Este protocolo describe un método para aislar progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) del músculo esquelético de rata. La utilización de la rata en modelos de lesión muscular proporciona una mayor disponibilidad de tejido del músculo atrófico para el análisis y un repertorio más amplio de métodos validados para evaluar la fuerza muscular y la marcha en animales que se mueven libremente.
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Artículo de método
Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los progenitores fibroadiogénicos (FAP) son células intersticiales residentes en el músculo esquelético que, junto con los progenitores miogénicos (MP), desempeñan un papel clave en la homeostasis, lesión y reparación muscular. Los protocolos actuales para la identificación y el aislamiento de LOS FAP utilizan citometría de flujo/clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y los estudios que evalúan su función in vivo hasta la fecha se han realizado exclusivamente en ratones. El mayor tamaño inherente de la rata permite un análisis más exhaustivo de los FAPs en modelos de lesión del músculo esquelético, especialmente en el músculo severamente atrófico o cuando los investigadores requieren una masa de tejido sustancial para realizar múltiples ensayos aguas abajo. La rata también proporciona una selección más amplia de ensayos funcionales musculares que no requieren sedación o sacrificio animal, minimizando así la morbilidad y el uso de animales al permitir evaluaciones en serie. Los protocolos de citometría de flujo/FACS optimizados para ratones son específicos de cada especie, especialmente restringidos por las características de los anticuerpos disponibles comercialmente. No se han optimizado para separar los FAP de la rata o el músculo altamente fibrótico. Se desarrolló un protocolo de citometría de flujo/FACS para la identificación y aislamiento de FAPs y MPs de músculo esquelético de rata sano y denervado, basándose en la expresión diferencial de los marcadores de superficie CD31, CD45, Sca-1 y VCAM-1. Como los anticuerpos primarios validados por citometría de flujo específicos de ratas están severamente limitados, se realizó la conjugación interna del anticuerpo dirigido a Sca-1. Utilizando este protocolo, se confirmó la conjugación exitosa de Sca-1, y la identificación citométrica de flujo de FAPs y MPs fue validada por cultivo celular e inmunotinción de FAPs y MPs aislados de FACS. Finalmente, informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo prolongado (14 semanas) de denervación de ratas. Este método proporciona a los investigadores la capacidad de estudiar FAPs en un nuevo modelo animal.
Introducción
Las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) son una población de células progenitoras multipotentes residentes en el músculo esquelético que desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular y, por el contrario, también median las respuestas patológicas a la lesión muscular. Como su nombre indica, los FAP se identificaron originalmente como una población progenitora con el potencial de diferenciarse en fibroblastos y adipocitos1 y se pretendía que fueran los mediadores clave de la infiltración fibrograsa del músculo esquelético en lesiones y enfermedades crónicas. Estudios posteriores revelaron que los FAPs ....
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Protocolo
Los investigadores que llevan a cabo este protocolo deben recibir el permiso de su junta local de ética animal / comité de cuidado. Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de St. Michael's Hospital Unity Health Toronto (ACC # 918) y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC). Un esquema del protocolo de citometría de flujo se muestra en la Figura 1. Si la aplicación posterior es FACS y el cultivo celular posterior, todos los pasos deben completarse con la técnica aséptica adecuada.
1. Cosecha muscular
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Resultados
Identificación de FAPs y MPs a través de citometría de flujo utilizando un nuevo panel de anticuerpos que incluye Sca-1 y VCAM-1
La estrategia de gating para identificar FAPs en músculo de rata se basa en protocolos de citometría de flujo en elratón 29, que se acercan a las células positivas CD31 (endotelial) y CD45 (hematopoyéticas) (denominadas linaje [Lin]) y examina el perfil fluorescente del marcador FAPs Sca-1 y el marca.......
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Discusión
Un protocolo de aislamiento de FAPs optimizado y validado para el músculo de la rata es esencial para los investigadores que desean estudiar modelos de lesiones que no son factibles en el ratón por razones biológicas o técnicas. Por ejemplo, los ratones no son un modelo animal óptimo para estudiar lesiones crónicas locales o neurodegenerativas, como la denervación a largo plazo. Biológicamente, la corta vida útil y el rápido envejecimiento de los ratones dificultan la delineación precisa de las secuaras musculares debido.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a las instalaciones centrales de citometría de flujo de la Universidad de Ottawa y al Centro de Investigación Keenan para Ciencias Biomédicas (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por su experiencia y orientación en la optimización del protocolo de citometría de flujo / FACS presentado en este manuscrito. Este trabajo fue financiado por Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de fondo redondo de polipropileno de 5 mL | Falcon | 352063 | |
| Tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con tapón de filtro de celdas | Falcon | 352235 | |
| platos de cultivo celular de 10 cm | Sarstedt | 83.3902 | |
| placa de cultivo celular de 12 pocillos | ThermoFisher | 130185 | |
| cubreobjetos de vidrio de 12 mm, n.º 2 | VWR | 89015-724 | |
| Jeringa de 10 mL | Beckton Dickenson | 302995 | |
| tubos de centrífuga de 15 mL | FroggaBio | 91014 | |
| aguja de calibre 20 | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Pipeta serológica | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µ filtro de células m | Fisher Scientific | 22363547 | |
| tubos de centrífuga de 50 ml | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Perlas de compensación total de anticuerpos | ThermoFisher | A10497 | |
| Cloruro de amonio, grado reactivo | Bioshop | AMC303.500 | |
| Kit de conjugación APC, 50-100µ g | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Medio de Montaje Acuoso | Merck 108562 | ||
| Biolaminina 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Albúmina Suero Bovino (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Cloruro de Calcio | Bioshop | CCL444.500 | |
| Colagenasa Tipo II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Cuentas Contadoras Absolutas | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexametasona | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucosa (+)L-Glutamina (+)110 mg/L Piruvato de sodio |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | -- | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | ||
| Suero fetal bovino | Sigma | F1051 | |
| Citometría de flujo Vaina Fluido Beckton | Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | --Medio de | |
| montaje fluorescente | Dako | S302380-2 | |
| Cabra anti-ratón Alexa Fluor 555 anticuerpo secundario | Invitrogen | A21424 | |
| Anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario | Invitrogen | A11008 | |
| Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21429 | |
| Suero de cabra | Gibco | 16210-064 | |
| Medios de comunicación F10 de jamón | ThermoFisher | 11550043 | (+) Rojo de fenol (+) L-glutamina (-) HEPES |
| Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Suero de caballo inactivado por calor | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocitómetro | Reichert | N/A | |
| HEPES, titulación mínima del 99,5% | Sigma | H3375 | |
| Suero de caballo | ThermoFisher | 16050130 | |
| Factor de crecimiento transformador humano y beta; 1 (hTGF-y beta; 1) | Señalización celular | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | También conocido como 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | También conocido como 2-propanol |
| Lewis Rat, hembra | Charles River Kingston | 004 (Código de cepa) | 200-250 gramos usados |
| LSRFortessa X-20 Citómetro de sobremesa | Beckton Dickenson | -- | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Clasificador de células | Beckman Coulter | -- | |
| Ratón Anti-CD31::FITC Anticuerpo | Abcam | ab33858 | Clon TLD-3A12 |
| Ratón Anti-CD45::FITC Anticuerpo | Biolegend | 202205 | Clon OX-1 |
| Ratón Anti-CD106::P E Anticuerpo | Biolegend | 200403 | También conocido como VCAM-1 |
| Ratón Anticuerpo | MHC Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB) | N/A | También conocido como MF20 |
| Ratón Anti-Pax7 | Estudios del Desarrollo de Anticuerpos Banco de Hibridomas (DSHB) | N/A | |
| Formalina neutra tamponada, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Aceite Rojo O | Millipore Sigma | O0625 | |
| Kit de conjugación PE-Cy7 | Abcam | ab102903 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma | P4333 | |
| Solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Cloruro de calcio (-)Cloruro de magnesio |
| Bicarbonato de potasio, grado reactivo | Bioshop | PBC401.250 | |
| Anticuerpo anticuerpo anti-fibroblastos específicos 1 (FSP-1) de conejo | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 también conocido como S100A4 |
| Anticuerpo | anti-integrina-a7 de conejoAbcam | ab203254 | |
| Anticuerpo Anti-Laminina de Conejo | Sigma | L9393 | |
| Anticuerpo Anti-Perilipina-1 | de Conejo Abcam | ab3526 | |
| Anticuerpo Anti-Sca-1 de Conejo | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Anticuerpo Anti-Colágeno Recombinante de Conejo Tipo I | Abcam | ab260043 | También conocido como Col1a1 |
| Conejo Recombinante Anti-PDGFR Anticuerpo alfa | Abcam | ab203491 | |
| FGF humano recombinante-básico | Gibco | PHG0266 | |
| Azida sódica | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazona | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
Referencias
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J.
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Reimpresiones y permisos
