Este protocolo proporciona herramientas experimentales in vitro para evaluar la transformación de las células mamarias humanas. Se describen los pasos detallados para el seguimiento de la tasa de proliferación celular, la capacidad de crecimiento independiente del anclaje y la distribución de linajes celulares en cultivos 3D con matriz de membrana de sótano.
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Artículo de método
Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
La tumorigenesis es un proceso de varios pasos en el que las células adquieren capacidades que permiten su crecimiento, supervivencia y diseminación en condiciones hostiles. Diferentes pruebas buscan identificar y cuantificar estas señas de identidad de las células cancerosas; sin embargo, a menudo se centran en un solo aspecto de la transformación celular y, de hecho, se requieren múltiples pruebas para su caracterización adecuada. El propósito de este trabajo es proporcionar a los investigadores un conjunto de herramientas para evaluar la transformación celular in vitro desde una perspectiva amplia, lo que permite sacar conclusiones sólidas.
Una activación de señalización proliferativa sostenida es la característica principal de los tejidos tumorales y puede ser fácilmente monitoreada en condiciones in vitro calculando el número de duplicaciones de población logradas con el tiempo. Además, el crecimiento de las células en cultivos 3D permite su interacción con las células circundantes, que se asemeja a lo que ocurre in vivo. Esto permite la evaluación de la agregación celular y, junto con el etiquetado inmunofluorescente de marcadores celulares distintivos, obtener información sobre otra característica relevante de la transformación tumoral: la pérdida de una organización adecuada. Otra característica notable de las células transformadas es su capacidad para crecer sin un apego a otras células y a la matriz extracelular, que se puede evaluar con el ensayo de anclaje.
Se proporcionan procedimientos experimentales detallados para evaluar la tasa de crecimiento celular, realizar el etiquetado inmunofluorescente de marcadores de linaje celular en cultivos 3D y para probar el crecimiento celular independiente del anclaje en el agar blando. Estas metodologías están optimizadas para las células epiteliales primarias de mama (BPEC) debido a su relevancia en el cáncer de mama; sin embargo, los procedimientos se pueden aplicar a otros tipos de celda después de algunos ajustes.
Introducción
Se requieren varios eventos sucesivos para el desarrollo de neoplasias. En 2011, Hanahan y Weinberg describieron 10 capacidades que permiten transformar el crecimiento, la supervivencia y la difusión de las células: las llamadas "Marcas del Cáncer"1. La metodología descrita aquí compila tres herramientas diferentes para evaluar la transformación celular in vitro centrándose en algunas de las características distintivas de las células tumorales. Estas técnicas evalúan la tasa de proliferación celular, el comportamiento de las células cuando se cultivan en 3D y su capacidad para formar colonias con independencia de anclaje.
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Protocolo
Las muestras humanas utilizadas en los siguientes experimentos se obtuvieron a partir de mamoplastias de reducción llevadas a cabo en la Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) bajo el consentimiento de procedimiento estándar. Todos los procedimientos se realizan en un Gabinete de Seguridad Biológica de Clase II a menos que se indique lo contrario.
1. Cultivo in vitro de células epiteliales mamarias humanas y acumulación de la trama de la curva de crecimiento
-
Cultivo in vitro de células epiteliales primarias mamarias (BPEC): transaprovisionamiento celular
NOTA: Para la derivación de BPEC y el cultivo cel....
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Resultados
Se eligió un modelo experimental de transformación celular con la introducción de tres elementos genéticos en BPEC para generar resultados representativos de la transformación oncogénica6,7 (Figura 3). Los BCE no transformados (N) se derivaron del tejido mamario libre de enfermedades descrito por Ince y sus colegas6 y se cultivaron siguiendo el protocolo indicado aquí. Después de supe.......
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Discusión
Los protocolos experimentales descritos en este documento proporcionan herramientas útiles para evaluar la transformación oncogénica de las células cultivadas in vitro. Cada técnica evalúa aspectos específicos del proceso de transformación y, por lo tanto, se debe prestar especial atención al extraer conclusiones de un solo análisis. La acumulación de curvas de crecimiento es un enfoque que exige información ya disponible al cultivar células para otros fines. Esto hace que esta técnica sea más barata y fácil de aplicar e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El laboratorio AG está financiado por el Consejo Español de Seguridad Nuclear. T.A. y A.G. son miembros de un grupo de investigación reconocido por la Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT tiene un contrato financiado por la Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer. El contrato de G.F. es financiado por una subvención de cellex Foundation.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 ml Pipetas serológicas | Labclinics PLC91001 | ||
| 1,5 ml Eppendorfs Thermo | Fisher Scientific | 3451 | Dark se prefieren las eppendorfs para el almacenamiento a largo plazo de MTT |
| 10 μ l Puntas de pipeta sin filtro | Biologix | 20-0010 | |
| de vidrio de 100 ml | Con tapón, esterilizable en autoclave | ||
| 1000 μ l Puntas de pipeta con filtro | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μ l Puntas de pipeta sin filtro | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Tubos cónicos | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Pipetas serológicas | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μ l Puntas de pipeta con filtro | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Pipetas serológicas | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Tubos cónicos | VWR | 525-0304 | |
| Acetona | PanReac AppliChem | 211007 | Se utiliza para la fijación de estructuras 3D antes del marcaje inmunofluorescente |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Se utiliza para el ensayo de anclaje |
| Anticuerpo anti-Claudina 4 | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Dilución de trabajo 1:100, huésped: conejo |
| Anti-Citoqueratina 14 [RCK107] anticuerpo | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Dilución de trabajo 1:100, huésped: ratón |
| Anticuerpo anti-ratón Cyanine Cy3 | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Dilución de trabajo 1:500, huésped: cabra |
| Anti-conejo Alexa Fluor 488 anticuerpo | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Dilución de trabajo 1:500, huésped: cabra |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cultivo celular de 24 pocillos Plate | Labclinics PLC30024 | Se utiliza para cultivos 3D en Matrigel. Cultivo celular de fondo plano | |
| Placa de 6 pocillos Labclinics | PLC30006 | utilizado para el ensayo de anclaje | |
| Incubadora de células (37 º C y 5 % CO2) | |||
| Coladores de celdas | Fisherbrand | 11587522 Tamaño de malla: 40 μ m | |
| Software CellSense | Olympus | Se utiliza para la adquisición de imágenes | |
| Centrífuga | |||
| Toxina del cólera de Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Se utiliza para complementar el medio de cultivo celular |
| Clase II Cabina de seguridad biológica | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Microscopio confocal invertido | Leica | TCS SP5 | |
| Cubreobjetos | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, espesor 0,13 - 0,17 mm |
| DAPI | 2-(4-amindiofenil)-1H -indol-6-carboxamidina | ||
| Suero fetal bovino | Biowest | S1810 | Se utiliza para inactivar la acción de la tripsina |
| Software de Fiji (ImageJ) | Institutos Nacionales de Salud | RRID:SCR_002285 | Descarga gratuita, no se necesita licencia |
| vidrio Pasteur | |||
| Portaobjetos de vidrio | Fisherbrand | 11844782 | |
| Suero de cabra | Biowest | S2000 | Se utiliza para la inmunofluorescencia de estructuras 3D |
| Guantes | Se utiliza para la manipulación de agar después del autoclave | ||
| Baño calefactor (37 º C) | Se utiliza para templar soluciones antes del subcultivo celular | ||
| Baño calefactor (42 º C) | Se utiliza para mantener el agar caliente | ||
| Placa | Se utiliza para la deshidratación de Matrigel | ||
| Cámara húmeda | Se utiliza para la incubación de anticuerpos durante la inmunofluorescencia | ||
| Hielo | Se utiliza durante la manipulación de Matrigel | ||
| de caja | |||
| Olympus | IX71 | ||
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson 354234 | Tienda en -20 º C y manténgalo frío cuando esté en uso. Denominado matriz de membrana basal | |
| Metanol | PanReac AppliChem | 131091 | Se utiliza para la fijación de estructuras 3D antes del marcaje inmunofluorescente |
| Micropipeta | p1000, p200 y p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Se utiliza para calcular la duplicación de la población y para obtener la ecuación de tasa de crecimiento |
| MilliQ agua | Conocido como agua ultrapura | ||
| Esmalte | Se utiliza para sellar muestras después del montaje | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Se utiliza para cubrir la solución de anticuerpos durante la incubación |
| PBS pH 7.4 (sin calcio y magnesio) | Gibco | 10010-056 | Estéril. Se utiliza para el subcultivo |
| celular de tabletas de PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Diluido en agua miliQ. No requiere esterilidad. Se utiliza para la inmunofluorescencia |
| Pipetea Aid | |||
| Primaria T25 Frascos | Corning | 353808 | Se utiliza para el cultivo de BPEC |
| Scepter Contador de células automatizado | Millipore | PHCC20060 | Alternativamente, utilice un hemocitómetro |
| Tijeras | Se utiliza para cortar puntas | ||
| Filtros estériles 0,22 μ m | Millipore | SLGP033RS | Se utiliza para filtrar la solución de MTT |
| Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Almacene en -20 º C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Utilizado para la inmunofluorescencia de estructuras 3D |
| Tripsina-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Diluido en PBS para obtener una solución 3X |
| Vectashield Antifade Medio de montaje | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Medio | cultivo Stemgent | 00-0051 | Utilizado para el cultivo primario de BPEC |
| WIT-T Medio de | cultivo Stemgent | 00-0047 | Utilizado para la transformación del cultivo BPEC |
Referencias
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 ....
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Reimpresiones y permisos
