Separación mecánica y solubilización proteica de las subcapas perivitellina externa e interna de los huevos de gallina

Summary

Este artículo informa de un método simple para aislar las subcapas perivitellina externa e interna de huevos de pollo mientras se minimiza la alteración estructural y para optimizar la solubilización proteica de cada subcapa para análisis proteómicos.

Abstract

La capa de perivitellina que rodea la yema de huevo juega un papel fundamental en la fertilización, en la defensa del óvulo y en el desarrollo del embrión aviar. Está formado por dos subcapas proteicas que están estrechamente asociadas y formadas por distintos órganos reproductivos femeninos. Se supone que ambas estructuras tienen sus propias especificidades funcionales, que aún están por definirse. Caracterizar la función de las proteínas que componen cada subcapa, el primer reto es establecer las condiciones que permitirían la separación mecánica de estas dos intrincadas capas, limitando al mismo tiempo cualquier daño estructural. El segundo paso es optimizar las condiciones experimentales para facilitar la solubilización proteica de estas dos subcapas, para posteriores análisis bioquímicos. La eficiencia de este enfoque se evalúa mediante el análisis del perfil proteico de cada subcapa por sulfato de dodecilo sódico-poli-acrilamida Gel Electroforesis (SDS-PAGE), que se espera que sea distinto entre las dos estructuras. Este procedimiento de dos pasos sigue siendo simple; requiere equipos bioquímicos clásicos y reactivos; y es compatible con más proteómica en profundidad. También se puede transponer a otros huevos aviares para la biología comparativa, sabiendo que la estructura y la composición de la capa perivitellina se ha demostrado que tienen características específicas de la especie. Además, las condiciones no desnaturalizantes desarrolladas para la separación de subcapas (paso 1) permiten sus análisis estructurales mediante microscopía electrónica de exploración y transmisión. También puede constituir el paso inicial para la posterior purificación de proteínas para analizar sus respectivas actividades biológicas y estructura 3D, o para realizar más análisis inmunohistoquímicos o funcionales. Estos estudios ayudarían a descifrar la función fisiológica de estas dos subcapas, cuyas integraciones estructurales y funcionales son criterios determinantes del éxito reproductivo.

Introduction

El propósito de este método es proporcionar un protocolo que permita la posterior caracterización bioquímica de la capa perivitellina (PL), una fina capa proteica que encierra la yema de huevo y juega un papel fundamental en la reproducción de especies aviares. El PL, también llamado "membrana vitellina" en la literatura, es una red tridimensional de fibras gruesas compuestas por varios tipos de glicoproteínas. Consiste en una capa de perivitellina interna (IPL) (en contacto con la yema) que se monta en el ovario, y de una capa perivitellina externa (OPL, en contacto con el blanco), que se encuentra en la IPL(Figura 1)y producida por el infundibulum. Este último tejido es el segmento superior similar al embudo del oviducto que recibe el folículo yolky maduro después de la ovulación, y el sitio donde se lleva a cabo la fertilización. La secreción de OPL ocurre después de estos dos eventos y es seguida por el depósito sucesivo de la clara de huevo y la cáscara de huevo en otros segmentos específicos del oviducto. Las funciones fisiológicas de la PL no sólo están relacionadas con la fertilización y las primeras etapas de la embriogénesis, sino también con la protección física y molecular del embrión. El análisis proteómico del huevo de pollo realizado en todo el PL reveló la presencia de 137 proteínas diferentes^1,pero la distribución de la mayoría de estas proteínas entre IPL y OPL sigue siendo dilucidada. La cantidad mínima de datos disponibles en la literatura indica que la IPL y la OPL presentan perfiles proteicos muy distintos^2,3,4,lo que sugiere diferentes propiedades estructurales y funcionales. La escasez relativa de datos sobre la distribución de proteínas entre OPL e IPL es probable debido a la dificultad de separar ambas subcapas que son delgadas e incrustadas.

El método presentado aquí describe las condiciones que se utilizarán para separar las dos subcapas con un impacto limitado en su respectiva estructura histológica preservando su contenido proteico, y para proporcionar el protocolo que permita la solubilización completa de las proteínas para su posterior análisis por proteómica. Incluye dos pasos principales: muestreo pl y separación OPL/IPL y 2) tratamiento PL, OPL e IPL para solubilización proteica y electroforesis para análisis de espectrometría de masas. El flujo de trabajo se presenta en la Figura 2. Notablemente, aunque el protocolo actual ha sido optimizado para análisis proteómicos (Paso 2.2), se puede detener en algunos pasos para la histología (por ejemplo, microscopía electrónica), análisis inmunohistoquímicos, estudios funcionales (paso 1), y para la purificación de proteínas solubles en sal con el fin de caracterizar su estructura y actividad biológica (paso 2.1) (Figura 2).

El primer paso es la eliminación del PL total de la yema de huevo(Figura 2,paso 1.1). Todos los métodos publicados comienzan con la separación de la clara de huevo de la yema manualmente o el uso de un separador de huevos. Le sigue la eliminación de la clara de huevo restante y la chalaza gruesa usando fórceps o mediante adsorción en un papel filtrante⁵ (Figura 2A). A continuación, las técnicas seleccionadas para muestrear PL son variables en función de los artículos publicados. Algunos trabajos incluyen varios lavados de la yema, en agua desionizada o destilada^1,5,6, en solución salina de 0.85 a 1%^2,7,8, en soluciones de amortiguación como 0.15 M NaCl/N-[Tris(hidroximetil)metil]-2-aminoethanesulfonic acid, pH 7.4⁴, o en 0.01N HCl (pH 2)³. Estos procedimientos se aplicaron al pollo, pato, faisán de cuello anillado, perdiz gris, loro cockatiel, paloma doméstica, o huevos de ratitas^2,6,9. La eliminación de PL mientras que la yema de huevo se mantiene en una placa de Petri sin soluciones acuosas puede ser muy laboriosa ya que el PL es frágil y la yema de huevo tiende a pegarse a PL^1,5 y por lo tanto sigue siendo difícil de eliminar después. Tampoco se prefiere el uso de tampón ácido o solución durante una hora a 37 °C^3, ya que tales condiciones pueden alterar la estructura pl y pueden resultar en la pérdida de proteínas. También es importante eliminar el área que contiene el disco germinal, ya que es probable que esta zona tenga un patrón estructural y molecular distinto, que no refleja todo el PL^4,6,10 ( Figura2B). Este método aprovecha las ideas destacadas por algunos artículos publicados y propone algunas mejoras para facilitar el muestreo de PL preservando su integridad(Figura 2C).

El segundo paso consiste en separar las dos subcapas(Figura 2,paso 1.2). Este paso es crítico, ya que OPL e IPL están estrechamente unidos entre sí. Este paso debe llevarse a cabo cuidadosamente con fórceps bajo un microscopio de disección binocular. Las publicaciones que informan de la separación de OPL/IPL son bastante limitadas^2,3,7,11 y algunas de ellas utilizan condiciones específicas (amortiguador ácido a 37 °C para 1 h^2,3)que pueden afectar a la estructura histológica de las subcapas y/o contribuir a la pérdida de proteínas o yemas o contaminación blancas. Para distinguir mejor la OPL de la IPL, algunos autores informaron del uso de la toluidina azul para colorear ligeramente la OPL (la capa interna permanece incolora)¹¹. En el método desarrollado, optimizamos las condiciones para que la separación se logre fácilmente y no requiera el uso de ningún tinte(Figura 2D).

El segundo paso principal es la solubilización de las proteínas que componen cada subcapa. Clásicamente, se logra mezclando^{limpias liofilizadas 1,secas 2,6,}o recién preparadas^3,4,11 PL/subcapas directamente con el tampón Laemmli utilizado para la electroforesis. Otros autores prefirieron una solubilización preliminar de las capas en 1% NaCl, en una solución de amortiguación SDS del 1%^2,3,11 o en una solución que contiene inhibidores de la proteasa y SDS⁶ a temperatura ambiente o Tritón seguido de incubación a 45 °C^12,bajo agitación vigorosa constante. Algunos autores también describieron un protocolo en el que el PL fue incubado en solución salina o urea amortiguador de fosfato y sometido a sonicación^13. Todos estos tratamientos fueron seguidos por una centrifugación y dilución en el buffer de Laemmli y todos comparten la desventaja de la solubilización de proteínas incompletas de las capas, ya que la materia insoluble (el pellet obtenido después de la centrifugación) se desecha de la muestra a analizar.

Además, el uso de condiciones de desnaturalización (urea, detergente, alta temperatura, etc.) por parte de ciertos autores para la solubilización de proteínas no es compatible con la posterior purificación de proteínas para su caracterización, ya que es probable que inactiven irreversiblemente las proteínas, interfieran con sus actividades biológicas y también perjudiquen su estructura 3D. Para este paso específico 2, el protocolo incluye un primer subpaso que permite la solubilización de las proteínas más abundantes en condiciones no de desnaturalización después de la desestructuración mecánica PL/OPL/IPL, que no interferirá con otros estudios proteicos, si es necesario(Figura 2,paso 2.1), y un segundo subpaso que permite una solubilización completa de proteínas para la electroforesis y la proteómica en profundidad(Figura 2,paso 2.2). Combina sugerencias tomadas de varios artículos publicados y ajustes resultantes de nuevas ideas validadas por estudios experimentales.

Protocol

Muestreos de 1.PL, IPL y OPL

1. Muestreo pl
   1. Rompe el huevo recién colocado sin fertilizar manualmente y usa un separador de huevos que yacía en un vaso de vidrio para separar la yema del blanco. Retire la chalazae con pequeñas tijeras y enrolle la yema sobre un papel filtrante para eliminar el albúmina adherente que aparece como una estructura transparente y visible (Figura 2A).
      PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no perforar el PL con tijeras. El uso de pinzas en lugar de tijeras para eliminar chalazas puede provocar rotura de PL y fuga posterior de yema. El paso de rodadura en el papel filtrante es crítico y debe realizarse muy rápidamente debido a las propiedades absorbentes del filtro de papel que pueden desencadenar la rotura de PL. También es muy importante utilizar un huevo sin fertilizar desde el día de la puesta, para optimizar el éxito de este primer paso y todos los pasos posteriores. Alternativamente, los huevos que se han almacenado menos de 10 días en un ambiente enfriado pueden ser utilizados, pero los experimentadores deben considerar los riesgos potenciales de alteraciones de PL.
   2. Sumerja la yema en un cristalizador que contenga 10 mM Tris-HCl pH 8 que previamente se ha enfriado hasta 4 °C y retire el área PL sobre el disco germinal dentro de una zona de 1 cm usando tijeras contundentes (Figura 2B).
      NOTA: Inicialmente, pl estaba inmerso en agua desionizada, pero este enfoque tiene algunas desventajas, como la falta de control de pH y las dificultades para separar subcapas después (paso 1.2). Por lo tanto, se probaron varias condiciones, incluyendo la concentración del Tris (Figura 3A) y el pH (Figura 3B). El uso de un tampón en el pH 8, en lugar de agua desionizada o desmineralizada, está de acuerdo con la fisiología del huevo (el pH de la clara de huevo es de aproximadamente 7,8 el día de la puesta)¹⁴ y minimiza la pérdida de proteínas. Por el contrario, se sospecha que el pH ácido o muy alcalino desencadena la desestructuración de PL y la solubilización proteica temprana(Figura 3B). El tampón compuesto por 10 mM Tris-HCl pH 8 se encontró para ser óptimo, ya que respeta la fisiología del huevo y no causa solubilización significativa de proteínas (la concentración de proteínas en el búfer de trabajo sigue siendo mínima, Figura 3A,B).
   3. Romper el PL con pequeñas tijeras en el búfer. Sostenga los dos bordes del PL roto con fórceps y pele el PL de la yema.
   4. Mantenga el PL con fórceps y enjuague el PL varias veces en varios baños de Tris-HCl de 10 mM, pH 8 hasta que no haya rastro de yema visible. En esta etapa, asegúrese de que el PL esté limpio, blanco y flotante en el búfer. Se puede procesar en el paso 1.2 para la separación de subcapas o directamente al paso 2.1 para análisis bioquímicos.
2. Muestreo de OPL e IPL
   1. Extienda toda la muestra pl colocando OPL hacia arriba en una placa de plástico Petri y manteniéndolo plana con menos arrugas como sea posible. Cubra la muestra con 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Utilice una placa de plástico Petri (y no vidrio) para limitar los movimientos pl, porque PL se adhiere mejor al plástico.
      1. Para localizar el lado OPL, mire dónde está la ubicación de los chalazas restantes que están conectados a la OPL y no a la IPL. Este paso requiere una pequeña concentración de NaCl (50 mM) para facilitar la separación de la subcapa.
         NOTA: Sobre la base del gráfico presentado en la Figura 3C y la literatura^11,esta concentración no debe conducir a una pérdida importante de proteínas. Inicialmente, el agua desionizada se utilizó para separar las subcapas, como se describió anteriormente^1,5,6,pero esta técnica se encontró que era muy laboriosa y resultó en la alteración de la integridad estructural del PL. Por lo tanto, diferentes concentraciones de NaCl(Figura 3C)fueron probadas ya que la sal facilitó la separación de las dos subcapas. Sin embargo, cabe destacar que el uso de la concentración de NaCl >100 mM aumenta la solubilización/liberación de proteínas del PL, que no es el objetivo aquí (este será el objetivo en el paso 2)(Figura 3C). Añadir NaCl de 50 mM al búfer Tris-HCl pH 8 de 10 mM facilita la separación de las dos subcapas y minimiza la pérdida de proteínas.
   2. Corta el PL total en trozos de unos 2 cm x 3 cm con pequeñas tijeras. Separe mecánicamente las dos capas de cada pieza PL con fórceps de punta ultra-precisos bajo un microscopio de disección binocular(Figura 4). Almacene las muestras de IPL y OPL resultantes individualmente en microtubos a -80 °C, hasta su uso posterior.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Cabe señalar que la eficiencia y la facilidad de separación de las dos capas depende en gran medida de la frescura del huevo. De hecho, los huevos almacenados muestran modificaciones internas drásticas debido al rápido aumento del pH de clara de huevo y la posterior alteración del índice de yema debido al aflojamiento (y debilitamiento) del PL. IPL es más frágil en comparación con OPL. Por lo tanto, es preferible colocar la cara de la OPL anterior y separar las dos subcapas tirando de OPL con los fórceps. Ambas subcapas deben ser manejadas con un cuidado precioso.

2. Tratamiento de muestras para la solubilización de proteínas y análisis SDS-PAGE

1. Solubilización primaria de proteínas
   1. Muestras de IPL y OPL liomitadas individualmente. Una vez completado el secado por congelación, corte aproximadamente 1 mg de cada muestra en microtubos limpios que posean una tapa de tornillo a prueba de fugas. Mantenga las muestras restantes en tubos bien cerrados para un almacenamiento prolongado a -80 °C.
      NOTA: El uso de microtubos con una tapa de tornillo a prueba de fugas garantiza un cierre hermético y a prueba de fugas para evitar la rehidratación de la muestra y eso asegurará las muestras.
   2. Mezclar 1 mg de cada subcapa liofilizada con 400 μL de 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Utilice un mezclador-molino durante 2 veces durante 5 minutos a 30 Hz para desintegrar las estructuras OPL y OPL en micropartículas y facilitar la solubilización de proteínas. Recoger 400 μL de las muestras que contienen la OPL y la IPL en dos microtubos limpios.
      NOTA: El búfer utilizado aquí ha sido elegido para aumentar la solubilización de proteínas (a diferencia del paso 1). Este búfer se basó en los resultados presentados en la Figura 3, que muestran un aumento de la solubilización proteica en el pH 7 (Figura 3B) y utilizando 0,5 M NaCl (Figura 3C). El protocolo se puede pausar aquí. En esta etapa, las muestras se pueden utilizar para la purificación proteica de las principales proteínas PL o procesarse al paso 2.2.
2. Solubilización proteica para la electroforesis
   1. Añadir 5x búfer de muestra SDS-PAGE (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% azul bromophenol, 50% glicerol, 5% SDS, 5% beta-mercaptoetanol, pH 6,8) a cada 400 μL de la muestra y calor a 100 °C durante 5 minutos.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, y las muestras se pueden almacenar a -80 °C. En esta etapa del protocolo, OPL e IPL están completamente disueltos. La eficiencia de la solubilización de la muestra se puede evaluar centrifugando muestras durante 5 min a 10.000 x g. La solubilización completa se caracteriza por una ausencia de pellet visible después de la centrifugación. Por lo tanto, después de una solubilización completa, se considera aquí que 1 mg de subcapa liofilizada corresponde a 1 mg de proteínas (la concentración de proteínas en la muestra de 500 μL es de 2 mg/ml). De hecho, pl se compone de más del 80% proteína^2,15. El uso de un búfer de muestra de 5x limita la dilución de la muestra, pero también se puede utilizar un búfer de muestra 1x o 2x.
   2. Cargue un máximo de 20 μg de proteínas/carril en un gel de poliacrilamida SDS (gel de gradiente del 4%-20%) y realice la electroforesis a 120 V utilizando un sistema de electroforesis vertical.
      NOTA: El uso de un gel de gradiente del 4%-20% no es obligatorio, pero es preferible aquí, ya que OPL e IPL exhiben proteínas con pesos moleculares que van desde <10 kDa a >250 kDa. También podría ser útil mantener el gel de apilamiento (que generalmente se elimina), ya que la presencia de proteínas insolubles o agregados proteicos en la parte inferior de los pozos indicaría una baja solubilización y un posible paso que falta durante la preparación de la muestra.
   3. Después de la electroforesis, retire los geles de las placas de vidrio y la mancha con la solución Coomassie Brilliant Blue (50% H₂O, 40% EtOH, 10% ácido acético y R250 Coomassie Brilliant Blue) durante 30 min.
   4. Des-mancha con una solución que consiste en 50% H₂O, 40% EtOH, 10% solución de ácido acético hasta que el fondo del gel aparece azul claro.
   5. Finalmente transfiera el gel en placas Petri que contengan agua desionizada, para lograr la des-tinción y rehidratación de geles de poliacrilamida. Las proteínas deben aparecer como bandas azules de fondo transparente.

Results

OPL e IPL fueron separados del PL de un huevo recién establecido sin fertilizar para analizar sus perfiles proteicos por SDS-PAGE. El flujo de trabajo experimental de todo el protocolo se ilustra en la Figura 2. La Figura 3 muestra la liberación de proteínas a diferentes concentraciones de Tris(Figura 3A),varios pH (Figura 3B) y diferentes concentraciones de NaCl (Figura 3C). Las dos subcapas resultantes se observaron bajo la luz del microscopio diseccionador binocular y se muestran en la Figura 4 donde la IPL es translúcida, mientras que la OPL es densa, turbia y blanquecina. Estas características pueden testificar en parte por la eficiencia de la separación de la subcapa.

Después de la separación, la OPL y la IPL fueron liofilizadas de forma independiente, y su contenido proteico se disolvió por completo gracias a una combinación de molienda mecánica, el uso de un detergente aniónico (SDS) y un agente reductor (beta-mercaptoetanol), seguido de ebullición. Después de la migración en un gel de poliacrilamida (electroforesis SDS-PAGE), las muestras de OPL e IPL exhiben perfiles electroforéticos distintos(Figura 5),como se esperaba.

Figura 1: Estructura del PL de un huevo recién colocado sin fertilizar. Micrografía de microscopía electrónica de transmisión y representación esquemática de todo el PL en sección transversal (datos personales, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, Universidad y CHRU of Tours, Francia, S. Georgeault). Tenga en cuenta que esta imagen se obtuvo de PL preparado como se presenta en este protocolo. OPL, capa perivitellina externa; IPL, capa de perivitellina interna. La punta de flecha negra indica la membrana continua que separa las dos subcapas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo que resume los dos pasos principales del protocolo y ejemplos de aplicaciones. El protocolo ha sido optimizado para el análisis proteómico de capas PL, pero se puede detener en algunos pasos para otras aplicaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Optimización de la composición del búfer para muestreo PL. Brevemente, pl limpio (n = 4) fue incubado en el mismo volumen de las diversas soluciones de amortiguación para 2 h.PL se eliminó, y la concentración de proteínas se estimó midiendo la absorbancia a 280 nm en el buffer restante. (A) Efecto de concentración Tris-HCl en pH 8. (B) Efecto del pH (7 a 9). (C) Efecto de concentración NaCl. A partir de estos resultados, llegamos a la conclusión de que el búfer compuesto por Tris-HCl de 10 mM, pH 8, NaCl de 50 mM es el más adecuado, ya que limita la pérdida de proteínas. Los resultados se expresan como una media ± desviación estándar de cuatro muestras de PL diferentes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de una prueba de comparación múltiple de Tukey. P-value <0.05 se consideró significativo (ns, no significativo; * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Características de OPL e IPL bajo un microscopio de disección binocular. Después de la separación, la IPL (a la derecha) parecía translúcida y OPL (a la izquierda) era opaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis SDS-PAGE de OPL y IPL separados del huevo recién colocado sin fertilizar. 4%–20% gel de acrilamida seguido de Coomassie brillante tinción azul. La masa de bandas estándar de peso molecular está indicada en kDa. El perfil de OPL se compone principalmente de proteínas con una masa molecular >30 kDa, mientras que las principales bandas detectadas en el perfil de IPL tienen masas moleculares <30 kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El éxito del presente protocolo se basa en dos pasos críticos que fueron optimizados de forma independiente: la separación mecánica de OPL e IPL que necesitan ser lo menos destructivos posible, seguidos de la solubilización proteica completa de cada subcapa, que es, por el contrario, desestructurada y desnaturalizada. También destaca algunos puntos específicos que deben tenerse en cuenta para garantizar el éxito de cada paso.

El protocolo no depende del color de la cáscara de huevo, el peso del huevo, el tipo de producción o la cepa genética de la gallina. Sin embargo, depende de la frescura del huevo. De hecho, el huevo sufre profundas modificaciones fisicoquímicas internas rápidamente después de ser colocado, aunque estos cambios pueden retrasarse cuando el almacenamiento se realiza en condiciones refrigeradas^14,15. La pérdida de dióxido de carbono a través de los poros de cáscara de huevo durante el almacenamiento resulta en el aumento del pH de clara de huevo (de 7,8 a 9,5), mientras que algunos intercambios de agua se producen entre la yema y el blanco, a través del PL. Ambas modificaciones impactan negativamente la estructura molecular e histológica del PL que se debilita y menos tensa^14,15,probablemente debido a modificaciones fisicoquímicas de su contenido proteico^16,17,18. Se supone que la separación de las subcapas será muy difícil con los huevos almacenados, especialmente si el almacenamiento se lleva a cabo durante un largo período a temperatura ambiente. Hasta la fecha, el protocolo se ha realizado utilizando huevos almacenados durante menos de 4 días a 4 °C y aún no se conoce la duración máxima del almacenamiento de un huevo para muestrear eficientemente las subcapas PL. Además, si el objetivo es el análisis de cada subcapa, es crucial utilizar huevos no fertilizados. El día de la puesta, el embrión de un óvulo fertilizado tiene 23 h de edad y su desarrollo es muy rápido después, si el óvulo es incubado. De hecho, el desarrollo embrionario y el crecimiento de algunas estructuras extraembryónicas se expanden utilizando PL como sustrato, que por lo tanto se degrada rápidamente, y se sustituye por el saco de yema extraembryónica¹⁹.

Después de la separación manual de la yema y la clara de huevo, la yema necesita ser limpiada de rastros de clara de huevo y de chalazas que permanecieron firmemente unidas a la PL. La punta es enrollar la yema cuidadosamente sobre un papel de filtro y realizar lavados extensos de la yema en soluciones tamponadas (10 mM Tris-HCl pH 8). El pH utilizado para el amortiguador es consistente con el pH fisiológico de la clara de huevo¹⁴ y se ha demostrado que minimiza la pérdida de proteínas (Figura 3). El uso de un búfer refrigerado ayudará a eliminar el PL de la yema porque a 4 °C, el búfer facilitará la eliminación de PL a medida que la yema lipídica se retrae y se vuelve menos fluida a esta temperatura. Los lavados adicionales permitirán la eliminación de residuos de yema del PL. También es importante cortar la zona correspondiente al disco germinal porque esta estructura que contiene pronucleus femenino puede no ser representativa del PL. Es el sitio de fertilización y multiplicación de las células embrionarias cuando el óvulo es fertilizado. Se supone que tiene una composición particular que puede no ser representativa de todo el PL, que es la razón por la que fue eliminado. Este paso específico se facilita fuertemente cuando la yema está sumergida en un búfer frío. Aunque esta estructura de disco germinal se descarta en el presente protocolo (fuera de los objetivos), los análisis específicos de esta área en óvulos fertilizados podrían ser muy útiles para los científicos interesados en estudiar la evolución del contenido de PL (proteómica y actividad) y la estructura (microscopía electrónica), durante las primeras etapas de la embriogénesis^19,20,21. En esta etapa, todo el PL está estructuralmente intacto y se puede procesar para su posterior análisis estructural mediante microscopía electrónica(Figura 2),paso 1.2 o paso 2.1 (si el objetivo es analizar todo el PL).

El paso 1.2 debe realizarse bajo un microscopio de disección binocular, ya que el PL es muy delgado y frágil (aproximadamente 10 μm de espesor). La separación de las subcapas es casi imposible en el agua o en el amortiguador que carece de sal mínima, y los intentos iniciales de usar estas opciones han dado lugar a graves daños por PL. Por lo tanto, el búfer seleccionado para este paso permanece en pH fisiológico (pH 8) y contiene NaCl de 50 mM. Este paso es arduo y debe realizarse cuidadosamente y suavemente para evitar el desgarro de PL. Una vez separados, las dos subcapas se pueden identificar fácilmente, ya que exhiben características físicas peculiares (opacas versus translúcidas). La falta de homogeneidad de la IPL bajo la luz del microscopio debe reflejar una separación incompleta y, por lo tanto, la presencia de los puntos restantes de OPL presentes en la IPL. Además, es muy difícil tratar toda la membrana y el uso de piezas de 2 cm x 3 cm mejora en gran medida las posibilidades de éxito. La subcapa resultante obtenida es adecuada para el estudio histológico mediante microscopía electrónica (Figura 1). Cabe destacar que una estructura lineal específica (0,05 a 1 μm de espesor) denominada membrana continua (CM) es visible en el micrografo(Figura 1)y permanece generalmente unida a una u otra subcapa durante el proceso de separación. Anteriormente se ha publicado que cuando se utiliza una molaridad de sal relativamente alta para la separación (500 mM), el CM permaneció unido a OPL^7, mientras que el uso de agua⁵ favorecerá la fijación de CM a IPL. En este protocolo, se utiliza una baja molaridad salada para alcanzar los objetivos específicos (subcapa PL estructuralmente intacta y pérdida mínima de proteínas), lo que significa que este CM es probable que esté asociado a la IPL. Sin embargo, un análisis adicional de la IPL y la OPL por microscopía electrónica de transmisión indicaría claramente esta hipótesis. Pl, OPL, o capas de IPL obtenidas al final del paso 1 también se pueden utilizar para ensayos in vitro para análisis de unión esperma-óvulos²² o para analizar los primeros pasos del desarrollo embrionario^23,24.

El paso 2 se refiere a la solubilización del contenido de proteínas, parcialmente (paso 2.1) o completamente (paso 2.2). Pl y/o OPL se liofilizan primero para eliminar moléculas de agua y permitir mediciones de peso precisas. De hecho, pl se compone principalmente de agua (88%)^7,mientras que la materia seca contiene esencialmente proteínas (80% a 90% dependiendo de los estudios), carbohidratos, grasas, y minerales^2,7,25. Teniendo en cuenta que el agua contenida en pl se elimina mediante el secado por congelación, que los carbohidratos se recuperan esencialmente en glicoproteínas PL, y que la grasa y los minerales se originan en yemas se desechan esencialmente por lavados extensos, se supone que el PL resultante se compone casi exclusivamente de proteínas. Por lo tanto, el valor de peso obtenido después de la liofilización completa debe corresponder principalmente a las proteínas. A continuación, la misma cantidad de PL, OPL y/o IPL se diluye en el búfer que contiene 0,5 M NaCl. La alta molaridad de sal combinada con la destrucción mecánica de la red fibrosa mediante la molienda facilita en gran medida la solubilización de proteínas en condiciones no de desnaturalizadas. Este paso es seguido por la solubilización completa usando ebullición, detergente SDS y el agente reductor beta-mercaptoetanol (paso 2.2). De hecho, algunas proteínas IPL son glicoproteínas solubles en SDS^25,26,27 y los principales componentes de la OPL son NaCl solubles^1,11. Usando este protocolo, no vimos ningún pellet restante de proteínas insolubles después de la centrifugación, lo que indica que la solubilización probablemente estaba completa. Las proteínas de PL, OPL y/o IPL fueron analizadas por SDS-PAGE. Los perfiles proteicos resultantes son consistentes con la literatura publicada^2,4,11,16,pero la resolución e intensidad de la señal es altamente mejorada y mucho más homogénea entre varios muestreos independientes de IPL y OPL.

Además, la comparación cuantitativa entre OPL e IPL es posible gracias a la precisión del peso que inferimos para las respectivas subcapas^2,7. Además, tanto los perfiles OPL como los de IPL son muy distintos y, salvo una banda débil de 14 kDa y 75 kDa, ambas subcapas PL no comparten visiblemente bandas que muestren el mismo peso molecular. Esta observación corrobora la eficiencia de la separación de subcapas sin contaminación cruzada significativa. Según el único análisis proteómico pl publicado¹, las bandas más intensas en OPL (<30 kDa) deben corresponder a lysozyme (14 kDa), proteína de capa externa de membrana vitellina 1 (17 kDa), beta-defen aviar La 11 (peso molecular aparente de 12 kDa), mientras que las bandas intensas de IPL (>30 kDa) son probablemente la proteína Zona-Pellucida 1 (102 kDa) y la proteína Zona-Pellucida 3 (47 kDa). Queda por dilucidar la distribución de las muy abundantes proteínas PL ovotransferina (78 kDa), la proteína X (45 kDa), la ovalbumina (43 kDa)¹ entre subcapas. De hecho, el alto peso molecular de estas proteínas (>30 kDa) sugiere que son proteínas IPL basadas en el perfil SDS-PAGE, pero su especificidad de tejido (proteínas expresadas por oviductos) preferiría asociar estas proteínas a OPL^28,29. Además, algunos han sugerido una posible contaminación de muestras de PL por proteínas de clara de huevo y yema de huevo debido a lavados insuficientes^1. Esta falta de información es la base para el desarrollo del presente protocolo, que se utilizará además para la proteómica cuantitativa en profundidad de PL, OPL e IPL.

Alternativamente, desde el paso 2.1 y después de la centrifugación para eliminar la materia insoluble, es posible extraer algunas proteínas específicas para una mayor caracterización bioquímica y biológica. Este enfoque se ha aplicado recientemente para caracterizar las actividades biológicas y/o la estructura 3D de los dos componentes principales de la OPL, la proteína de capa externa de membrana vitellina 1 (VMO1) y la beta-fensina aviar 11 (AvBD11)^30,31. La disponibilidad de estas proteínas como moléculas purificadas también puede ayudar a producir anticuerpos específicos para experimentos adicionales como inmunohistoquímica o para el desarrollo de ensayos cuantitativos, incluidos ensayos inmunosorbente vinculados a enzimas.

Las dos limitaciones principales de este protocolo son (1) el desafío con la separación de subcapas, especialmente si los huevos se han almacenado más de 4 días a 4°C y (2) el hecho de que la solubilización completa de la proteína requiere reducir y desnaturalizar los tampones, lo que perjudica la actividad biológica intrínsca de las muestras resultantes. En cuanto a la primera limitación, la separación mecánica requiere habilidades técnicas, pero se logra fácilmente después de 2 o 3 entrenamientos experimentales. Algunas piezas pequeñas de IPL pueden permanecer unidas a la OPL y viceversa, ya que ambas subcapas están estrechamente asociadas. Sin embargo, la contaminación de una subcapa por la otra debe ser mínima si la separación mecánica se realiza con precaución. Los perfiles típicos IPL y OPL SDS-PAGE después de una separación óptima de la subcapa se ilustran en la Figura 5. En cuanto a la segunda limitación, se han optimizado los pasos experimentales presentados en este artículo para análisis proteómicos, con el fin de proporcionar una lista exhaustiva de proteínas que componen cada subcapa. Para una mayor caracterización de las actividades biológicas de cada proteína, es necesario detenerse en el paso 2.1.2, antes de utilizar condiciones de desnaturalización (paso 2.2.1, uso de tampón con SDS y beta-mercaptoetanol seguido de ebullición). Sin embargo, cabe destacar que las proteínas resultantes del paso 2.1.2 son sólo proteínas solubles en sal, mientras que las proteínas insolubles en sal forman agregados. Una opción para evaluar aún más su actividad respectiva puede ser producir proteínas insolubles en sal como proteínas recombinantes utilizando sistemas heterologosos(E. coli,baculovirus, levadura, etc.).

Este protocolo puede adaptarse a otros huevos aviares para estudios comparativos para apreciar mejor la originalidad de cada especie. De hecho, pl muestra algunas especificidades de aves tanto estructuralmente como en términos de composición proteica, probablemente debido a la adaptación a nuevos entornos, pero también a las especificidades de desarrollo^2,6,9,32. El desarrollo de este protocolo que requiere una tecnicidad moderada y equipos/materiales clásicos abre nuevas vías de investigación en el campo de la reproducción y especiación de aves.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio binocular de disección	Vision Engineering, Francia		Liofilizador Modelo Mantis Elite
	Cryotec, Francia
Célula de electroforesis Modelo Cosmos 80 Mini-Protean II	Biorad, Hércules, EE. UU	1652960	Cualquier aparato adaptado para la electroforesis de proteínas
Molino mezclador MM400	Retsch, Hann, Alemania	20.745.0001	Molino mezclador adaptado para la molienda en seco, húmeda y criogénica de pequeñas cantidades de muestra
Tijeras de disección ultrafinas en acero inoxidable longitud 12 cm	Dutscher, Brumath	5066
Pinzas de punta ultra precisas antimagnéticas de acero inoxidable 9,5x 109,3 mm	Dutscher, Brumath	327005