Aislamiento, proliferación y diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo de macaco rhesus

Resumen

En este artículo, describimos el aislamiento de células madre derivadas de tejido adiposo derivadas de macaco rhesus (ADSC) utilizando un protocolo de digestión enzimática de tejidos. A continuación, describimos la proliferación de ADSC que incluye el desprendimiento celular, el conteo y el recubrimiento. Por último, la diferenciación de ADSC se describe utilizando agentes inductores adipogénicos específicos. Además, describimos técnicas de tinción para confirmar la diferenciación.

Resumen

El tejido adiposo proporciona una fuente rica y accesible de células madre multipotentes, que son capaces de autorrenovarse. Estas células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) proporcionan un sistema celular ex vivo consistente que es funcionalmente similar al de los adipocitos in vivo. El uso de ADSC en la investigación biomédica permite la investigación celular de la regulación metabólica y la función del tejido adiposo. La diferenciación ADSC es necesaria para la expansión adecuada de los adipocitos, y la diferenciación subóptima es un mecanismo importante de la disfunción adiposa. Comprender los cambios en la diferenciación de ADSC es crucial para comprender el desarrollo de la disfunción metabólica y la enfermedad. Los protocolos descritos en este manuscrito, cuando se siguen, producirán adipocitos maduros que pueden usarse para varias pruebas funcionales in vitro para evaluar la función metabólica de ADSC, que incluyen, entre otros, ensayos que miden la absorción de glucosa, lipólisis, lipogénesis y secreción. Los macacos Rhesus (Macaca mulatta) son fisiológica, anatómica y evolutivamente similares a los humanos y, como tales, sus tejidos y células se han utilizado ampliamente en la investigación biomédica y para el desarrollo de tratamientos. Aquí, describimos el aislamiento de ADSC utilizando tejido adiposo subcutáneo y omental fresco obtenido de macacos rhesus de 4 a 9 años de edad. Las muestras de tejido adiposo se digieren enzimáticamente en colagenasa seguida de filtración y centrifugación para aislar las ADSC de la fracción vascular estromal . Las ADSC aisladas proliferan en medios estromales seguidas de aproximadamente 14-21 días de diferenciación utilizando un cóctel de 0,5 μg/ml de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina y 50 μM de indometacina en medios estromales. Los adipocitos maduros se observan aproximadamente a los 14 días de diferenciación. En este manuscrito, describimos protocolos para el aislamiento, proliferación y diferenciación de ADSC in vitro. Aunque nos hemos centrado en las ADSC del tejido adiposo del macaco rhesus, estos protocolos se pueden utilizar para el tejido adiposo obtenido de otros animales con ajustes mínimos.

Introducción

El tejido adiposo está compuesto por una mezcla heterogénea de células, predominantemente adipocitos maduros y una fracción vascular estromal que incluye fibroblastos, células inmunes y células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC)^1,2,3. Las ADSC primarias pueden aislarse directamente del tejido adiposo blanco y estimularse para diferenciarse en adipocitos, cartílagos o células óseas⁴. Las ADSC exhiben características clásicas de células madre, como el mantenimiento de la multipotencia in vitro y la autorrenovación; y son adherentes al plástico en c....

Protocolo

Todos los tejidos y procedimientos obtenidos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Louisiana y se realizaron de acuerdo con las pautas del Instituto Nacional de Salud (publicación de los NIH No. 85-12, revisada en 1996).

1. Preparación de tampones y soluciones

1. Prepare una solución estéril de tampón de lavado salino tamponado con 5-fosfato (5-PBS) agregando 5% de penicilina/estreptomicina (pluma/estreptococo) y 0,25 μg/ml de inhibidor fúngico a 1x PBS. Prepare una solución estéril de tampón de lavado de 2-PBS (2-PBS) agregando 2% d....

Resultados

Las ADSC aisladas de muestras de tejido adiposo de macaco rhesus se sembraron en placas de cultivo y se muestra en la Figura 1. El día del recubrimiento, las células no son adherentes y flotan en la placa de cultivo como se muestra en la Figura 1A. Dentro de las 72 h, las ADSC se volverán 80% confluentes y estarán listas para la diferenciación de adipocitos (Figura 1B). Las ADSC exhiben fuertes características adipogénicas después d.......

Discusión

Los protocolos de aislamiento, proliferación y diferenciación de ADSC son sencillos y reproducibles, pero requieren una técnica cuidadosa para garantizar un aislamiento adecuado, una expansión saludable y una diferenciación eficiente. Un entorno de trabajo estéril es fundamental para todos los experimentos de cultivo celular. Las bacterias u hongos pueden introducirse en cultivos celulares a través de herramientas, medios o entornos de trabajo contaminados. La contaminación por hongos está indicada por el crecimiento de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,4 % azul de tripano	Thermo-Fisher	15250061
tubo de microcentrífuga de 1,5 ml	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
placa de cultivo celular de 100 mm	Corning	430167
3-Isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	I7018
50 mL tubo cónico de plástico	Fisher Scientific	50-465-232
70-µ colador de células m	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Papel de aluminio	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrífuga	Eppendorf	5810 R
Colagenasa,	Termo-Fisher	tipo I 17100017
dexametasona-soluble en agua	Sigma-Aldrich	D2915
Dimetilsulfóxido, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Agua destilada	Thermo-Fisher	15230162
Suero bovino fetal, aprobado por el USDA	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Anfotericina B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacitómetro con cubreobjetos	Sigma-Aldrich	Z359629
Indometacina	Sigma-Aldrich	I7378
Microscopio óptico invertido	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamina (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Balancín de laboratorio, de 0,5 a 1,0 Hz	Modelo científico fiable	55 Balanceo
Formalina tamponada neutra (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Aceite Rojo O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehído	Sigma-Aldrich	P6148
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4	Thermo-Fisher	10010023
tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC)	Qiagen	158904
Pipetas serológicas, de 2 a 25 ml	Costar Stripettes
cultivo celular humidificada estándar, 37 & grados; C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Tripsin-EDTA (0,25%)	Thermo-Fisher	25200056