El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.
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Artículo de método
Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los avances recientes en espectrometría de masas han dado como resultado un análisis proteómico profundo junto con la generación de conjuntos de datos robustos y reproducibles. Sin embargo, a pesar de los considerables avances técnicos, la preparación de muestras a partir de bioespecímenes como la sangre del paciente, el CSF y el tejido todavía plantea desafíos considerables. Para identificar biomarcadores, la proteómica tisular a menudo proporciona una fuente de muestra atractiva para traducir los hallazgos de la investigación del banco a la clínica. Puede revelar posibles biomarcadores candidatos para el diagnóstico precoz del cáncer y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, etc. La proteómica tisular también produce una gran cantidad de información sistémica basada en la abundancia de proteínas y ayuda a abordar preguntas biológicas interesantes.
El análisis proteómico cuantitativo se puede agrupar en dos grandes categorías: un enfoque basado en etiquetas y un enfoque sin etiquetas. En el enfoque basado en etiquetas, las proteínas o péptidos se etiquetan utilizando isótopos estables como SILAC (etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular) o mediante etiquetas químicas como ICAT (etiquetas de afinidad codificadas por isótopos), TMT (etiqueta de masa en tándem) o iTRAQ (etiqueta isobárica para cuantificación relativa y absoluta). Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas y, utilizando etiquetas isobáricas, se pueden analizar múltiples muestras en un solo experimento. El enfoque sin etiquetas proporciona una alternativa rentable a los enfoques basados en etiquetas. Cientos de muestras de pacientes pertenecientes a una cohorte en particular pueden ser analizadas y comparadas con otras cohortes en función de las características clínicas. Aquí, hemos descrito un flujo de trabajo de proteómica cuantitativa optimizada para muestras de tejido utilizando métodos de perfiles de proteoma sin etiquetas y basados en etiquetas, que es crucial para las aplicaciones en ciencias de la vida, especialmente los proyectos basados en el descubrimiento de biomarcadores.
Introducción
Las tecnologías proteómicas tienen el potencial de permitir la identificación y cuantificación de posibles marcadores candidatos que pueden ayudar en la detección y pronóstico de la enfermedad1. Los recientes avances en el campo de la espectrometría de masas han acelerado la investigación clínica a nivel de proteínas. Los investigadores están tratando de abordar el desafío de la patobiología complicada de varias enfermedades utilizando proteómica basada en espectrometría de masas, que ahora ofrece una mayor sensibilidad para la identificación y cuantificación de proteínas2. La medición cuantitativa precisa de las proteín....
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Protocolo
Este estudio fue revisado y aprobado por las juntas de revisión institucional y el comité de ética del Instituto Indio de Tecnología de Bombay (IITB-IEC/2016/026). Los pacientes/participantes dieron su consentimiento por escrito para participar en este estudio.
1. Preparación de lisato tisular
NOTA: Realice todos los pasos siguientes en el hielo para mantener las proteasas inactivas. Asegúrese de que los bisturíes y los tubos utilizados sean estériles para evitar cualquier contaminación cruzada.
- Tome ~ 30 mg de tejido en un tubo de batido de cuentas, agregue 200 μL de solución salina ta....
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Resultados
Hemos utilizado dos enfoques diferentes para la proteómica de descubrimiento: enfoques proteómicos sin etiquetas y basados en etiquetas. El perfil proteico de muestras de tejido en SDS-PAGE mostró las proteínas intactas y pudo ser considerado para el análisis proteómico(Figura 2A). La verificación de control de calidad del instrumento se monitoreó a través del software de idoneidad del sistema y mostró la variación diaria en el rendimiento del instrumento(Figura.......
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Discusión
La proteómica tisular de muestras biológicas nos permite explorar nuevos biomarcadores potenciales asociados con diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. También explica el mecanismo de señalización y las vías asociadas con la progresión de la enfermedad. El protocolo descrito para el análisis proteómico cuantitativo de tejidos proporciona buenos datos de cobertura reproducibles. La mayoría de los pasos se han adaptado de las instrucciones del fabricante. Para obtener datos de alta calidad, los siguientes pas.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos el Proyecto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), proyecto #34_IITB a las instalaciones de SS y MASSFIITB en IIT Bombay con el apoyo del Departamento de Biotecnología (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para llevar a cabo todos los experimentos relacionados con la EM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| Acetonitrilo (grado MS) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Albúmina sérica bovina | HiMedia | TC194-25G | |
| Cloruro de calcio | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Ácido fórmico (grado MS) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Yodoacetamida | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (grado MS) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Cloruro de magnesio | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Metanol (grado MS) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Agua de grado MS | Pierce | 51140 | |
| Tampón de fosfato salino | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Cloruro de sodio | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Tripsina (grado MS) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reactivo | Bio-Rad | ||
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 columna | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipetas | Gilson | F167380 | |
| Puntas de etapa | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Perlas de sílice | BioSpec productos | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead batidor (Homogeneizador) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A Lector | |
| microplacas (espectrofotómetro) | Thermo | MultiSkan Go | |
| Medidor de pH | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Sonicator Sonics | Materials, Inc | VCX 130 | |
| Baño seco de agitación | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Espectrómetro de masas de fusión | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Concentrador de vacío | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Descubridor de Proteoma 2.2.0.388 |
Referencias
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A.
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Reimpresiones y permisos
