vidrio 1.5	MatTek	P35-1.5-14-C Placas de	micropocillos con fondo de vidrio Micropozo de placa de Petri de 35 mm
Alexa Fluor 488, anticuerpo secundario de adsorción cruzada de cabra IgG (H + L)	Invitrogen	A-10001	1 en 1000
suero bovino albúmina (BSA)	SeraCare	1900-0012	Solución de bloqueo, los reactivos deben almacenarse a 4 & ° C
CDC45 anticuerpo (conejo)	Abcam	ab126762	1 en 200
Adhesivo celular	Life Science	354240	para solución de célula TAK
Microscopio confocal	Nikkon Nikon	TE2000 microscopio de disco giratorio	equipado con software Volocity
Anticuerpo de digoxigenina (Dig) (ratón)	Abcam	ab420	1 en 200
Dig-TMP	sintetizado en el Reactivos de amplificación Seidman Lab
Duolink (5&veces;)	de DUO82010 Sigma-Aldrich		deben almacenarse a -20 °C; Los
reactivos de detección in situ C Duolink	Sigma-Aldrich	DUO92007	reactivos deben almacenarse a -20 & grados; C
Sonda de PLA de oligonucleótido in situ C Duolink MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-ratón MINUS, los reactivos deben almacenarse a 4 & grados; C
Oligonucleótido in situ PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-conejo PLUS, los reactivos deben almacenarse a 4 & grados;
Tampón de lavado in situ C Duolink A	Sigma-Aldrich	DUO82046	tampones de lavado Duolink, los reactivos deben almacenarse a 4 & °C. Tampón
lavado in situ C Duolink Tampón de lavado B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Tampones de lavado, los reactivos deben almacenarse a 4 & grados;
Microscopio epifluorescente C Microscopio	Zeiss	Axiovert 200M	Equipado con los paquetes de software Axio Vision (Zeiss, Alemania)
Formaldehído 16%	Fisher Scientific	PI28906	para solución fija
Suero de cabra	Thermo	31873	Solución de bloqueo, los reactivos deben almacenarse a 4 & grados; C
Software de análisis de imágenes	de código abierto	El perfilador de células	funciona para el análisis de imágenes de un solo plano
Se requiere licencia de software de análisis de imágenes	Bitplane	Imaris	. Puede cuantificar puntos/núcleos de PLA en pilas de imágenes (3D) y hacer reconstrucciones 3D
de ligasa (1 unidad/μ l)	de DUO82029 Sigma-Aldrich		deben almacenarse a -20 & deg;
Reactivo de ligadura C (5 veces)	de DUO82009 Sigma-Aldrich		deben almacenarse a -20 °C; C
Anticuerpo MCM2 (conejo)	Abcam	ab4461	1 en 200
Anticuerpo MCM5 (monoclonal de conejo)	Abcam	Ab75975	1 en 1000
Metanol	Lab ALLEY	A2076	pre-frío a -20 grados; C antes de usar
phosphoMCM2S108 anticuerpo (conejo)	Abcam	ab109271	1 en 200
Polimerasa (10 unidad/μ l)	de DUO82030 Sigma-Aldrich		deben almacenarse a -20 °C; C
Prolongar los medios de montaje de oro con DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 anticuerpo (conejo)	Abcam	ab181112	1 en 200
reactivos de ARNasa A 100 mg/ml	Qiagen	19101	deben almacenarse a 4 & deg; C
Software de análisis estadístico y visualización de datos	código abierto	R studio	ggplot2 para la generación de diagramas de puntos y diagramas de caja
Se requiere licencia de software de análisis estadístico y visualización de datos:	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
Caja UV	Southern New England Ultraviolet		Descontinuado. Ver Cámara de prueba UV Opsytec como un posible reemplazo
Cámara de prueba UV	Opsytec	CÁMARA DE PRUEBA UV BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	concentrtion final es 1µ M