Determinación rápida de la afinidad anticuerpos-antígenos por fotometría de masas

Resumen

Describimos un enfoque de una sola molécula para las mediciones de afinidad antígeno-anticuerpo utilizando fotometría de masas (MP). El protocolo basado en MP es rápido, preciso, utiliza una cantidad muy pequeña de material y no requiere modificación de proteínas.

Resumen

Las mediciones de la especificidad y afinidad de las interacciones antígeno-anticuerpos son de vital importancia para aplicaciones médicas y de investigación. En este protocolo, describimos la implementación de una nueva técnica de una sola molécula, la fotometría de masas (MP), para este propósito. MP es una técnica libre de etiquetas e inmovilización que detecta y cuantifica las masas moleculares y las poblaciones de anticuerpos y complejos antigen-anticuerpos a nivel de una sola molécula. MP analiza la muestra de antígeno-anticuerpo en cuestión de minutos, permitiendo la determinación precisa de la afinidad de unión y proporcionando simultáneamente información sobre la estequiometría y el estado oligomérico de las proteínas. Esta es una técnica simple y directa que requiere sólo cantidades de picomole de proteína y no consumibles caros. El mismo procedimiento se puede utilizar para estudiar la unión proteína-proteína para proteínas con una masa molecular superior a 50 kDa. Para las interacciones multivalentes de proteínas, las afinidades de múltiples sitios de unión se pueden obtener en una sola medición. Sin embargo, el modo de medición de una sola molécula y la falta de etiquetado imponen algunas limitaciones experimentales. Este método da los mejores resultados cuando se aplica a mediciones de affinidades de interacción submicromolar, antígenos con una masa molecular de 20 kDa o más grandes, y muestras de proteínas relativamente puras. También describimos el procedimiento para realizar los pasos de ajuste y cálculo necesarios utilizando el software básico de análisis de datos.

Introducción

Los anticuerpos se han convertido en herramientas omnipresentes de la biología molecular y se utilizan ampliamente en aplicaciones médicas y de investigación. En medicina, son de vital importancia en el diagnóstico, pero sus aplicaciones terapéuticas también se están expandiendo y constantemente se desarrollan nuevas terapias basadas en anticuerpos^1,2,3,4. Las aplicaciones científicas de los anticuerpos incluyen muchas técnicas de laboratorio indispensables como la inmunofluorescencia^5,la inmunoprecipitación

Protocolo

1. Prepare las cámaras de flujo

1. Limpie los cubreobjetos de vidrio
   1. Usando botellas de lavado con agua destilada, etanol e isopropanol, enjuague los cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en el siguiente orden: agua, etanol, agua, isopropanol, agua. Seque los cubreobjetos con una corriente de nitrógeno limpio. Es importante enjuagar los cubreobjetos de arriba a abajo, sosteniendo la esquina inferior con fórceps de punta suave. Seque el cubreobjetos en la misma dirección para evitar la transferencia de contaminación de los fórceps (Figura 2A).
   2. Del mismo modo, enjuague los cubreobjetos de 24 mm x 24 mm con agua destilada, ....

Resultados

Hemos examinado previamente la interacción del α-trombina humana (HT) y del anticuerpo monoclonal antihumano de ratón (AHT) utilizando el ensayo basado en MP¹¹. Dado que la masa molecular del HT (37 kDa) está por debajo del límite de detección de 40 kDa, la concentración máxima de la muestra puede superar la limitación de concentración de MP de 50 nM sin afectar negativamente a la resolución de distribuciones de masas. El experimento se planeó como una serie de valoración con el anticuerpo AHT a u.......

Discusión

El protocolo basado en fotometría de masas descrito aquí proporciona un método rápido y preciso para medir las afinidades de unión de anticuerpos antigen. El análisis de MP utiliza una cantidad muy pequeña de material, y la información adicional, incluida la estequiometría, la oligomerización y la pureza, se puede evaluar a partir de los mismos datos (Figura 5). Sin modificaciones, este método es aplicable a las mediciones de constantes de disociación en el rango de aproximadamente 5 nM a 50.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AcquireMP	Refeyn		MP software de recopilación de datos
Anti-trombina humana	Tecnologías hematológicas	AHT-5020	RRID:
AB_2864302 Aplicadores con punta de algodón	Thorlabs	CTA10	bastoncillos ópticos de algodón para la limpieza de lentes
cubreobjetos 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
cubreobjetos 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP software de procesamiento de datos
Pinzas	Microscopía Electrónica Sciences	78080-CF	pinza de punta blanda para la manipulación de cubreobjetos
Humano &alfa;-trombina	Haematologic Technologies	HCT-0020
Aceite de inmersión	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Hoja de cálculo	de Microsoft
OneMP	Refeyn		Instrumento de fotometría masiva
Origin	OriginLab		software de gráficos científicos
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Filtro de jeringa	Millipore	SLGSR33SS	tampón y muestra filtrado