Artículo de método

Generación De Modelos Experimentales Agudos Y Crónicos De La Expresión De Tic Motor En Ratas

DOI:

10.3791/61743

⸱

27 de mayo de 2021

 ,  , 
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos protocolos para la generación de modelos experimentales agudos y crónicos de expresión de tics en ratas que se comportan libremente. Los modelos se basan en la implantación de cánula estriada y posterior aplicación del antagonista GABAA. El modelo agudo utiliza inyecciones transitorias, mientras que el modelo crónico utiliza infusiones prolongadas a través de una bomba mini-osmótica implantada subcutánea.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tics motores son movimientos repentinos, rápidos y recurrentes que son los síntomas clave del síndrome de Tourette y otros trastornos tic. La patofisiología de la generación tic se asocia a la inhibición anormal de los ganglios básicos, particularmente de su estructura primaria de la entrada, el striatum. En modelos animales de roedores y primates no humanos, la aplicación local de antagonistas de GABAA, como la bicucullina y la picrotoxina, en las partes motoras del cuerpo estriado induce la desinhibición local, lo que resulta en la expresión de tics motores.

Aquí, presentamos modelos agudos y crónicos de tics motores en ratas. En el modelo agudo, las microinyecciones de bicucullina a través de una cánula implantada en el estriado dorsal provocan la expresión de tics que duran períodos de tiempo cortos de hasta una hora. El modelo crónico es una alternativa que permite la extensión de la expresión tic a períodos de varios días o incluso semanas, utilizando la infusión continua de bicuculline vía una bomba mini-osmótica subcutánea.

Los modelos permiten el estudio de los mecanismos conductuales y neuronales de la generación de tics a lo largo de la vía cortico-basal de los ganglios. Los modelos apoyan la implantación de dispositivos adicionales de registro y estimulación además de las cánulas de inyección, lo que permite una amplia variedad de usos, como la estimulación eléctrica y óptica y las grabaciones electrofisiológicas. Cada método tiene diferentes ventajas y deficiencias: el modelo agudo permite la comparación de las propiedades cinemáticas del movimiento y los cambios electrofisiológicos correspondientes antes, durante y después de la expresión de tics y los efectos de los moduladores a corto plazo sobre la expresión de tics. Este modelo agudo es simple de establecer; sin embargo, se limita a un corto período de tiempo. El modelo crónico, aunque más complejo, hace factible el estudio de la dinámica tic y los efectos conductuales sobre la expresión tic durante períodos prolongados. Por lo tanto, el tipo de consulta empírica impulsa la elección entre estos dos modelos complementarios de expresión de tics.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tics es el síntoma que define del síndrome de Tourette (TS) y de otros desordenes tic. Los tics se describen como movimientos repentinos, rápidos y recurrentes (tics motores) o vocalizaciones (tics vocales)1. La expresión de tic típicamente fluctúa en sus propiedades temporales (frecuencia)2 y espaciales (intensidad, ubicación corporal)3 en múltiples escalas de tiempo (horas, días, meses y años). Estos cambios se ven afectados por diferentes factores, tales como las características ambientales4,5,los estados de comportamiento6,7,y la supresión voluntaria y temporal8.

Aunque el mecanismo neuronal que rige los tics motores aún no se entiende completamente, un número cada vez mayor de estudios teóricos y experimentales han proporcionado nuevas evidencias en cuanto a su naturaleza9. Actualmente, la fisiopatología de la generación de tics se cree que involucra el bucle cortico-basal de los ganglios (CBG), y específicamente se asocia con la inhibición anormal del cuerpo estriado, el núcleo primario de entrada de los gangliosbasales 10,11,12. Estudios previos en roedores y primates han demostrado que el estriado puede ser desinhibido por la aplicación local de diferentes antagonistas de GABAA, tales como bicucullina y picrotoxina13,14,15,16,17,18. Esta intervención farmacológica conduce a la expresión transitoria de tic motor en el lado contralateral de la inyección, estableciendo así un modelo agudo robusto de trastornos tic con validez de cara y constructo. El modelo agudo es fácil de inducir y permite estudiar los efectos de la modulación a corto plazo, como la estimulación eléctrica y óptica concurrente con grabaciones electrofisiológicas y cinemáticas antes, durante y después de la expresión de tics. Sin embargo, el modelo agudo se limita al corto período de tiempo después de la inyección. De acuerdo con el modelo agudo, propusimos recientemente un modelo crónico de la generación tic en ratas que utilice una infusión prolongada, de la fijo-tarifa de bicuculline al striatum vía una bomba mini-osmótica subcutánea-implantada19. Este modelo extiende el período de expresión de tics a varios días/semanas. La liberación constante de bicucullina durante un largo período de tiempo permite el examen de los efectos de una variedad de factores como los tratamientos farmacológicos y los estados de comportamiento en la expresión de tics.

Aquí, presentamos protocolos para generar los modelos agudos y crónicos de expresión de tics en ratas. En función de la pregunta específica de investigación, los protocolos permiten el ajuste fino de los parámetros incluyendo la implantación unilateral versus bilateral, el sitio de los tics (según la organización somatotópica del estriado)18 y el ángulo del implante-cánula (dependiendo de la ubicación de los dispositivos implantados adicionales). El método utilizado en el modelo crónico se basa parcialmente en productos comerciales pero con ajustes críticos para ajustarse al modelo tic. En este artículo se detallan los ajustes necesarios para personalizar estos modelos de tics.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos fueron aprobados y supervisados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y se adhirieron a la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las Directrices de la Universidad de Bar-Ilan para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio en la Investigación. Este protocolo fue aprobado por el Comité Nacional de Experimentos con Animales de Laboratorio del Ministerio de Salud.

NOTA: Este protocolo utiliza ratas hembras de Long-Evans (modelos agudos y crónicos) y ratas hembra de Sprague Dawley (modelo agudo) envejecidas 3-10 meses, 280-350 g. La implementación de estos modelos en otras cepas, pesos o edades debe probarse cuidadosamente para diferentes reacciones.

1. Modelo agudo

  1. Preparación prequirúrtrica
    1. Preparación implante-cánula
      NOTA: La cánula de implante permite inyecciones locales de bicucullina en el estriado.
      1. Corte un hipotubo de acero inoxidable, 25 G (OD 0.02'', ID 0.015'') para obtener un implante-cánula(Figura 1,dispositivo #1). Utilice una herramienta giratoria para lograr bordes rectos. La longitud de la cánula depende de la profundidad del objetivo de implantación, el ángulo de implantación de la cánula y la altura final de la tapa cementada. La profundidad del objetivo de implantación debe ser 2 mm (0,079'') más alta que el objetivo de inyección final para prevenir el daño tisular.
        NOTA: El objeto más alto implantado determina la altura de la tapa.
      2. Lijar y alisar los bordes del implante-cánula, evitando la fricción mecánica adicional al cerebro. Inserte una aguja de 30 G (0.01'') a través de ella para eliminar cualquier obstrucción interna.
    2. Preparación ficticia
      NOTA: El maniquí es un cable interno removible colocado dentro de la cánula implantada. El maniquí sella la cánula implantada, evitando así su obstrucción.
      1. Haga un maniquí cortando un alambre de 0.013'' con una herramienta giratoria. El maniquí debe ser 3 mm (0.118'') más largo que la longitud del implante-cánula(Figura 1,dispositivo #2).
      2. Inserte el maniquí en la cánula del implante hasta que llegue al final. Doble el exceso de alambre pellizcándolo contra la cánula. La parte doblada debe estar al ras de la cánula del implante para evitar que el maniquí se caiga de la cánula implantada y para evitar que la rata la quite.
    3. Preparación del inyector
      NOTA: El inyector, compuesto por un tubo flexible y una cánula de inyección(Figura 1,dispositivo #3), permite la inyección directa de bicucullina en el estriado.
      1. Corte un tubo de microbordo de polímero flexible de 70 cm (27.559'') (OD 0.06'', ID 0.02'')(Figura 1,dispositivo #3.1).
        NOTA: La longitud del tubo flexible se define por la distancia entre la jaula experimental y la ubicación de la máquina de la bomba de infusión. Debe ser lo suficientemente largo como para permitir el libre movimiento de la rata durante el período de inyección, pero no demasiado largo, para evitar que la rata se enrede en ella (ver Figura 3A).
      2. Corte un hipotubo de acero inoxidable, 30 G (OD 0.012'', ID 0.007'') para obtener la cánula de inyección(Figura 1,dispositivo #3.2). Utilice una herramienta giratoria para lograr bordes rectos. Debe medir 5 mm (0.197'') más que la cánula del implante: 2 mm (0.079'') más que la cánula implantada dentro del cerebro para alcanzar el objetivo de inyección final, y 3 mm (0.118'') para insertarla en el tubo flexible.
      3. Lijar y alisar la punta de la cánula de inyección, evitando la fricción mecánica adicional al cerebro. Inserte un cable de 0,005'' de diámetro para verificar que no esté obstruido.
      4. Inserte 3 mm (0.118'') de la cánula de inyección en el tubo flexible y pegue la articulación entre ellos, para obtener un inyector. Use pegamento de cianocrilato (CA) y acelerador de CA.
      5. Coloque una jeringa con aguja de 25 G (0.018'') llena de agua estéril al inyector y lávela. Esto asegura que la orientación del flujo que sale de la cánula de inyección es recta y sin esfuerzo. Crucialmente, si el flujo no es recto, use la punta de la aguja de 30 G (OD 0.01'') para eliminar cualquier obstrucción y agrandar el orificio de la cánula de inyección, y vuelva a verificar el flujo.
    4. Preparación del soporte de la cánula
      NOTA: El soporte de la cánula está conectado al brazo estereotáxico y sostiene la cánula del implante durante la implantación. El soporte de la cánula consiste en la base del soporte de la cánula y el plomo del soporte de la cánula, que se pegan juntos(figura 1,dispositivo #4). Durante la implantación, la base del soporte de la cánula se une al brazo esteretáxico, y el plomo del soporte de la cánula se une a la cánula del implante.
      1. Base del soporte de la cánula: Corte 10 cm (3.947'') de acero inoxidable, 22 G (OD 0.028'', ID 0.017'') hipotubo(Figura 1,dispositivo #4.1).
      2. Cable soporte de cánula: Corte el alambre de 0.013'' a una longitud de 3 mm (0.118'') más largo que la cánula de implante deseada(Figura 1,dispositivo #4.2).
      3. Inserte el plomo del soporte de la cánula en la base del soporte de la cánula y pegue la junta entre ellos, usando el pegamento de CA y el acelerador de CA. El plomo debe ser 1 mm (0,039'') más corto que la cánula del implante, para evitar daños tisulares durante la implantación.
    5. Preparación de bicucullina: disolver la metodida bicucullina en solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) hasta una concentración final de 1 μg/μL. Divida la bicucullina disuelta en jeringas de 1 ml, cubra con papel de aluminio y congele a -20 °C hasta que sea necesario. Cuando sea necesario, descongele la jeringa antes de su uso.
  2. cirugía
    1. Induzca la anestesia inicial colocando la rata en una cámara diseñada y entregue el isoflurane 4-5% mezclado con un oxígeno a un índice de 0.5-1 L/min. Luego, inyecte la rata intramuscular (IM o IP) con mezcla de Ketamina y Xilazina (100 y 10 mg/kg, respectivamente).
    2. Afeitar la cabeza de la rata con un cortador eléctrico.
    3. Ponga gel de lidocaína en las orejas de la rata. Ponga vaselina en los ojos de la rata para prevenir el secado y el traumatismo de la córnea.
    4. Asegure la rata en el marco estereotáctico usando barras para los oídos y barra de dientes.
    5. Hisope el cuero cabelludo de la rata con povidona yodada y luego con alcohol para esterilizar el área. Infiltrar a lo largo de la línea de incisión deseada con 0.5 - 1% solución de lidocaína por vía subcutánea (SC). Usando una cuchilla de bisturí, haga una incisión a lo largo del cuero cabelludo.
    6. Tire de la fascia hacia los bordes para abrir el área quirúrgica.
    7. Limpie el cráneo con solución salina estéril, usando hisopos de algodón. En caso de sangrado, use un cauterizador para cauterizar el capilar sanguíneo. Este paso es crucial para la estabilidad de la tapa en el tiempo.
    8. Sujete la fascia con cuatro hemóstatos curvos (dos anteriores, dos posteriores) para agrandar el sitio quirúrgico.
    9. Mida las coordenadas bregma y lambda. Nivele las coordenadas dorsoventrales (DV) de los dos puntos, de modo que estén dentro de un rango de 100 μm.
    10. Utilizando el aparato estereotáxico, mida y marque las coordenadas de las áreas de interés y los tornillos de anclaje a implantar. Las coordenadas de la cánula de implantación recta para la inducción de tics en el área del miembro anterior son: AP: +1 a +1.5, mL: ±2.5, DV: 3; área de la extremidad posterior: AP: -0.4 a -0.5, mL: ±3.5, DV:318,20.
      NOTA: En caso de la implantación de múltiples dispositivos que impiden la implantación de cánula recta, cambie el ángulo de implantación de cánula y sus coordenadas en consecuencia (coordenadas del miembro anterior: AP: +2.7, mL: ±2.5, DV: 3, ángulo 15° de anterior a posterior).
    11. Taladrar agujeros en el cráneo bajo el microscopio. Utilice una máquina de perforación dental con 1/4-1/2 tamaño de bit de carburo redondo burs. Para minimizar los riesgos de lesión cerebral, ajuste la velocidad de perforación de acuerdo con las habilidades de perforación y evite cualquier presión mecánica. Taladro hasta que el cerebro sea visible, durante aproximadamente 1 mm. Absorba cualquier sangre con un hisopo de algodón y lávese con solución salina estéril.
      NOTA: Los tornillos de anclaje sirven para estabilizar la tapa. Asegúrese de que los tornillos estén ubicados en ambos hemisferios y a lo largo del eje anterior-posterior.
    12. Implantación de cánula
      1. Atornille los tornillos de anclaje en los agujeros. Utilice tornillos de acero inoxidable #0 x 1/8 de tamaño.
        NOTA: El número de tornillos de anclaje depende del número total de dispositivos implantados. Los tornillos de tierra (por ejemplo, para las grabaciones eléctricas o los estímulos eléctricos) deben alcanzar la superficie del cerebro.
      2. Acople el soporte de la cánula al brazo esteretáxico.
      3. Deslice la cánula del implante sobre el soporte de la cánula. Coloque lentamente la cánula de implante por encima del agujero hasta que llegue al cerebro.
      4. Mida las coordenadas DV a partir de la superficie del cerebro. Baje la cánula del implante hasta el objetivo de implantación. Absorba cualquier sangre que salga del agujero con un hisopo de algodón, lave con solución salina estéril y luego seque bien.
      5. Pegue la cánula implantada al cráneo usando pegamento de gel. Espere hasta que esté seco.
      6. Aplique cemento dental a lo largo de la cánula implantada para unirla al cráneo. Deje que 2 mm (0.079'') se extiendan desde su extremo superior para permitir la inserción ficticia. Espere hasta que esté seco.
        NOTA: No coloque cemento en el soporte de la cánula.
      7. Levante el soporte de la cánula, dejando la cánula implantada en su lugar.
      8. Inserte el maniquí en la cánula implantada.
      9. Implante todos los demás dispositivos, como matrices de grabación, fibras ópticas, electrodos de estimulación, etc. Aplique cemento dental sobre el resto del cráneo, cubriendo todos los implantes.
      10. Inyecte 3 mL de temperatura ambiente solución del campanero y carprofeno 5 mg/kg SC21.
      11. Monitoree a la rata hasta que recupere la conciencia (el animal está erguido, tiene control de sus vías respiratorias y no está en peligro de aspiración). Devolver la rata a su jaula de casa para la recuperación completa.
  3. Microinyecciones
    NOTA: Durante la inyección, es crucial verificar que el flujo de la bicucullina esté intacto. Esto se puede hacer dejando que se forme una pequeña burbuja de aire en el inyector y monitoreando su movimiento. El volumen restante del inyector puede llenarse de solución salina, de modo que no se desdichó bicucullina.
    1. Conecte el inyector a una jeringa bicúcullina con una aguja de 25 G (OD 0.018''). Llene ~ 1/3-1/2 del inyector y retire la jeringa, lo que permite la formación de una pequeña burbuja de aire.
    2. Coloque el inyector a una jeringa estéril llena de solución salina con una aguja de 25 G (OD 0.018''). Llene el inyector hasta que la bicucullina llegue al final y salga una pequeña gota de él.
    3. Retire el émbolo de un microsyringe de vidrio de precisión de 10 μL.
    4. Corte y coloque un tubo de polímero corto-flexible (~ 3 cm, 1.181'') al microsyringe de vidrio de precisión.
    5. Conecte el otro extremo del tubo corto-flexible a una jeringa de 1 ml, aguja de 25 G (OD 0.018'') llena de agua estéril.
    6. Inyecte agua a través del tubo corto-flexible en el microsyringe de vidrio de precisión hasta que el agua salga de él. Desconecte el tubo corto-flexible.
    7. Vuelva a insertar el émbolo hasta que alcance la marca de ~ 7 μL en el microsyringe de vidrio de precisión.
    8. Inserte el microsyringe de vidrio de precisión en la ranura destinada en la máquina de la bomba de infusión.
    9. Conecte el inyector al microsyringe de vidrio de precisión y configure los ajustes a una velocidad de 0,35 μL/min y un volumen total de 0,35 μL.
    10. Coloque una toallita de papel debajo de la punta del inyector. Marque la ubicación de la burbuja de aire en el inyector, inicie la máquina de la bomba de infusión y verifique que aparezca una gota de bicucullina. Después de la inyección, marque la ubicación de la burbuja de aire de nuevo.
      NOTA: La diferencia entre las dos marcas corresponde a la diferencia deseada durante la inyección experimental.
    11. Coloque la rata en la jaula experimental y retire el maniquí.
    12. Inserte el inyector en la cánula implantada a través del extremo (ver Figura 3A).
    13. Encie la máquina de la bomba de infusión. Verifique que la burbuja de aire se esté moviendo. Inicie el cronómetro para realizar un seguimiento de los tiempos de iniciación y terminación de tics.
    14. Un minuto después de la inyección, retire el inyector y vuelva a insertar lentamente el maniquí.
      NOTA: Insertar el maniquí después de la inyección empuja la bicucullina en el objetivo de inyección.
  4. Post inyección
    1. Desconecte el inyector del microsyringe de vidrio de precisión.
    2. Lave la solución restante del inyector, usando una jeringa llena de aire. Limpie el inyector con agua estéril y luego drene inyectando aire a través del inyector.
    3. Desconecte el microsyringe de vidrio de precisión de la máquina de la bomba de infusión y límpivelo con agua estéril.

2. Modelo crónico

  1. Preparación prequirúrtrica
    1. Preparación de la cánula-guía
      NOTA: La guía de cánula es parte del tubo de infusión y se utiliza para unir la cánula de infusión al soporte de cánula durante la implantación.
      1. Corte 12 mm (0.472'') de acero inoxidable, 25 G (OD 0.02'', ID 0.015'') hipotubo para obtener una guía de cánula(Figura 2,dispositivo #1). Utilice una herramienta giratoria para lograr bordes rectos.
      2. Prepare un soporte de cánula como se describe en el paso 1.1.4. Inserte el soporte de la cánula en la guía de cánula para verificar que esté correctamente conectado y retírelo.
    2. Preparación de infusión-cánula
      NOTA: La cánula de infusión también es una parte del tubo de infusión. Se implanta en el objetivo final del estriado y permite la infusión focal de bicucullina.
      1. Corte el acero inoxidable, 30 G (OD 0.012'', identificación 0.007'') hipo-tubo para obtener una infusión-cánula. Utilice una herramienta giratoria para lograr bordes rectos. La longitud total de la infusión-cánula es la suma de la profundidad de implantación deseada más un factor de seguridad (~1-2 mm, 0.039''-0.079''), la parte doblada de la cánula de infusión (2 mm, 0.079''), la superposición con la guía de la cánula (3 mm, 0.118''), y la parte horizontal (4 mm, 0.157'')(Figura 2,dispositivo #2).
        NOTA: A diferencia del modelo agudo, la profundidad de implantación es igual al objetivo de infusión final.
      2. Inserte un cable de 0,005'' de diámetro en la cánula de infusión y dóblalos en forma de L en la ubicación deseada. La parte vertical corresponde a la profundidad de implantación deseada más 4-5 mm (0.157''-0.197''), y la parte horizontal es de 4 mm (0.157'') de largo.
        NOTA: La inserción del cable interno evita la obstrucción de la cánula durante la flexión.
    3. Preparación flexible de tubos de catéter
      NOTA: También es un componente del tubo de infusión. Conecta la cánula de infusión a la bomba mini-osmótica a través de un adaptador de tubería.
      1. Corte 8 cm (3.149'') de tubería de polietileno (PE)-10 (ID 0.011'', OD 0.025'')(Figura 2,dispositivo #3).
        NOTA: La longitud del catéter está determinada por la distancia entre el objetivo de implantación y la ubicación de la bomba, lo que permite el libre movimiento de la cabeza y el cuello de la rata (ver Figura 3B).
    4. Montaje del tubo de infusión
      NOTA: El tubo de infusión conduce la bicucullina desde la bomba mini-osmótica hasta el cerebro. Consiste en la cánula-guía, la infusión-cánula, el catéter-tubo flexible, el tubo-adaptador y el flujo-moderador (Figura 2).
      1. Retire el cable interno de la cánula de infusión. Inspeccione la cánula bajo el microscopio para asegurarse de que sus bordes estén abiertos y limpios en ambos lados; si no es así, use una aguja de 30 G (OD 0.01'') para abrirla.
      2. Pegue la cánula-guía a la sección vertical de la infusión-cánula, cerca de la parte doblada, en la superposición de 3 mm (0.118''), usando pegamento ca y acelerador ca.
      3. Inserte la parte horizontal de la cánula de infusión en el tubo flexible del catéter. La superposición debe ser de al menos 2 mm (0,079'').
      4. Expulse la tapa translúcida del moderador de flujo de la bomba. Esto revelará el tubo corto de cánula de acero inoxidable(Figura 2,dispositivo #5.1).
        NOTA: El moderador de flujo es una parte del kit de bomba mini-osmótica. Se compone de una tapa translúcida, una parte corta de cánula, una brida blanca y una parte de cánula larga. La parte de cánula larga se inserta en la bomba mini-osmótica y la parte corta de la cánula se conecta a la tubería del catéter a través del adaptador de tubería.
      5. Sumergir el tubo-adaptador(Figura 2,dispositivo #4) en un 70% de alcohol. Espere varios minutos para permitir que el material se hinche.
      6. Acople el adaptador de tubería a la parte corta de la cánula del moderador de flujo, hasta que toque la brida blanca(Figura 2,dispositivo #5.2). El adaptador de tubería se encogerá en el aire para formar una conexión sellada hermética.
      7. Inserte el tubo de catéter flexible en el extremo abierto del adaptador de tubo, hasta que toque la parte corta de la cánula del moderador de flujo.
      8. Sostenga la parte de cánula larga(Figura 2,dispositivo #5.3) usando un soporte de clip y pegue todas las conexiones. Las conexiones son entre el adaptador de tubería y la brida blanca, el adaptador de tubería y el tubo de catéter flexible, y finalmente el tubo de catéter flexible y la parte horizontal de la cánula de infusión. Espere varias horas hasta que el pegamento esté completamente seco (dependiendo del tipo de pegamento).
        NOTA: Utilice adhesivo compatible con PE para evitar que las conexiones se suelten.
      9. Inyecte agua estéril a través de la parte larga de la cánula del tubo de infusión, usando una jeringa con una aguja roma de 27 G (0.014''). Verifique que el agua fluya suavemente a través de la cánula de infusión. Inyecte aire a través del tubo de infusión para drenar el agua.
    5. Cebado de la bomba mini-osmótica
      NOTA: El cebado es un procedimiento de puesta en marcha que permite a la bomba iniciar la infusión inmediatamente después de la implantación.
      1. Llene un baño de calefacción con agua a temperatura corporal (~ 37 ° C). Llene un pequeño casto con solución salina estéril y colóquelo en el baño de calefacción.
      2. Envuelva la mini bomba osmótica con una toallita de papel y fíjela verticalmente con la abertura orientada hacia arriba, utilizando un soporte de soporte para clip.
      3. Llene la bomba con ACSF usando una jeringa con una aguja roma de 27 G (0.014''). Mientras retira la jeringa, continúe inyectando el ACSF para evitar que entre aire. Aparecerá una burbuja ACSF en la abertura de la bomba.
        NOTA: La infusión inicial de ACSF permite que la rata se recupere completamente de la cirugía antes de que se indúten los tics. Opcionalmente, la bomba llena de bicucullina se puede implantar durante la cirugía primaria para evitar el siguiente reemplazo de la bomba, pero no es óptima19.
      4. Coloque una jeringa, 27 G (0.014'') aguja roma a la cánula larga-parte del tubo de infusión e inyecte ACSF a través de él. Mientras retira la jeringa, continúe inyectando el ACSF, para evitar que el aire entre. Aparecerá una burbuja ACSF en la parte larga de la cánula.
      5. Inserte la parte de cánula larga en la bomba, burbuja a burbuja. Una burbuja de ACSF debe aparecer en la punta de la cánula de infusión.
      6. Coloque la bomba en el surtidor. Preparar la bomba, unida al tubo de infusión, durante al menos 4-6 horas (a ~ 37 °C) antes de la implantación de la bomba. Asegúrese de que sólo la bomba entra en contacto con la solución salina.
    6. Cirugía de implantación de bombas
      1. Anestesiar a la rata según el protocolo de anestesia. Véase el paso 1.2.1.
      2. Afeitarse la cabeza y la espalda de la rata, usando una cortador eléctrica, ligeramente posterior a las escápulas.
      3. Realice los pasos básicos en cirugía, como se describe en los pasos 1.2.3-1.2.11. La incisión debe estar a lo largo del cuero cabelludo hasta el hueso occipital.
      4. Esterilizar un hemóstato grande (~ 14 cm de largo, 5.512'') en autoclave. Inserte el hemóstato a través de la incisión y cree una bolsa subcutánea en la espalda de la rata abriéndolo y cerrándolo alternativamente debajo de la piel a través de la línea midscapular.
        NOTA: El bolsillo debe ser lo suficientemente grande como para contener la bomba y permitir que se mueva ligeramente.
    7. Implantación de mini-bomba osmótica y tubo de infusión
      1. Coloque el soporte de la cánula al brazo estereotáxico y colóquelo en la posición deseada para la implantación.
      2. Retire la bomba del baño de calefacción y colóquela en la espalda de la rata cubierta con una toallita de papel.
      3. Deslice la guía de cánula del tubo de infusión en el soporte de la cánula.
      4. Sostenga la bomba con un hemóstato e insértela suavemente en el bolsillo subcutáneo.
      5. Implante los tornillos de anclaje.
        NOTA: Implante los tornillos de anclaje después de insertar la bomba, para evitar el bloqueo de la abertura del bolsillo, y antes de la implantación de la cánula para evitar el desplazamiento de la cánula.
      6. Implante la cánula de infusión en el objetivo y péguela al cráneo usando pegamento de gel. Espere hasta que esté seco. Las coordenadas para la inducción de tics de miembro anterior son: AP: +1 a +1.5, mL: ±2.5, DV: 5.
      7. Aplique cemento dental a lo largo de la cánula de infusión para fijarlo en el cráneo. Espere hasta que esté seco.
      8. Levante el soporte de la cánula dejando la cánula implantada en su lugar.
      9. Implante todos los demás dispositivos. Aplique cemento dental sobre el resto del cráneo, cubriendo todos los implantes. Deje suficiente tubo de catéter flexible en el bolsillo subcutáneo sin fijar para permitir el libre movimiento de la rata.
        NOTA: Asegúrese de que no haya áreas expuestas entre el cráneo y la abertura del bolsillo, y que el catéter no esté doblado.
      10. Finalice la cirugía como se detalla en los pasos 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Cirugía de reemplazo de bomba
    NOTA: Cada tipo de bomba mini-osmótica tiene su propio período de infusión de entrega predeterminado. Por lo tanto, la cirugía de reemplazo de la bomba debe realizarse antes de la fecha de vencimiento.
    1. Preparación prequirúrtrica
      1. Repita los pasos 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Llene la bomba con bicucullina usando una jeringa con una aguja roma de 27 G (0.014''). Mientras retira la jeringa, continúe inyectando bicucullina, para evitar que entre aire.
      3. Inserte el moderador de flujo (unido a su tapa translúcida) dentro de la bomba.
      4. Coloque la bomba en el surtidor. Preparar la bomba durante al menos 4-6 horas (a ~ 37 °C) antes del reemplazo de la bomba.
    2. cirugía
      1. Anestesiar a la rata (véase el paso 1.2.1.1) y afeitarse la espalda con una cortadoras eléctrica.
      2. Hisopar la espalda de la rata con povidona yodada y luego con una toallita de alcohol para esterilizar el área. Infiltre a lo largo de la línea de incisión deseada con una solución de lidocaína al 0,5-1% (SC).
      3. Haga una incisión en la piel por encima de la bomba implantada. Lavar el bolsillo con ACSF a temperatura ambiente y secar con gasas. Use cortinas desechables en autoclave para cubrir el área cerca de la incisión.
      4. Suelte la bomba llena de ACSF del moderador de flujo usando un hemóstato y deseche.
      5. Retire la bomba llena de bicucullina del baño de calefacción. Desconecte y deseche el moderador de flujo de la bomba llena de bicucullina.
      6. Suba suavemente la bomba llena de bicucullina al moderador de flujo implantado. Evite tocar la piel circundante.
        NOTA: Los pasos 2.2.2.4-2.2.2.6 deben realizarse rápidamente para evitar burbujas de aire. Sin embargo, la bomba debe insertarse lentamente para evitar la entrada rápida de bicucullina en el cerebro.
      7. Presione los dos márgenes de la incisión muy juntos, usando las autopsas. Pegue la línea de incisión con un adhesivo de tejido. Como alternativa, cierre la incisión con suturas.
      8. Hisopar el área con povidona yodada y finalizar la cirugía como se detalla en los pasos 1.2.12.10-1.2.12.11.

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Resultados

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Los protocolos para generar los modelos agudos y crónicos para la inducción tic en ratas fueron presentados arriba. Los protocolos cubren la preparación completa para la cirugía y los experimentos(Figura 1 para el modelo agudo, Figura 2 para el modelo crónico). El uso del bicuculline en las áreas del motor del striatum da lugar a la expresión de tics continuos del motor. Los tics aparecen en el lado contralateral de la aplicación y se caracterizan por contraccio...

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Discusión

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En este manuscrito, detallamos los protocolos de los modelos agudos y crónicos para la inducción tic en una rata libremente de comportamiento. Estos protocolos describen la preparación de todos los componentes, la cirugía y el proceso experimental que se puede adaptar para la personalización para satisfacer las necesidades específicas de investigación. El principio primario que subyace a estos modelos es la aplicación local directa de la bicucullina a las áreas motoras del estriado, que se sabe que juega un papel clave e...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado en parte por una subvención de la Israel Science Foundation (ISF) (297/18). Los autores agradecen a M. Bronfeld por establecer el modelo de roedor agudo y a M. Israelashvili por sus comentarios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tornillos de anclajeMicro SujetadoresSMPPS0002#0 x 1/8 - Tornillos de chapa de cabeza plana
Metioduro de bicucullinaSigma Aldrich14343
Acelerador de cianoacrilato (CA)ZapPT29
Pegamento de cianoacrilato (CA)BSIIC-2000Se descubrió que este pegamento era más fuerte que otros
Cemento dentalColteneH00322Permanente Higiénica Reparación Material Revestir Resina Autocurable
Gel PegamentoLoctiteUltra Gel Control
HemostáticoWPI 501242Cualquier hemostático de aproximadamente 14 cm sería suficiente
Hipotubo, pared extrafina 25GEmpresaproveedora de componentes HTX-25X
Hipotubo, pared regular 22GEmpresa proveedora de componentesHTX-22R
Hipotubo, pared regular 30GEmpresa de suministro de componentesHTX-30R
Máquina de bomba de infusiónNew Era Pump SystemsNE-1000
Mini-bomba osmóticaALZET20011.0µ l por hora, 7 días
adhesivo compatible con PECEYS Plásticosdifíciles especiales (adecuados para PE)
Tubo de catéter PE-10ALZETPE-10ID = 0,28 mm, OD = 0,61 mm
Microjeringa de vidrio de precisión, 10µ lHamilton800651701 RNR 10µ l syr (22s/51/3)
Adhesivo para tejidos3M1469SbVetbond
Tubing-adaptadorCMA3409500
Tygon micro bore tubing, 0.02 pulgadas ID * 0.06 ODEmpresa de suministro de componentesTND80-020
Alambre de 0.005 pulgadasEmpresa de suministro de componentesGWX-0050
Cable de 0.013 pulgadasEmpresa de suministro de componentesGWX-0130

Referencias

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