Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

Aigerim  S. Kamzina; Michelle  P. DiPalma; Joseph  G. L. Hunter; Andrew G. Diamos; Boyd Armer; Tsafrir  S. Mor; Hugh  S. Mason

doi:10.3791/61774

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Artículo de método

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

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DOI:

10.3791/61774

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16 de enero de 2021

Aigerim S. Kamzina^*¹^,²^,³ , Michelle P. DiPalma^*¹^,²^,³ , Joseph G. L. Hunter¹^,²^,³ , Andrew G. Diamos¹^,²^,⁴ , Boyd Armer²^,³ , Tsafrir S. Mor¹^,²^,³ , Hugh S. Mason¹^,²^,³

¹Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, ²School of Life Sciences, Arizona State University, ³Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, ⁴Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con GFP en Nicotiana benthamiana. Este protocolo se puede extender a la purificación y visualización de numerosas proteínas que utilizan cromatografía de columna. Además, el protocolo es adaptable al laboratorio de enseñanza en persona y en la universidad virtual, proporcionando una exploración basada en proyectos.

Resumen

La alta demanda de anticuerpos como intervenciones terapéuticas para diversas enfermedades infecciosas, metabólicas, autoinmunes, neoplásicas y otras factores crea una creciente necesidad en el desarrollo de métodos eficientes para la producción de anticuerpos recombinantes. A partir de 2019, había más de 70 anticuerpos monoclonales aprobados por la FDA, y hay un potencial de crecimiento exponencial. A pesar de su promesa, los factores limitantes para un uso generalizado son los costos de fabricación y la complejidad. Potencialmente, las plantas ofrecen estrategias de fabricación de proteínas de bajo costo, seguras y fácilmente escalables. Plantas como Nicotiana benthamiana no sólo pueden plegar y ensamblar correctamente proteínas complejas de mamíferos, sino que también pueden añadir modificaciones post-traduccionales críticas similares a las ofrecidas por los cultivos celulares de mamíferos. En este trabajo, mediante el uso de GFP nativa y una variante ácida estable de proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con anticuerpos monoclonales humanos, pudimos visualizar todo el proceso transitorio de expresión y purificación de anticuerpos de plantas N. benthamiana. Dependiendo del propósito del experimento, la fusión nativa de GFP puede garantizar una visualización más fácil durante la fase de expresión en las plantas, mientras que la fusión de PFN estable en ácido permite la visualización durante el procesamiento posterior. Este procedimiento escalable y directo puede ser realizado por un solo investigador para producir cantidades de miligramos de proteínas de fusión de anticuerpos o anticuerpos altamente puras en cuestión de días utilizando sólo unas pocas plantas pequeñas. Tal técnica puede extenderse a la visualización de cualquier tipo de proceso de purificación de anticuerpos y potencialmente muchas otras proteínas, tanto en plantas como en otros sistemas de expresión. Además, estas técnicas pueden beneficiar instrucciones virtuales y ser ejecutadas en un laboratorio de enseñanza por estudiantes de pregrado que poseen una experiencia previa mínima con técnicas de biología molecular, proporcionando una base para la exploración basada en proyectos con aplicaciones del mundo real.

Introducción

Los informes de la industria indican que trece de los veinte medicamentos más graves de los Estados Unidos eran biológicos (productos farmacéuticos a base de proteínas), de los cuales nueve eran anticuerpos. En 2019, había más de 570 terapias de anticuerpos (Ab) en varias fases de desarrollo clínico¹^,²^,³. Las ventas globales actuales de Ab superan los 100 mil millones de dólares, y se espera que el mercado terapéutico monoclonal Ab (mAb) genere hasta 300 mil millones de USD para 2025¹^,⁴. Con una demanda tan alta y aum....