Describimos un método modificado basado en agar diseñado para cuantificar los efectos antifúngicos de los productos derivados de plantas. Las contribuciones volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica se pueden evaluar a través de este protocolo. Además, la eficacia contra hongos se puede medir en etapas clave del desarrollo en una sola configuración experimental.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Medición de la actividad antifúngica volátil y no volátil de los productos biocontrol
En este artículo
Resumen
Resumen
El protocolo descrito se basa en una técnica de transferencia plug-transfer que permite la determinación precisa de las cantidades de microorganismos y sus etapas de desarrollo. Un número especificado de esporas se extienden en una placa de agar. Esta placa de agar se incuba durante un período definido para permitir que los hongos lleguen a la etapa de desarrollo esperada, excepto para las esporas donde no se requiere incubación. Los tapones de agar cubiertos por esporas, hifas o micelio se retiran y transfieren a continuación a los medios de agar que contienen el compuesto antifúngico para ser probados a distancia de los hongos o en contacto. Este método es aplicable para probar extractos líquidos y muestras sólidas (polvos). Es particularmente adecuado para cuantificar las contribuciones relativas de los agentes volátiles y no volátiles en las mezclas bioactivas y para determinar sus efectos, específicamente en esporas, hifas tempranas y micelio.
El método es altamente relevante para la caracterización de la actividad antifúngica de los productos de biocontrol, en particular los productos derivados de plantas. De hecho, para el tratamiento de plantas, los resultados se pueden utilizar para guiar la elección del modo de aplicación y para establecer los umbrales de activación.
Introducción
Las pérdidas globales de frutas y verduras pueden alcanzar hasta el 50% de la producción1 y resultar principalmente de la descomposición de los alimentos causada por el deterioro de hongos en el campo o durante el almacenamiento posterior a la cosecha2,3,a pesar del amplio empleo de fungicidas sintéticos desde mediados del siglo XX4. El uso de estas sustancias se está reconsiderando, ya que representa graves riesgos ambientales y para la salud. A medida que las consecuencias dañinas de su uso están apareciendo en todos los ecosistemas y la evidencia de posibles i....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de Inocula
- Antes del experimento, poner 5 μL de Trichoderma spp. Esporas SBT10-2018 almacenadas a 4 °C en medio agar dextrosa de patata (PDA) e incubar durante 4 días a 30 °C con exposición a la luz regular para promover la formación de conidia42 (Figura 1,panel A).
NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 ha sido aislado de la madera y se utiliza como modelo en este estudio por su rápido crecimiento y facilidad de recuperación de esporas. Esta cepa es preservada por nuestro laboratorio. - Recuperar conidia (Figura 1, panel A)
- Pone....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para evaluar la capacidad del método cuantitativo para discriminar el modo de acción de diferentes tipos de compuestos antifúngicos, comparamos la eficacia de tres agentes antifúngicos conocidos. Carbendazim es un fungicida sintético no volátil que ha sido ampliamente utilizado para controlar una amplia gama de enfermedades fúngicas en las plantas39,40. El aceite esencial Thymus vulgaris ha sido descrito en gran medida por su actividad antibacteriana y a.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El enfoque presentado aquí permite la evaluación de las propiedades antifúngicas de los productos derivados de plantas mínimamente procesados. En este protocolo, la distribución homogénea de esporas en la superficie del agar se logra utilizando cuentas de vidrio de 2 mm. Este paso requiere habilidades de manejo para distribuir correctamente las cuentas y obtener resultados reproducibles, permitiendo en última instancia la comparación de efectos antifúngicos en diferentes etapas de crecimiento fúngico. Encontramos que las.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a Frank Yates por su precioso consejo. Este trabajo fue apoyado por Sup'Biotech.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Agua | |||
| Tubos Eppendorf | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Tubos Falcons | Sarstedt | 547254 50 mL | |
| Tubo de acero inoxidable de cinco milímetros de diámetro | tienda | / | |
| Deshidratador de alimentos | Sancusto | seis bandejas | |
| Ajo en polvo | Tienda | ||
| Abalorios de vidrio | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Célula de recuento de hemocitómetros | Jeulin | 713442 | / |
| Incubadora | Memmert | UM400 | 30 ° C |
| Molino de cuchillas | Bosch | TSM6A013B | |
| Contador de células manual | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Regla de medición | Tienda | ||
| Cabinas de seguridad microbiológica | FASTER | FASTER FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipeta | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µ |
| L Micropipeta | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µ |
| L Micropipeta | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µ L Placa |
| Petri | Sarstedt | 82-1194500 | Placa de Petri de 55 mm |
| Sarstedt | 82-1473 |  90 mm | |
| Controladores de pipetas-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Agar patata dextrosa | Sigma | 70139-500G | |
| Báscula de precisión-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220. R2-ML 220 g / 0.1 mg y nbsp; |
| Rastrillo | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Microscopio inverso AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Pipeta graduada estéril | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Aceite esencial de timo | Drugstore | Aceite esencial 100% | |
| Tips 1000 µ L | Sarstedt | 70.762010 | |
| Puntas 20 µ L | Sarstedt | 70.760012 | |
| Puntas 200 µ L | Sarstedt | 70.760002 | |
| Palillo de dientes | tienda | ||
| Trichoderma spp cepa | de laboratorio LRPIA | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L Pinzas | |
| Labbox | FORS-001-002 | / |
Referencias
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. Intern....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
