MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

Resumen

La tecnología MAPS se ha desarrollado para escudriñar el targetome de un ARN regulador específico in vivo. El sRNA de interés está etiquetado con un aptámero MS2 que permite la co-purificación de sus socios de ARN y su identificación por secuenciación de ARN. Este protocolo modificado es particularmente adecuado para bacterias Gram-positivas.

Resumen

Aunque los pequeños ARN reguladores (ARNs) están muy extendidos entre el dominio bacteriano de la vida, las funciones de muchos de ellos siguen estando mal caracterizadas, en particular debido a la dificultad de identificar sus dianas de ARNm. Aquí, se describe un protocolo modificado de la purificación ms2-afinidad junto con la tecnología de secuenciación de ARN (MAPAS), con el objetivo de revelar todos los socios de ARN de un sRNA específico in vivo. En términos generales, el aptámero MS2 se fusiona con la extremidad 5' del sRNA de interés. Esta construcción se expresa entonces in vivo, permitiendo que el MS2-sRNA interactúe con sus socios celulares. Después de la recolección bacteriana, las células se lisan mecánicamente. El extracto crudo se carga en una columna de cromatografía a base de amilosa previamente recubierta con la proteína MS2 fusionada con la proteína de unión a la maltosa. Esto permite la captura específica de MS2-sRNA y de los ARN que obran recíprocamente. Después de la elución, los ARN co-purificados se identifican mediante la secuenciación de ARN de alto rendimiento y el posterior análisis bioinformático. El siguiente protocolo se ha implementado en el patógeno humano Gram-positivo Staphylococcus aureus y es, en principio, transponible a cualquier bacteria Gram-positiva. En resumen, la tecnología MAPS constituye un método eficiente para explorar profundamente la red reguladora de un sRNA en particular, ofreciendo una instantánea de todo su targetome. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los supuestos objetivos identificados por MAPS todavía necesitan ser validados por enfoques experimentales complementarios.

Introducción

Cientos, quizás incluso miles de pequeños ARN reguladores (ARNs) se han identificado en la mayoría de los genomas bacterianos, pero las funciones de la gran mayoría de ellos permanecen sin caracterizar. En general, los ARNs son moléculas cortas no codificantes, que desempeñan un papel importante en la fisiología bacteriana y la adaptación a entornos fluctuantes^1,2,3. De hecho, estas macromoléculas están en el centro de numerosas redes reguladoras intrincadas, impactando las vías metabólicas, las respuestas al estrés, pero también la virulencia y la resistencia a los antibióti....

Protocolo

1. Buffers y medios

1. Para los experimentos MAPS, prepare los siguientes búferes y medios:
   - Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ y 1 mM TDT)
   - Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltosa, 0,1% Tritón, 1 mM MgCl₂ y 1 mM TDT)
   - Tampón de carga de ARN (0,025% de xileno de cianol y 0,025% de azul de bromofenol en urea de 8 M)
   - Medio de infusión de corazón cerebral (BHI) (12,5 g de cerebro de ternero, 10 g de peptona, 5 g de corazón de res, 5 g de NaCl, 2,5 g de Na₂HPO₄ y 2 g de glucosa para 1 L)
   - Caldo de Lisogenia (LB) medio (10 g de peptona, 5 g de extrac....

Resultados

Los resultados representativos se originan en el estudio del targetome rsaC en S. aureus²⁹. RsaC es un sRNA no convencional de 1.116 nt-long. Su extremo 5' contiene varias regiones repetidas, mientras que su extremo 3' (544 nt) es estructuralmente independiente y contiene todos los sitios de interacción predichos con sus objetivos de ARNm. La expresión de este sRNA se induce cuando el manganeso (manganeso) es escaso, que se encuentra a menudo en el contexto de la inmunorespuesta del anfit.......

Discusión

Un protocolo modificado para bacterias Gram-positivas
El protocolo inicial de MAPS se desarrolló para estudiar el sRNA interactoma en el organismo modelo E. coli^20,30. Aquí, se describe un protocolo modificado que es adecuado para la caracterización de las redes reguladoras dependientes de ARN en el patógeno humano oportunista S. áureo y es ciertamente transponible a otras bacterias Gram-positivas, patógenos o no.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Tubos de centrífuga de 15 mL	Falcon	352070
Tubo de microcentrífuga de 2 mL	Starstedt	72.691
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	cantidad y calidad de
ARN Matraz de cultivo de 250 mL	Dominique Dutscher	2515074	Bacterial cultivos
Tubos de centrífuga de 50 ml Falcon		352051	Centrifugación de cultivos
Etanol absoluto	VWR Chemicals	20821.321	Extracción y purificación de ARN
Allegra X-12R Centrífuga	Beckman Coulter		Peletización bacteriana
Ampicilina (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G Medio de	crecimiento
Resina de amilosa	Nuevo Inglaterra BioLabs	E8021S	MS2-purificación por afinidad
Anti-dioxigenina AP Fragmento Fab	Sigma Aldrich	11093274910	Ensayos de Northern blot
Cassette de autorradiografía	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Ensayos de Northern
blot BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Construcción de plásmidos
Caldo	BHI (Brain Heart Infusion)Sigma-Aldrich	53286	Medio de crecimiento
Reactivo de bloqueo	Sigma Aldrich	11096176001	Ensayos de Northern blot
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Ensayos de Northern blot (sustrato)
Centrífuga 5415 R	Eppendorf		Extracción y purificación de ARN
Cloroformo	Dominique Dutscher	508320-CER	Extracción de ARN y purificación
Mezcla de marcaje DIG-RNA	Sigma-Aldrich 11277073910		Northern blot Ensayos
DNasa I	Roche	4716728001	DNasa
Eritromicina (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Medio de crecimiento
Dispositivo FastPrep	MP Biomedicals	116004500	Lisis mecánica
Tiocianato	de guanidioSigma-Aldrich	G9277-250G	Ensayos de Northern blot
Hibridación Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	Ensayos de Northern blot
Tubos de hibridación	Techne	FHB16	Ensayos de Northern blot
Alcohol isoamílico	Fisher Scientific	A/6960/08	Extracción y purificación de ARN
LB (Caldo de lisogén)	Sigma-Aldrich	L3022	Medio de crecimiento
Lysing Matrix B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Lisis mecánica
MicroPulser Electroporator	BioRad	1652100	Construcción de plásmidos
Dispositivo de agua Milli-Q	Millipore	Z00QSV0WW	Agua ultrapura
Espectrofotómetro NanoDrop	ThermoFisher Scientific		ARN/ADN cantidad y calidad
Membrana de nitrocelulosa	Dominique Dutsher	10600002	Ensayos de Northern blot
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Limpieza y descontaminación
Fenol	Carl Roth	38.2	Extracción y purificación de ARN
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs	M0530	Construcción de plásmidos
pMBP-MS2	Addgene	65104	Producción MS2-MBP
Columna de cromatografía Poly-Prep	BioRad	7311550	MS2 Purificación por afinidad
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Construcción de plásmidos
Qubit 3 Fluorímetro	Invitrogen	15387293	cantidad de ARN
Solución RNAPro	MP Biomedicals 6055050		Lisis mecánica
Kit completo ScriptSeq	Illumina	BB1224	Preparación de bibliotecas de ADNc
Espectrofotómetro Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Cultivos
bacterianos Dispositivo de vacío SpeedVac Savant ThermoFisher	Scientific	DNA120	Extracción y purificación de ARN
Stratalinker Reticulante UV 1800	Stratagene	400672	Ensayos de Northern blot
ADN ligasa T4	ThermoFisher Scientific	EL0014	Construcción de plásmidos
TBE (Tris-Borato-EDTA)	Euromedex	ET020-C Ensayos de	Northern blot
ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Construcción de plásmidos
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Ensayos de Northern blot
Procesador de película de rayos X	hu.q	HQ-350XT	Ensayos de Northern blot
Películas de rayos X Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Ensayos de Northern blot