Artículo de método

Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon

DOI:

10.3791/61783

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22 de enero de 2021

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1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

En este artículo

Resumen

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Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.

Resumen

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Los cánceres colorrectales son caracterizados por heterogeneidad y una organización jerárquica que comprende una población de las células madres del cáncer (CSCs) responsables del desarrollo, del mantenimiento, y de la resistencia del tumor a las drogas. Una mejor comprensión de las propiedades de CSC para su orientación específica es, por lo tanto, un requisito previo para la terapia efectiva. Sin embargo, hay una escasez de modelos preclínicos adecuados para investigaciones en profundidad. Aunque las variedades de células bidimensionales ines vitro (2D) del cáncer proporcionen penetraciones valiosas en biología del tumor, no replican la heterogeneidad fenotípica y genética del tumor. Por el contrario, los modelos tridimensionales (3D) abordan y reproducen la complejidad casi fisiológica del cáncer y la heterogeneidad celular. El objetivo de este trabajo fue diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible para estudiar la biología csc. La presente metodología describe el desarrollo y optimización de condiciones para generar esferoides 3D, de tamaño homogéneo, a partir de células de adenocarcinoma de colon Caco2, un modelo que puede ser utilizado para el cultivo a largo plazo. Importantemente, dentro de los esferoides, las células que fueron organizadas alrededor lumen-como las estructuras, fueron caracterizadas por los patrones diferenciados de la proliferación de célula y por la presencia de CSCs que expresaban un panel de marcadores. Estos resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque 3D para estudiar la heterogeneidad celular y la biología csc, incluyendo la respuesta a la quimioterapia.

Introducción

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El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo la segunda causa principal de muertes asociadas al cáncer en el mundo1. El desarrollo de la CCR es el resultado de una progresiva adquisición y acumulación de mutaciones genéticas y/o alteraciones epigenéticas2,3,incluyendo la activación de oncogenes e inactivación de genes supresores tumorales3,4. Además, los factores no genéticos (por ejemplo, el microambiente) pueden contribuir y promover la transformación oncogénica y, por lo tanto, participar en la evolución de los CCR5. Es importante destacar que los CRCs están compuestos por diferentes poblaciones celulares, incluyendo CSCs indiferenciados y células tumorales a granel que muestran algunos rasgos de diferenciación, que constituyen una estructura jerárquica que recuerda a la organización del epitelio en una cripta normal del colon6,7.

Se considera que las CSCs son responsables de la aparición del tumor8,su mantenimiento y crecimiento, capacidad metastásica y resistencia a las terapias convencionales6,7. Dentro de los tumores, las células cancerosas, incluidas las CSCs, muestran un alto nivel de heterogeneidad y complejidad en términos de sus distintos perfiles mutacionales y epigenéticos, diferencias morfológicas y fenotípicas, expresión génica, metabolismo, tasas de proliferación y potencial metastásico9. Por lo tanto, para comprender mejor la biología del cáncer, la progresión tumoral y la adquisición de resistencia a la terapia y su traducción en tratamientos efectivos, los modelos preclínicos humanos que capturan esta heterogeneidad y jerarquía del cáncer son importantes10,11.

Las variedades de células ines vitro del cáncer 2D se han utilizado durante mucho tiempo y proporcionan penetraciones valiosas en el desarrollo del tumor y los mecanismos que son la base de la eficacia de moléculas terapéuticas. Sin embargo, su limitación con respecto a la falta de heterogeneidad fenotípica y genética encontrada en los tumores originales es ahora ampliamente reconocida12. Por otra parte, los nutrientes, el oxígeno, los gradientes de pH y el microambiente tumoral no se reproducen, siendo el microambiente especialmente importante para el mantenimiento de diferentes tipos celulares, incluidas las CSCs11,12. Para superar estos principales inconvenientes, se han desarrollado varios modelos 3D para abordar y reproducir experimentalmente la complejidad y heterogeneidad de los cánceres. En efecto, estos modelos recapitulan la heterogeneidad celular tumoral, las interacciones célula-célula y la arquitectura espacial, similares a las observadas in vivo12,13,14. Los organoides tumorales primarios establecidos a partir de tumores frescos, así como los esferoides derivados de líneas celulares, se emplean en gran medida15,16.

Los esferoides se pueden cultivar de una manera libre de andamios o basada en andamios para forzar a las células a formarse y crecer en agregados celulares. Los métodos libres de andamios se basan en el cultivo de células en condiciones no adherentes (por ejemplo, el método de colgar y soltar o placas de fijación ultrabajos), mientras que los modelos basados en andamios se basan en biomateriales naturales, sintéticos o híbridos para cultivar células12,13,14. Los esferoides basados en andamios presentan diferentes desventajas, ya que la formación final del esferoide dependerá de la naturaleza y composición del (bio)material utilizado. Aunque los métodos de esferoides sin andamios disponibles hasta ahora no se basan en la naturaleza del sustrato, generan esferoides que varían en estructura y tamaño17,18.

Este trabajo tuvo como objetivo diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible de esferoides, de tamaño homogéneo, compuesto por células de adenocarcinoma de colon Caco2 para estudiar la biología csc. Las células Caco2 son de particular interés debido a su capacidad para diferenciarse con el tiempo19,20,lo que sugiere fuertemente un potencial similar al tallo. Por consiguiente, la cultura de largo plazo de los esferoides reveló la presencia de diversas poblaciones del CSC con diversas respuestas a la quimioterapia.

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Protocolo

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NOTA: Los detalles de todos los reactivos y materiales se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Formación de esferoides

  1. Medios de cultivo esferoide
    1. Prepare el medio básico que consiste en el medio modificado del águila de Dulbecco (DMEM) complementado con el dipéptido de la L-alanil-L-glutamina de 4 milímetros.
    2. Preparar el medio completo DMEM que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Pen/Strep) en medio basal a partir del paso 1.1.1.
    3. Prepare el medio dmem/de la matriz de la membrana del sótano que contiene la matriz de la membrana del sótano del 2.5%, el 10% FBS, y la pluma/estreptococo del 1% en medio básico del paso 1.1.1.
  2. Preparación de placas para la formación de esferoides
    1. Medio de matriz basal y dmem/membrana basal caliente a temperatura ambiente (RT) durante aproximadamente 20 min.
    2. Pretrate los pozos de una placa de 24 pozos dedicada a la formación de esferoides mediante la adición de 500μL de solución de enjuague antia adherencia a cada pozo.
      NOTA: En estas placas, cada pozo consta de 1.200 micropcillos.
    3. Centrifugar la placa a 1.200 × g durante 5 min en un rotor de cubo oscilante con adaptadores para placas.
      NOTA: Si sólo se utiliza una placa, prepare una placa estándar adicional llena de agua para contrarrestar el peso.
    4. Enjuague cada pozo con 2 mL de medio basal caliente y aspire el medio de los pozos.
    5. Observe la placa bajo el microscopio para asegurarse de que las burbujas se han eliminado por completo de los micropcillos. Si las burbujas permanecen atrapadas, centrífuga de nuevo a 1.200 × g durante 5 min para eliminar las burbujas.
    6. Repetir los pasos de enjuague 1.2.4-1.2.5.
    7. Agregue 1 mL de dmem caliente /medio de matriz de membrana basal a cada pozo.
  3. Generación de esferoides
    1. Cultivar las células de Caco2 en una monocapa 2D en medio DMEM complementado con 10% de FBS y 1% de Pen/Strep a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 (en lo sucesivo, 37 °C/5% deCO2).
      Nota : el número máximo de pasajes de celda que se utilizará es 80.
    2. Cuando se alcance el 80% de la confluencia, lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (5 mL para un plato de 10 cm), añadir el ácido tetraacético tripsina-etilendiamina (EDTA) (2 mL para un plato de 10 cm) e incubar durante 2-5 min a 37 °C/5% de CO2.
    3. Compruebe el desprendimiento de células bajo el microscopio y neutralice la tripsina agregando 4 mL de dmem medio completo por plato de 10 cm.
    4. Cuente las células usando un hemocytometer para determinar el número total de células.
    5. Centrifugar la suspensión celular a 1.200 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en un volumen apropiado de DMEM /medio de matriz de membrana basal.
    6. Consulte la Tabla 1 para determinar el número de células necesarias por pozo para lograr el número deseado de células por micropcillo. Alternativamente, calcule el número de celdas utilizando la siguiente fórmula para una placa de 24 pozos, considerando que cada pozo contiene 1,200 micropcillos
      Número requerido de células por pozo = Número deseado de células por micropcillo × 1.200
    7. Agregue el volumen requerido de la suspensión celular a cada pozo para lograr el número de celda deseado en un volumen final de 1 mL.
    8. Añadir 1 mL de DMEM/medio de matriz de membrana basal a cada pozo para alcanzar el volumen final de 2 mL por pozo (véase también el paso 1.2.7).
      NOTA: Tenga cuidado de no introducir burbujas en los micropcillos.
    9. Centrifugar la placa inmediatamente a 1.200 × g durante 5 min para capturar las células en los micropocillos. Si es necesario, contrapese la centrifugadora con una placa estándar llena de agua.
    10. Observe la placa bajo el microscopio para verificar que las células estén distribuidas uniformemente entre los micropcillos.
    11. Incubar la placa a 37 °C/5% de CO2 durante 48 h sin perturbar la placa.
      NOTA: De acuerdo con el protocolo original21,aunque muchas líneas celulares pueden formar esferoides dentro de las 24 h, algunas requieren un tiempo de incubación más largo. En este protocolo, 48 h son suficientes para la formación de esferoides.
  4. Cosecha de los esferoides de los micropocillos
    1. Caliente el medio basal y dmem/matriz de membrana basal /sótano en RT durante aproximadamente 20 min.
    2. Usando una pipeta serológica, retire la mitad del medio de cultivo (1 mL) de cada pozo.
    3. Agregue el medio de nuevo a la superficie del pozo para desalojar los esferoides de los micropocillos.
      NOTA: No toque ni triturar los esferoides.
    4. Coloque un colador reversible de 37 μm (o un colador estándar de 40 μm) en la parte superior de un tubo cónico de 15 mL para recoger los esferoides.
      NOTA: Si utiliza un colador estándar de 40 μm, colómelo boca abajo.
    5. Aspirar suavemente los esferoides desalojados (desde el paso 1.4.3), y pasar la suspensión esferoide a través del colador.
      Nota: Los esferoides permanecerán en el filtro; las células individuales fluirán a través del medio.
    6. Usando una pipeta serológica, dispense 1 mL del medio basal caliente a través de toda la superficie del pozo para desalojar cualquier esferoide restante y recuperarlos en el colador.
    7. Repetir este paso de lavado 1.4.6 dos veces.
    8. Observe la placa bajo el microscopio para asegurarse de que todos los esferoides se han eliminado de los micropocillos. Repetir el lavado si es necesario (pasos 1.4.6-1.4.7).
    9. Invierta el colador y colóquelo en un nuevo tubo cónico de 15 mL. Recoja los esferoides lavando el colador con dmem/medio de matriz de membrana basal.
      NOTA: Los esferoides recogidos están listos para aplicaciones y análisis aguas abajo.
  5. Cultivo a largo plazo de esferoides
    1. Preparar solución de agarosa al 1,5% en medio basal, y esterilizarla por autoclave (ciclo estándar).
    2. Mientras que la solución de agarosa esté caliente y todavía líquida, cubra los pozos de platos o platos de cultivo estándar, como se describe en la Tabla 2.
      NOTA: Calentar el plato/plato en el horno facilitará el paso de recubrimiento. Los platos/platos recubiertos se pueden dejar en RT durante un hasta 10 días en un ambiente estéril y protegidos de la luz.
    3. Sembrar los esferoides cosechados (a partir del paso 1.4.9) en las placas recubiertas de agarosa, y añadir dmem/soporte de matriz de membrana basal para lograr el volumen final dependiendo del tamaño de la placa.
      NOTA: Para evitar agregados esferoides, sembrarlos a la densidad óptima de 22 esferoides/cm2. Observe que el recubrimiento no es perfectamente plano, y se eleva hacia el borde, creando una concavidad ligera en el centro de la placa. Si el número de esferoides es demasiado alto, es más probable que se adhieran entre sí.
    4. Incubar la placa a 37 °C/5% deCO2 hasta la recuperación de los esferoides para análisisespecíficos.
  6. Tratamiento de esferoides con fármacos quimioterapéuticos
    1. Platee los esferoides a partir del paso 1.5.4, y cultive durante 2 días. A partir del día 3 (D3), trátelos con FOLFIRI (5-Fluorouracilo, 50 μg/mL; Irinotecán, 100 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) o con FOLFOX (5-Fluorouracilo, 50 μg/mL; Oxaliplatino, 10 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) combinaciones de regímenes quimioterapéuticos utilizados rutinariamente para tratar a los pacientes con CCR22,23,24,25,o mantenerlos en condiciones (control) no tratadas (NT).
    2. Recoja los esferoides después de 3 días de tratamiento utilizando una pipeta con la punta cortada (punta de 1.000 μL), asegurándose de que cada condición esté representada por al menos tres réplicas. Centrifugarlos a 1.000 × g durante 3 min, y luego retire el sobrenadante.
    3. Fijar los pellets en paraformadehído al 2% (AP) para el análisis histológico (ver sección 3), o utilizar los pellets para la extracción de ARN (ver sección 4).
    4. Para analizar la muerte celular, incubar los esferoides a partir de la etapa 1.6.1 en placas de pozos de cultivo negro en dmem/medio de matriz de membrana basal durante 30 min con una tinción de ácido nucleico (dilución 1:5000) que no permea las células vivas, sino que penetra en las membranas comprometidas de las células muertas26. Mida la acumulación de fluorescencia con un lector de microplacas.

2. Monitoreo del crecimiento de esferoides

  1. Utilizando un microscopio invertido, adquirir imágenes representativas de esferoides mantenidos bajo diferentes condiciones a lo largo de los días en cultivo.
  2. Analice las imágenes midiendo tres diámetros representativos diferentes de cada esferoide utilizando el software apropiado.
  3. Utilice la siguiente fórmula para obtener el volumen estimado de la esfera.
    figure-protocol-1

    Nota: Los términos, d1, d2 y d3, son los tres diámetros del esferoide.

3. Inmunofluorescencia (FI) y tinción histológica

  1. Fijación e incrustación de parafina
    1. Recoja los esferoides en los puntos de tiempo seleccionados usando una pipeta con la punta cortada como se describe en el paso 1.6.2, y fijarlos durante 30 minutos en RT en 2% PFA.
      NOTA: Alternativamente, almacene las muestras en este paso a 4 °C hasta su uso posterior.
    2. Para la incrustación de parafina, lave los esferoides 3x con PBS 1x y resuspón en etanol al 70%. Después de la inclusión de parafina y seccionamiento, realizar hematoxilina & eosina (H &E) tinción para el análisis histológico.
  2. Inmunoetiquetado de secciones de parafina
    NOTA: Utilice secciones de 5 μm de espesor para la inmunotensación indirecta.
    1. Incubar portaobjetos a 60 °C durante 2 h para fundir la cera y mejorar la desparafinación.
    2. Lave las guías dos veces durante 3 min en metilciclohexano.
    3. Lave los portaobjetos durante 3 min en 1:1 metilciclohexano: 100% etanol.
    4. Lave los portaobjetos dos veces durante 3 min en etanol al 100%.
      NOTA: Realice todas las manipulaciones para los pasos 3.2.2 a 3.2.4 en una campana química.
    5. Lave los portaobjetos durante 3 min en etanol al 90%.
    6. Lave los portaobjetos durante 3 min en etanol al 75%.
    7. Lavar los portaobjetos durante 3 min en etanol al 50%.
    8. Lave los portaobjetos bajo el agua del grifo.
    9. Rehidratar los portaobjetos en agua destilada durante 5 min.
    10. Preparar 700 mL de tampón de citrato de 0,01 M, pH 6,0, y añadirlo a un recipiente adecuado (ancho: 11,5 cm, largo: 17 cm, altura: 7 cm); sumergir las diapositivas en él. Calentar el recipiente en el microondas durante 9-10 min a 700 W, y cuando comience la ebullición, disminuir la potencia a 400-450 W. Incubar durante 10 min adicionales.
    11. Deje que las diapositivas se enfríen en el búfer a RT durante aproximadamente 30-40 min.
    12. Lave las guías dos veces en PBS durante 5 min.
    13. Dibuje un círculo alrededor de las secciones con un rotulador para crear una barrera para los líquidos aplicados a las secciones.
    14. Incubar cada sección con 50 μL de tampón bloqueador (10% de suero de cabra normal, 1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,02% de Tritón X-100 en PBS) durante al menos 30 min a rt.
    15. Retire el tampón de bloqueo y agregue 50 μL de anticuerpos primarios diluido en el tampón de incubación (1% de suero de cabra normal, 0,1% de BSA y 0,02% de Tritón X-100 en PBS). Incubar durante 2 h a rt o durante la noche a 4 °C.
    16. Retire los anticuerpos primarios y lave los portaobjetos 3 veces en PBS durante 5 min.
    17. Incubar los portaobjetos con 50 μL de anticuerpos secundarios fluorescentes diluido en el tampón de incubación durante 1 h a RT.
    18. Retire los anticuerpos secundarios y lave los portaobjetos 3x en PBS durante 5 min.
    19. Agregue 50 μL de medio de montaje con 4′,6-diamidino-2-fenilindol a cada sección, y coloque una cubierta de vidrio sobre la sección.

4. Extracción de ARN, reacción en cadena de la transcripción-polimerasa inversa (RT-PCR) y RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)

  1. Recoger esferoides en diferentes puntos de tiempo, cada punto representado por al menos tres réplicas. Centrifugarlos a 1.000 × g durante 3 min, y luego retire el sobrenadante.
    NOTA: Los pellets pueden utilizarse directamente para la extracción de ARN o almacenarse a -20 °C hasta su posterior uso.
  2. Aísle el ARN total usando un kit comercial de aislamiento de ARN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Transcriba inversamente 500 ng de cada muestra de ARN en ADN complementario (ADNc) con un kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Después de la transcripción inversa, realizar un análisis de PCR en 1 μL de ADNc para amplificar un gen de limpieza con cebadores ubicados en diferentes exones.
    NOTA: Este paso permite la verificación de la ausencia de cualquier contaminación genómica de ADN en las preparaciones de ARN. Para este protocolo, las cartillas de la isomerasa B del peptidylprolyl(PPIB) fueron utilizadas.
  5. Realizar la amplificación de qPCR en 4 μL de ADNc previamente diluido (1:10 en agua doble destilada libre de RNAse) mediante el uso de cebadores específicos para los genes de interés. En cada muestra, cuantifique la expresión específica de ARNm utilizando el método ΔΔCt y los valores normalizados contra los niveles de un gen de limpieza.
    NOTA: Para este protocolo, se seleccionó β-actina(ACTB). Los cebadores utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla 3.

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Resultados

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Dado que la falta de homogeneidad en el tamaño de los esferoides es uno de los principales inconvenientes de los sistemas de cultivo de esferoides 3D actualmente disponibles13,el objetivo de este trabajo fue establecer un protocolo fiable y reproducible para obtener esferoides homogéneos. En primer lugar, para establecer las condiciones de trabajo ideales, se probaron diferentes números de células Caco2, que oscilaban entre 50 y 2.000 células por micropocillo/esfer...

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Discusión

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Los modelos 3D in vitro superan los principales inconvenientes experimentales de los cultivos celulares de cáncer 2D, ya que parecen ser más confiables para recapitular las características tumorales típicas, incluido el microambiente y la heterogeneidad celular. Los modelos 3D de esferoides comúnmente utilizados son libres de andamios (cultivados en condiciones de baja unión) o basados en andamios (utilizando biomateriales para cultivar células). Estos métodos presentan diferentes desventajas ya que dependen de la natura...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconocemos las plataformas de la histología de la proyección de imagen y del recherche del anípata (CRCL, CLB). Estamos en deuda con la farmacia del Hospital Centre Léon Bérard (CLB) por el amable regalo de FOLFOX y FOLFIRI. También agradecemos a Brigitte Manship por la lectura crítica del manuscrito. El trabajo fue apoyado por el FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) y por el Inca (PLBIO19-289). MVG y LC recibieron apoyo del FRM y CF recibieron apoyo de la fundación ARC y del Centre Léon Bérard.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
37 y micro; m Colador reversible, grande STEMCELL Technologies27250Para usar con tubos cónicos de 50 mL
5-FluorouraciloRegalo de la Farmacia del Centro Leon Berard (CLB)-solución madre, 5 mg/100 mL; concentración final, 50 µ g/mL
de Agarosa SigmaA9539
Aggrewell 400 Placas de 24 pocillosSTEMCELL Technologies344111.200 micropocillos por pocillo para la formación y crecimiento de esferoides
Anti Caspasa3 - Señalizaciónde células9661dilución 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RataeBioscience/Thermo Fisher14-9896-82dilución 1:500
Solución de enjuague antiadherente x 100 mLSTEMCELL Technologies07010
Anti-CD133 (13A4) - RataInvitrogen14-133-82dilución 1:100
Anti-CD44 -ConejoAbcamab157107dilución 1:2000
Anti-PCNA - RatónDakoM0879dilución 1:1000
Anti-β-catenina - RatónSanta Cruz Biotechnologysc-7963dilución 1:50
Negro placas multipocilloThermo Fisher Scientific237108
Ácido cítrico monohidratoSigmaC1909
CLARIOstar aparato Lector de microplacasBMG Labtech
Marcador Dakorotulador para marcar círculos en portaobjetos para crear barreras para líquidos
Anticuerpo secundario Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202dilución 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037dilución 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206dilución 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042dilución 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanil-L-glutamina dipéptido)Gibco10569010
Suero fetal bovino (FBS)Gibco16000044
Medio de montaje de fluorogel con DAPIInterchimFP-DT094B
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-rata para cabras, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077dilución 1:1000
Software ImageJAnálisis de imágenes esferoides
Irinotecan& nbsp;Regalo de la farmaciaCLB-solucióncalurosa, 20 mg/mL; concentración final, 100 y micro; g/mL
transcriptasa inversa de iScript Bio-Rad1708891
LeucovorinaRegalo de la Farmacia CLB-soluciónmadre, 50 mg/mL; concentración final, 25 & g/mL
Matrigel Matriz de membrana basalCorning354234Matriz de membrana basal
Nucleospina ARN XS KitMacherey-Nagel740902 .250
OxaliplatinoRegalo de la farmacia CLB-solución madre, 100 mg/20 mL;concentración final, 10 µ g/mL
de penicilina-estreptomicinaGibco15140130
tampón de fosfato solución salina (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- VerdeThermo Fisher ScientificS7020tinción de ácido nucleico; dilución 1:5000
Tripsina-EDTA (0,05 %)Gibco
25300062 Zeiss-Axiovertmicroscopio invertido para la adquisición de imágenes de esferoides
de conejo de Microscopio

Referencias

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