Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon

Resumen

Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.

Resumen

Los cánceres colorrectales son caracterizados por heterogeneidad y una organización jerárquica que comprende una población de las células madres del cáncer (CSCs) responsables del desarrollo, del mantenimiento, y de la resistencia del tumor a las drogas. Una mejor comprensión de las propiedades de CSC para su orientación específica es, por lo tanto, un requisito previo para la terapia efectiva. Sin embargo, hay una escasez de modelos preclínicos adecuados para investigaciones en profundidad. Aunque las variedades de células bidimensionales ines vitro (2D) del cáncer proporcionen penetraciones valiosas en biología del tumor, no replican la heterogeneidad fenotípica y genética del tumor. Por el contrario, los modelos tridimensionales (3D) abordan y reproducen la complejidad casi fisiológica del cáncer y la heterogeneidad celular. El objetivo de este trabajo fue diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible para estudiar la biología csc. La presente metodología describe el desarrollo y optimización de condiciones para generar esferoides 3D, de tamaño homogéneo, a partir de células de adenocarcinoma de colon Caco2, un modelo que puede ser utilizado para el cultivo a largo plazo. Importantemente, dentro de los esferoides, las células que fueron organizadas alrededor lumen-como las estructuras, fueron caracterizadas por los patrones diferenciados de la proliferación de célula y por la presencia de CSCs que expresaban un panel de marcadores. Estos resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque 3D para estudiar la heterogeneidad celular y la biología csc, incluyendo la respuesta a la quimioterapia.

Introducción

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo la segunda causa principal de muertes asociadas al cáncer en el mundo¹. El desarrollo de la CCR es el resultado de una progresiva adquisición y acumulación de mutaciones genéticas y/o alteraciones epigenéticas^2,3,incluyendo la activación de oncogenes e inactivación de genes supresores tumorales^3,4. Además, los factores no genéticos (por ejemplo, el microambiente) pueden contribuir y promover la transformación oncogénica y, por lo tanto, participar en la evolución de los CCR

Protocolo

NOTA: Los detalles de todos los reactivos y materiales se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Formación de esferoides

1. Medios de cultivo esferoide
   1. Prepare el medio básico que consiste en el medio modificado del águila de Dulbecco (DMEM) complementado con el dipéptido de la L-alanil-L-glutamina de 4 milímetros.
   2. Preparar el medio completo DMEM que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Pen/Strep) en medio basal a partir del paso 1.1.1.
   3. Prepare el medio dmem/de la matriz de la membrana del sótano que contiene la matriz de la membrana del sótan....

Resultados

Dado que la falta de homogeneidad en el tamaño de los esferoides es uno de los principales inconvenientes de los sistemas de cultivo de esferoides 3D actualmente disponibles^13,el objetivo de este trabajo fue establecer un protocolo fiable y reproducible para obtener esferoides homogéneos. En primer lugar, para establecer las condiciones de trabajo ideales, se probaron diferentes números de células Caco2, que oscilaban entre 50 y 2.000 células por micropocillo/esfer.......

Discusión

Los modelos 3D in vitro superan los principales inconvenientes experimentales de los cultivos celulares de cáncer 2D, ya que parecen ser más confiables para recapitular las características tumorales típicas, incluido el microambiente y la heterogeneidad celular. Los modelos 3D de esferoides comúnmente utilizados son libres de andamios (cultivados en condiciones de baja unión) o basados en andamios (utilizando biomateriales para cultivar células). Estos métodos presentan diferentes desventajas ya que dependen de la natura.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
37 y micro; m Colador reversible, grande	STEMCELL Technologies	27250	Para usar con tubos cónicos de 50 mL
5-Fluorouracilo	Regalo de la Farmacia del Centro Leon Berard (CLB)	-	solución madre, 5 mg/100 mL; concentración final, 50 µ g/mL
de Agarosa	Sigma	A9539
Aggrewell 400 Placas de 24 pocillos	STEMCELL Technologies	34411	1.200 micropocillos por pocillo para la formación y crecimiento de esferoides
Anti Caspasa3 - Señalización	de células	9661	dilución 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rata	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilución 1:500
Solución de enjuague antiadherente x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Rata	Invitrogen	14-133-82	dilución 1:100
Anti-CD44 -Conejo	Abcam	ab157107	dilución 1:2000
Anti-PCNA - Ratón	Dako	M0879	dilución 1:1000
Anti-β-catenina - Ratón	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilución 1:50
Negro placas multipocillo	Thermo Fisher Scientific	237108
Ácido cítrico monohidrato	Sigma	C1909
CLARIOstar aparato	Lector de microplacas	BMG Labtech
Marcador Dako			rotulador para marcar círculos en portaobjetos para crear barreras para líquidos
Anticuerpo secundario Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilución 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilución 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilución 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilución 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanil-L-glutamina dipéptido)	Gibco	10569010
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	16000044
Medio de montaje de fluorogel con DAPI	Interchim	FP-DT094B
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-rata para cabras, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilución 1:1000
Software ImageJ			Análisis de imágenes esferoides
Irinotecan& nbsp;	Regalo de la farmacia	CLB-solución	calurosa, 20 mg/mL; concentración final, 100 y micro; g/mL
transcriptasa inversa de iScript	Bio-Rad	1708891
Leucovorina	Regalo de la Farmacia CLB-solución		madre, 50 mg/mL; concentración final, 25 & g/mL
Matrigel Matriz de membrana basal	Corning	354234	Matriz de membrana basal
Nucleospina ARN XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatino	Regalo de la farmacia CLB-solución madre		, 100 mg/20 mL;concentración final, 10 µ g/mL
de penicilina-estreptomicina	Gibco	15140130
tampón de fosfato solución salina (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Verde	Thermo Fisher Scientific	S7020	tinción de ácido nucleico; dilución 1:5000
Tripsina-EDTA (0,05 %)	Gibco
		25300062 Zeiss-Axiovert	microscopio invertido para la adquisición de imágenes de esferoides