Identificación de inhibidores de EGFR y RAS mediante Caenorhabditis elegans

Resumen

El nematodo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans se puede utilizar como un modelo simple y económico para el descubrimiento de fármacos. Aquí se describe un protocolo para identificar terapias contra el cáncer que inhiben la señalización aguas abajo de las proteínas RAS y EGFR.

Resumen

Los cambios en la localización de la membrana plasmática del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y su efector aguas abajo RAS se han implicado en varias enfermedades, incluido el cáncer. El nematodo de vida libre C. elegans posee una cascada de señales EGFR-RAS-ERK MAP evolutiva y funcionalmente conservada que es central para el desarrollo de la vulva. Las mutaciones de ganancia de función en el homólogo RAS LET-60 y el homólogo EGFR LET-23 inducen la generación de pseudovulva ectópica no funcional visible a lo largo de la pared del cuerpo ventral de estos gusanos. Anteriormente, se ha demostrado que el fenotipo multivulval (Muv) en estos gusanos es inhibido por pequeñas moléculas químicas. Aquí describimos un protocolo para usar el gusano en un ensayo a base de líquido para identificar inhibidores que abolen las actividades de las proteínas EGFR y RAS. Usando este ensayo, mostramos que la R-fendilina, un inhibidor indirecto de K-RAS, suprime el fenotipo Muv expresado en los gusanos mutantes let-60(n1046) y let-23(sa62). El ensayo es simple, económico, no requiere mucho tiempo de configuración y se puede utilizar como una plataforma inicial para el descubrimiento de terapias contra el cáncer.

Introducción

Las vías celulares que regulan los eventos de desarrollo dentro de los organismos están altamente conservadas entre todos los metazoos. Una de estas vías es la cascada de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno EGFR-RAS-ERK (MAPK), que es una vía crítica que gobierna la proliferación, diferenciación, migración y supervivencia celular^1,2. Los defectos en esta vía de señalización pueden conducir a estados patológicos o de enfermedad como el cáncer. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ha demostrado estar altamente expresado en tumores humanos, incluyendo el 50% de los carcino....

Protocolo

1. Preparación de la placa del medio de crecimiento de nematodos (NGM)

1. Añadir 2,5 g de peptona y 3 g de NaCl a 970 ml de agua desionizada contenida en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética. A partir de entonces, agregue 20 g de agar al matraz. Autoclave el contenido del matraz a 121 °C y una presión de 15 lb/in² durante 30 min. Después de la esterilización, coloque el matraz en una placa de agitación y deje que el medio se enfríe hasta que la temperatura alcance los 50 ° C.
2. Para preparar las placas NGM agregue los siguientes reactivos al medio enfriado: 25 mL de tampón de fosfato de potas....

Resultados

Primero demostramos que la R-fendilina es capaz de suprimir el fenotipo Muv en la cepa mutante let-60(n1046) en comparación con los gusanos tratados con DMSO. Nuestros datos muestran que la R-fendilina es capaz de bloquear el fenotipo Muv en el let-60(n1046) de una manera dependiente de la dosis(Figura 2A,B). Sin embargo, no se observó reversión del fenotipo Muv en la cepa mutante nula lin-1 en respuesta al aumento de las concentraciones de R-fendi.......

Discusión

Los ensayos que describimos utilizando el gusano son simples y económicos para identificar inhibidores de la función EGFR y RAS. C. elegans es un modelo atractivo para el descubrimiento de fármacos porque es fácil de cultivar en el laboratorio debido al corto ciclo de vida (3 días a 20 °C) y la capacidad de generar un gran número de larvas. Más importante aún, la vía EGFR-RAS-ERK MAPK se conserva evolutiva y funcionalmente con mamíferos que proporcionan un sistema genéticamente tratable para analizar los efectos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios y productos químicos
Agarosa	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptona	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Caldo	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Cloruro de calcio	Fisher Scientific	BP510-500
Colesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Sulfato de magnesio	Fisher Scientific	BP213-1
Nistatina	Acros orgánicos
Fosfato de potasio Dibásico	Fisher Scientific	BP363-500
PFosfato de potasio Monobásico	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendilina			sintetizado comercialmente (grado farmacéutico)
Azida de sodio	Millipore Sigma	S2002-25G
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	BP358-1
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	SS266-1
Hipoclorito de sodio al 8,25%			Lejía
Fosfato de Sodio Dibásico	Fisher Scientific	BP332-500
Sulfato de estreptomicina	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Clorhidrato de tetramisol	Millipore Sigma	L9756
UO126 (inhibidor de MEK)	Millipore Sigma	19-147
Tubos de
15 mL	Fisher Scientific	12-565-269
Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 50 ml	Fisher Scientific	12-565-271
Pipetas serológicas de poliestireno desechables 10 ml	Fisher Scientific	07-200-574
Pipetas serológicas de poliestireno desechables 25 ml	Fisher Scientific	07-200-575
n.º 1,5 x 18 mm Cubreobjetos	Fisher Scientific	12-541A
con tapa transparente (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
con tapa transparente (100 x 15 mm)	Portaobjetos
(75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Placas de cultivo de tejidos de pocillos	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
PrismPrisma	Graphpad
Cepas bacterianas
E. coli OP50
Cepas de gusano
Cepa	<>fuerte>Genotipo< fuerte>	Transgén	Fuente
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC

AC455500050 centrífuga de polipropileno estéril cónico de < / fuerte> Placa de Petri Placas de Petri de microscopio de vidrio liso Fisher Scientific FB0875712