Esta técnica de inculcar medicamentos directamente en la tráquea de roedores neonatales es importante para estudiar el impacto de los medicamentos o biológicos administrados localmente en las enfermedades pulmonares neonatales. Además, este método también se puede utilizar para inducir lesiones pulmonares en modelos animales.
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Artículo de método
Un método mínimamente invasivo para la instilación intratraqueal de medicamentos en roedores neonatales para tratar la enfermedad pulmonar
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Resumen
Resumen
El tratamiento de roedores neonatales con medicamentos inculcados directamente en la tráquea podría servir como una herramienta valiosa para estudiar el impacto de un medicamento administrado localmente. Esto tiene un impacto traslacional directo porque el surfactante y los medicamentos se administran localmente en los pulmones. Aunque la literatura tiene muchas publicaciones que describen la intubación transoral mínimamente invasiva de ratones y ratas adultos en experimentos terapéuticos, falta este enfoque en cachorros de ratas neonatales. El pequeño tamaño de la región orotraqueal / faringe en los cachorros dificulta la visualización de la luz laríngea (cuerdas vocales), lo que contribuye a la tasa de éxito variable de la administración intratraqueal de fármacos. Por la presente, demostramos la intubación oral efectiva de cachorro de rata neonatal, una técnica que no es traumática y mínimamente invasiva, por lo que se puede utilizar para la administración en serie de medicamentos. Utilizamos un otoscopio operativo con un sistema de iluminación y una lente de aumento para visualizar la abertura traqueal de los recién nacidos de rata. Luego, el medicamento se instila con una jeringa de 1 ml conectada a una punta de pipeta. La precisión del método de administración se demostró mediante la administración de tinte azul Evans. Este método es fácil de entrenar y podría servir como una forma efectiva de inculcar medicamentos en la tráquea. Este método también podría usarse para la administración de inóculo o agentes para simular condiciones de enfermedad en animales y, también, para estrategias de tratamiento basadas en células para diversas enfermedades pulmonares.
Introducción
Los recién nacidos prematuramente tienen pulmones poco desarrollados que requieren muchas terapias intervencionistas, como la ventilación a largo plazo. Estas intervenciones sitúan a los neonatos supervivientes en un alto riesgo de secuelas posteriores1. Los modelos animales experimentales sirven como una herramienta importante para simular diversas condiciones de enfermedad, estudiar la patobiología de las enfermedades y evaluar las intervenciones terapéuticas. A pesar de que una amplia gama de modelos animales, desde ratones, ratas y conejos hasta corderos y cerdos prematuros están disponibles, los ratones y las ratas son los más utilizados.
La principal ventaja de usar ratones y ratas es el período de gestación relativamente corto y el costo reducido. También están fácilmente disponibles, son fáciles de mantener en entornos libres de enfermedades, genéticamente homogéneos y tienen una preocupación relativamente menos ética 2,3. Otra ventaja importante del modelo de roedor es que al nacer el cachorro neonatal se encuentra en la etapa canalicular tardía / saccular temprana del desarrollo pulmonar, que es morfológicamente equivalente al pulmón de un bebé humano neonatal prematuro de 24 semanas que desarrolla displasia broncopulmonar4. Además, a medida que su desarrollo pulmonar progresa rápidamente hasta su finalización dentro de las primeras 4 semanas de vida, es factible estudiar la maduración pulmonar postnatal en un marco de tiempo razonable4. A pesar de estas ventajas, el pequeño tamaño de los ratones y las crías de rata es una fuente de preocupación para varias intervenciones, lo que obliga a la mayoría de los investigadores a usar animales adultos en lugar de cachorros5. Los pulmones neonatales se encuentran en una etapa de desarrollo y la respuesta de un neonato a un agente incitador difiere de la de un adulto. Esto hace que sea apropiado utilizar modelos animales neonatales para estudiar las condiciones de la enfermedad neonatal humana.
Existen diferentes métodos para administrar medicamentos / agentes biológicos al pulmón. Esto incluye la instilación intranasal 6,7 o intratraqueal 8,9,10, así como la inhalación deaerosoles 11,12. Cada enfoque tiene sus propios desafíos técnicos, ventajas y limitaciones13. Se prefiere la vía intratraqueal de administración de agentes terapéuticos para estudiar el impacto terapéutico directo en el órgano evitando los efectos sistémicos. Esta vía también podría utilizarse para estudiar la patología pulmonar causada por agentes incitadores. Existen técnicas invasivas y mínimamente invasivas para hacer esto y es fácil de realizar en adultos. Sin embargo, en los cachorros, debido al pequeño tamaño del animal, existen desafíos técnicos asociados con el proceso de intubación. El presente estudio presenta un método de instilación intratraqueal (ITI) simple, consistente y no quirúrgico en crías de rata que podría usarse para estudiar la eficacia de diversas intervenciones terapéuticas neonatales, así como para generar modelos animales que simulan enfermedades respiratorias neonatales.
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Protocolo
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo # 2020-0035) en la Universidad Case Western Reserve. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Animales
- Obtener comercialmente ratas Sprague Dawley preñadas.
- Mantener a los animales en una instalación veterinaria aprobada con un ciclo de luz-oscuridad de 14 h / 10 h y 45-60% de humedad relativa.
2. Preparación del compuesto de prueba
- Utilice el colorante azul Evans como compuesto de prueba para evaluar la eficacia del procedimiento de instilación intratraqueal.
- Preparar una solución al 0,25% (p/v) del colorante en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) y esterilizar con filtro con un filtro de jeringa de 0,45 μm.
3. Administración de anestesia
- Anestesiar a las crías de rata utilizando anestesia gaseosa (3% de isoflurano en oxígeno al 100%), utilizando un sistema de administración modificado adaptado para neonatos de ratas pequeñas.
- Verifique la pérdida de los reflejos de la cola y el pedal y la respiración superficial para garantizar la profundidad adecuada de la anestesia para llevar a cabo el procedimiento.
4. Instilación intratraqueal (ITI)
- Use cachorros de rata en el día 5 postnatal (PN 5) para la ITI. El peso promedio de un cachorro de rata PN 5 es de 12 gramos.
- Sujete al cachorro de rata anestesiado en una plataforma plana inclinada con cinta de etiquetado de laboratorio. El cachorro está sujeto en un ángulo de aproximadamente 45 ° en la posición supina.
- Abra la boca del neonato y tire suavemente de la lengua hacia un lado con una pinza roma.
- Utilice un pequeño espéculo de otoscopio de 2 mm de diámetro conectado al otoscopio para sujetar la lengua suavemente y para una visualización adecuada de la laringe.
- Utilice el sistema iluminador de garganta, es decir, el otoscopio de funcionamiento y la lente de aumento para una visualización adecuada de las cuerdas vocales (Figura 1).
- Coloque a los animales en un ángulo de 45° en un plano inclinado. Se utilizan las tapas de barra con cable de las jaulas de ratón (Figura 2).
NOTA: Posicionar al animal en un ángulo de 45° proporciona una mejor visualización de la abertura traqueal sin la interferencia de la epiglotis. - Tome una punta de pipeta de ángulo largo que se utiliza para cargar geles de western blot. Corte la base de la punta de la pipeta con una cuchilla quirúrgica para que quepa bien en la punta de la jeringa de 1 cc.
- Use la jeringa estéril de 1 ml colocada en una punta de pipeta de ángulo largo para administrar 30-50 μL de la sustancia en el pulmón. Invierta la jeringa y aspire casi 0,9 cc de aire en la jeringa de 1 ml conectada a la punta de la pipeta seguida del tinte o la sustancia que se va a administrar. Esto permite que el aire detrás del tinte se empuje hacia la tráquea después de que se administre el tinte como se muestra en la Figura 3. La administración intratraqueal se logra visualizando la luz laríngea (cuerdas vocales) e insertando la punta de la pipeta ajustada a una jeringa en la luz traqueal.
- Use el espéculo del otoscopio para sostener la lengua y exponer las cuerdas vocales. El espéculo cumple el papel de la hoja de un laringoscopio. Doble la punta de la pipeta a un ángulo de 30° para facilitar la introducción del agente a través del espéculo en forma de cono en la abertura traqueal.
- Introduzca la punta de la pipeta en la abertura traqueal hasta el punto de aproximadamente 2 mm más allá de las cuerdas vocales. Empuje el pistón de la jeringa para administrar el tinte o el fármaco a través del espéculo del otoscopio operativo como se muestra en la Figura 3. La introducción de aire en el pulmón poco después de la administración del agente evita que la sustancia regrese a la cavidad laríngea.
- Después de administrar al cachorro con el tinte o solución salina normal, coloque a los cachorros en una almohadilla térmica de líquido circulante integrada (38 ° C) hasta que sus movimientos respiratorios sean regulares. Después de la recuperación completa de la anestesia, reúna a los cachorros con la presa.
5. Caracterización de la entrega de ITI
- Después de itI, sacrificar a las crías de rata administrando anestesia excesiva (ketamina 100 mg / kg y xilazina 10 mg / kg) / tiopentona seguida de exanguinación en un momento apropiado después de la administración. La eutanasia se realizó como parte del experimento para recolectar tejido pulmonar para demostrar la eficacia.
- Asegure al cachorro de rata sacrificado en una tabla de disección y limpie el pecho y el abdomen con alcohol etílico al 70%.
- Para evaluar la distribución del tinte en todo el pulmón, retire los pulmones del animal mediante la técnica estéril y muestre los pulmones según corresponda para la obtención de imágenes (Figura 4A, B).
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Resultados
La instilación del azul de Evans reveló la distribución multifocal del colorante que involucra todos los lóbulos pulmonares (Figura 4A, B). Nuestro resultado, como se muestra en la Figura 4 , demuestra la eficacia de la distribución a todos los lóbulos. La imagen se toma inmediatamente después de itI del tinte en la tráquea. Se logró una eficacia del 100% en la inculcación del tinte en la tráquea seguida de su propagación en todos los lóbulos de...
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Discusión
La instilación intratraqueal es un método excelente que ofrece varias ventajas sobre los métodos existentes para las intervenciones de enfermedades respiratorias, así como el desarrollo de modelos de enfermedad. Es un método rápido y con experiencia, se puede realizar con una velocidad promedio de 2-3 minutos por animal. Las consideraciones clave para una intubación exitosa son la sedación adecuada del animal, su posicionamiento correcto, especialmente la cabeza, así como la profundidad precisa de colocación / tamaño de ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por R01HD090887-01A1 del NICHD a AH. Los autores también reconocen las instalaciones proporcionadas por el laboratorio del Dr. Peter Mc Farlane, como el sistema de anestesia / almohadilla térmica por inhalación. Se agradece la valiosa asistencia de la Sra. Catherine Mayer en la creación del sistema. El organismo financiador no desempeñó ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación, el análisis y la interpretación de los datos ni en la redacción del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Evans Blue dye | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 314-13-6 | Confirmación de la administración de fármaco en los pulmones |
| Clorhidrato de ketamina | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, EE. UU. | Dispensado de un centro de cuidado de animales | Para sedación |
| Otoscopio | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, EE. UU | . 21770- 3.5V | Para la visualización de las cuerdas vocales |
| Otoscopio Mango recargable | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, EE. UU. | 71050-C | |
| Punta de pipeta (carga de gel) | Fisherbrand | 02-707-139 | Administración del medicamento |
| Plataforma para la sujeción (plano inclinado) | Centro | de cuidado de animales Dispensado desde Centro de cuidado de animales | puede utilizar el techo alambrado de la jaula de ratones |
| 3M Micropore Surgical White Paper (cinta adhesiva) | 3M, St. Paul, MN, USA | 1530-2 | |
| Luer Lock SyringeJeringas (1 ml) | BD Franklin Lakes, NJ , USA | NBD2515 | Administración del medicamento |
| Xylazine | Hospira. Inc, Lake Forest, Illinois, EE. UU | . Para sedación |
Referencias
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