In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

Sampath  Kumar Loganathan; Ahmad Malik; Ellen Langille; Chen Luxenburg; Daniel Schramek

doi:10.3791/61693

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Artículo de método

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

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DOI:

10.3791/61693

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2 de noviembre de 2020

Sampath Kumar Loganathan¹ , Ahmad Malik¹^,² , Ellen Langille¹^,² , Chen Luxenburg³ , Daniel Schramek¹^,²

¹Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, ²Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ³Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

En este artículo

Resumen

Aquí describimos una metodología de detección CRISPR/Cas9 rápida y directa in vivo utilizando inyecciones lentivirales embrionarias de tero guiadas por ultrasonido para evaluar simultáneamente las funciones de varios genes en la piel y la cavidad oral de ratones inmunocompetentntes.

Resumen

Los modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) han sido fundamentales para evaluar la función génica, modelar enfermedades humanas y servir como modelo preclínico para evaluar las vías terapéuticas. Sin embargo, su naturaleza de tiempo, mano de obra y costo intensivo limita su utilidad para el análisis sistemático de la función génica. Los recientes avances en las tecnologías de edición del genoma superan esas limitaciones y permiten la rápida generación de perturbaciones genéticas específicas directamente dentro de órganos específicos del ratón de una manera multiplexada y rápida. Aquí, describimos un método basado en CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para generar miles de clones genéticos knock-out dentro del epitelio de la piel y la cavidad oral de ratones, y proporcionar un protocolo que detalle los pasos necesarios para realizar una pantalla CRISPR directa in vivo para los genes supresores tumorales. Este enfoque se puede aplicar a otros órganos u otras tecnologías CRISPR/Cas9 como la activación CRISPR o la inactivación CRISPR para estudiar la función biológica de los genes durante la homeostasis tisular o en diversos entornos de la enfermedad.

Introducción

Uno de los desafíos para la investigación del cáncer en la era post-genómica es extraer la gran cantidad de datos del genoma para mutaciones genéticas causales e identificar nodos en la red genética que pueden ser dirigidos terapéuticamente. Si bien los análisis bioinformáticas han ayudado enormemente hacia estos objetivos, establecer modelos eficientes in vitro e in vivo es un requisito previo para descifrar la complejidad de los sistemas biológicos y los estados de enfermedades y para permitir el desarrollo de fármacos. Si bien los modelos convencionales de ratón transgénico se han utilizado ampliamente para estudios genéticos in vivo sobre el cáncer, su naturaleza ....